專利名稱：一種誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鼠肺鱗癌模型的致癌領(lǐng)域，更具體涉及一種誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，主要應(yīng)用于大鼠肺鱗癌模型的制作，適用于抗肺癌新藥的篩選、療效檢測(cè)、藥理及毒副作用等方面的研究，同時(shí)還涉及致癌質(zhì)混懸液的制備方法。
背景技術(shù)：
肺癌是嚴(yán)重危害人類生命的常見惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率及死亡率均呈上升趨勢(shì)，盡管過去數(shù)十年里對(duì)肺癌的研究取得了很大進(jìn)展，但診斷和治療的手段仍十分有限。其主要原因之一是對(duì)人類肺癌的許多問題，不可能直接在病人身上進(jìn)行研究，因此必須建立合適的動(dòng)物模型作為研究對(duì)象，而成功建立動(dòng)物肺癌模型的首要條件就是要找到能高效、特異誘發(fā)肺癌模型的合適致癌物質(zhì)。
在制作肺癌模型的科學(xué)研究中，許多學(xué)者探索了多種不同的致癌物質(zhì)，包括將致癌物與不同的促癌劑進(jìn)行搭配、選擇不同類別的致癌物、選擇不同的溶劑等等。Konishi等在大白鼠飲水中加入亞硝胺類藥物，雖能成功誘發(fā)肺腫瘤，包括肺癌和肺的良性腫瘤，但因?yàn)樗幬锓植加谌?，往往除肺癌外尚可誘發(fā)其它器官的腫瘤，如肝、甲狀腺、腎、子宮、膀胱、胰腺等的腫瘤。Schreiber等將NMU(N-nitroso-N-Methylurea)溶于10％的乙醇中，配成1％的致癌質(zhì)溶液，給金地鼠作支氣管內(nèi)沖洗，其誘癌率達(dá)100％，但沖洗的次數(shù)達(dá)30次，試驗(yàn)操作繁瑣，且惡性腫瘤僅占75％。Saffiotti等用B(a)P和Fe2O3的水溶液灌注金地鼠氣管，能誘發(fā)包括喉頭、氣管及肺的良性和惡性腫瘤，但灌注的次數(shù)仍達(dá)15次。申請(qǐng)人曾用甲基膽蒽(MCA)配制成水懸液，大白鼠支氣管內(nèi)灌注5次，成功建立大白鼠肺癌模型，誘癌率為93.75％，且均為肺的鱗狀細(xì)胞癌。但MCA水懸液存在以下缺點(diǎn)①氣管內(nèi)灌注MCA水懸液，大白鼠容易將藥物排出，其一易污染試驗(yàn)環(huán)境，其二由于藥物易被排出，因而要求灌注次數(shù)多，而且藥物易分布于全肺或數(shù)個(gè)肺葉，造成肺部的病變廣泛，對(duì)動(dòng)物正常呼吸影響較大；②MCA水懸液需將藥物用乳缽研磨和經(jīng)超聲波發(fā)生器震蕩，使其顆粒小于3μ以下，不僅制備藥物麻煩，且不可能將全部藥物粉碎至3μ以下，因而影響致癌質(zhì)的作用；③水懸液易被微生物污染，加之灌注次數(shù)多，易導(dǎo)致肺內(nèi)感染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，配方合理，制作簡(jiǎn)便，無污染，成功誘發(fā)肺癌時(shí)間短，誘癌率高。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種制備誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液的方法，易于操作，既能保證致癌質(zhì)充分溶解，又確保溶劑中所含的碘不會(huì)由于加溫而析出，損傷模型動(dòng)物的呼吸道粘膜。
為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施將甲基膽蒽(MCA)濃度為60-100mg/ml和二乙基亞硝胺(DEN)濃度為80-100mg/ml溶于罌粟子之碘化脂酸乙脂(Lipiodol)10毫升，配成致癌質(zhì)碘油混懸液，其步驟是A、稱取甲基膽蒽及二乙基亞硝胺；B、將甲基膽蒽及二乙基亞硝胺混合均勻后加入罌粟子之碘化脂酸乙脂中，攪拌均勻；C、將步驟B的混合物置于70～75℃溫箱中溶解11～13小時(shí)，取出備用。
按每只體重200克大鼠0.1毫升致癌質(zhì)碘油混懸液的劑量，進(jìn)行一次性大鼠支氣管內(nèi)灌注給藥，即可成功誘發(fā)肺癌，最短成癌時(shí)間僅20天，誘癌率達(dá)80％。根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察，該致癌質(zhì)混懸液在支氣管局部滯留時(shí)間長，且灌注藥物不易排出，因而具有誘癌效率高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)配制方法簡(jiǎn)便，且易于X線拍片觀察藥物灌注部位以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。而且該混合液中MCA和DEN的濃度適宜，既可高效誘發(fā)肺癌，而且成癌過程可被藥物阻滯，非常適合于抗肺癌藥物的篩選和鑒定。因此申請(qǐng)人認(rèn)為該致癌質(zhì)混合溶液可作為建立肺癌模型的一種理想的誘癌物質(zhì)。
利用本發(fā)明的致癌質(zhì)碘油混懸液所誘發(fā)的肺癌均為肺鱗癌，多數(shù)為高分化，用常規(guī)病理切片技術(shù)可觀察到肺鱗癌形成的全過程，包括細(xì)支氣管上皮增生、鱗狀上皮化生、不典型增生等癌前病變，原位鱗癌，早期浸潤鱗癌，晚期浸潤鱗癌及癌的擴(kuò)散(胸膜種植、肺門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腎轉(zhuǎn)移)等，可用于肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的基礎(chǔ)性研究、治療肺癌新藥物的實(shí)驗(yàn)研究和肺癌新治療方法的探索研究，能滿足在肺癌基礎(chǔ)和臨床研究中對(duì)肺癌模型動(dòng)物的大量需求，尤其是在抗癌藥物的研制方面有重大意義。
動(dòng)物模型是抗癌藥物篩選及藥效學(xué)試驗(yàn)的不可缺少的重要環(huán)節(jié)。由于生物試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必須符合“隨機(jī)、重復(fù)、對(duì)照”的原則，因而每組動(dòng)物數(shù)及實(shí)驗(yàn)次數(shù)均有一定的要求，不能僅憑一次實(shí)驗(yàn)或少數(shù)幾只動(dòng)物的結(jié)果就斷定某種藥物有效、無效及療效好壞，因此新藥的藥理學(xué)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)需要大量的患肺癌的大鼠。而且在藥物實(shí)驗(yàn)中，除試驗(yàn)藥物組外還要設(shè)立對(duì)照組，包括陽性對(duì)照組、陰性對(duì)照組；藥物的濃度與劑量、給藥途徑、給藥的次數(shù)不同，會(huì)得到不同的藥效，因而在藥物實(shí)驗(yàn)中，需要設(shè)立多組試驗(yàn)動(dòng)物(十幾組至幾十組，甚至幾百組)，而且各組例數(shù)應(yīng)基本相同，數(shù)量不可過少(每組10只以上)，因此一次藥物實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物數(shù)量是極大的。例如依據(jù)抗癌藥物劑量的不同分為高、中、低劑量組，每組中又根據(jù)每天給藥次數(shù)分為一次給藥組、兩次給藥組、三次給藥組，每組中又根據(jù)療程長短可分為短期療程(1個(gè)月)、中期療程(2個(gè)月)、長期療程(3個(gè)月)，這樣總共需要3×3×3，即27組共270只患肺癌的大鼠。這僅僅是一種藥物的一次初步藥效實(shí)驗(yàn)的粗略計(jì)算，國內(nèi)外眾多科研院所的研究人員開發(fā)新抗癌藥物的熱情不斷高漲，正在進(jìn)行或?qū)⒁M(jìn)行對(duì)各種各樣新的、具有抗肺癌作用的中西藥物的大量實(shí)驗(yàn)和探索，每一次的探索都需要用患肺癌的大鼠進(jìn)行經(jīng)過多次的、反復(fù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，由此可見患肺癌大鼠的市場(chǎng)需求量之大。
只要按照申請(qǐng)人所設(shè)計(jì)的致癌質(zhì)碘油混懸液配方來操作，就能在短時(shí)間內(nèi)、高效率地制作出大量的大鼠肺鱗癌模型，來滿足這種制藥工業(yè)上的需求。目前有許多研究單位如武漢大學(xué)生命科學(xué)研究中心孫慧、齊義鵬教授，天津大學(xué)曹喜才教授等與申請(qǐng)人聯(lián)系，希望能在新抗癌藥的療效檢測(cè)方面給予技術(shù)支持，這也充分說明了申請(qǐng)人設(shè)計(jì)的致癌質(zhì)碘油混懸液具有很好的科研效果和廣泛的應(yīng)用前景。
利用本發(fā)明的致癌質(zhì)碘油混懸液，能特異性地誘發(fā)肺鱗癌，誘癌率高，且全部為肺內(nèi)鱗癌，不引起肺外腫瘤，系首創(chuàng)的新配方。與現(xiàn)有致癌質(zhì)混合液相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明中的致癌質(zhì)碘油混懸液，是應(yīng)用罌粟子之碘化脂酸乙脂作溶劑，溶解度高，致癌質(zhì)溶解效果優(yōu)于普通碘油，更優(yōu)于水，溶解的致癌質(zhì)停留在局部，易通過支氣管粘膜上皮細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)促使癌變；(2)本發(fā)明中的致癌質(zhì)碘油混懸液，在肺內(nèi)不易排出，存留時(shí)間長，只用一次灌注即可成功誘癌，操作簡(jiǎn)便，同時(shí)也不污染環(huán)境；(3)本發(fā)明中的致癌質(zhì)碘油混懸液以罌粟子之碘化脂酸乙脂作為溶劑，該物質(zhì)本身具有脂溶劑及造影劑的雙重作用，可供X線觀察藥物局部停留情況以及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程；另外，罌粟子之碘化脂酸內(nèi)微生物不易生長，可降低動(dòng)物肺部感染。
(4)本發(fā)明中的致癌質(zhì)碘油混懸液中MCA和DEN的濃度適宜，既可高效誘發(fā)肺癌，而且成癌過程可被藥物阻滯，非常適合于抗肺癌藥物的篩選和鑒定。


圖1為灌注致癌質(zhì)混懸液后拍攝X光片，箭頭所示為灌注在肺內(nèi)的致癌質(zhì)混懸液圖2為灌注本發(fā)明致癌質(zhì)混懸液后成功建立的肺癌模型大鼠，圖中箭頭所示為誘發(fā)的肺癌組織，新生組織呈不規(guī)則結(jié)節(jié)狀。
其中2A為肺癌模型大鼠大體觀；2B為肺癌模型大鼠肺臟局部放大。
圖3為肺癌模型大鼠肺臟HE染色鏡下觀，圖中所示大小不一的癌細(xì)胞團(tuán)為誘發(fā)的肺癌組織，可見紅染角化珠，癌細(xì)胞核異型性明顯。
圖4為PCNA免疫組織化學(xué)染色圖片(放大倍數(shù)為400倍)，圖中原位癌基底部癌細(xì)胞核內(nèi)PCNA表達(dá)強(qiáng)陽性，呈棕色。
圖5為PCNA免疫組織化學(xué)染色圖片(放大倍數(shù)為400倍)，圖中肺癌癌巢周邊部位癌細(xì)胞核內(nèi)PCNA表達(dá)強(qiáng)陽性，呈棕色。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明藥物實(shí)施例用量如下 一種誘發(fā)大鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其制造步驟是1.準(zhǔn)確稱取甲基膽蒽及二乙基亞硝胺；2.將甲基膽蒽及二乙基亞硝胺加入罌粟子之碘化脂酸乙脂中，并攪拌得到混合物；3.將混合物置于70或71或72或73或74或75℃溫箱中溶解11～13小時(shí)，取出后備用。
試驗(yàn)結(jié)果分析應(yīng)用本發(fā)明對(duì)915例大鼠進(jìn)行誘癌試驗(yàn)，具體方法為選取體重200克、鼠齡3～6月的Wistar大鼠，雌雄各半；灌注前2天至灌注后5天，每只大鼠每天肌肉注射青霉素2萬單位、鏈霉素50毫克，以預(yù)防感染；基礎(chǔ)麻醉采用鹽酸氯胺酮，用量為每公斤體重20毫克，當(dāng)大鼠出現(xiàn)早期麻醉狀態(tài)時(shí)，再用乙醚吸入麻醉；將麻醉狀態(tài)的大鼠上頜門齒掛于操作臺(tái)固定線上，操作臺(tái)與水平面成45°角，用鴨嘴鑷將大鼠的舌輕輕拉出，在額鏡直視下，當(dāng)大鼠吸氣的瞬間，將特制的鈍頭注射針插入大鼠左肺下葉支氣管內(nèi)，注入0.1毫升的致癌質(zhì)混懸液；注入致癌質(zhì)混懸液的第2天攝片檢查以確定灌注部位準(zhǔn)確(見圖1)。
本發(fā)明所誘發(fā)的癌均為肺鱗狀細(xì)胞癌(見圖2)。在注入致癌質(zhì)碘油的第3天，大鼠支氣管粘膜上皮出現(xiàn)過度增生，第5、6天出現(xiàn)鱗狀化生，第7～9天出現(xiàn)不典型增生，第20天后可形成浸潤性鱗癌。
HE染色后進(jìn)行組織學(xué)分析，模型動(dòng)物肺組織內(nèi)出現(xiàn)大小不一癌細(xì)胞團(tuán)，形態(tài)不～，其中可見角化珠或角化囊，癌細(xì)胞核大，部分呈空泡狀，核內(nèi)染色質(zhì)粗糙，核分裂相多，核仁大、邊移(見圖3)。
依其病變進(jìn)展程度不同，可分別診斷為原位癌、早期浸潤癌、浸潤癌?？傉T癌率達(dá)80％。誘發(fā)肺癌情況總結(jié)如下表(表1、2)表1肺癌發(fā)生情況及誘癌率灌藥后時(shí)間灌注劑量 灌注動(dòng)物數(shù) 成癌動(dòng)物總數(shù)誘癌率(％)(天) (毫升/只) (只) (只)200.1 150 78 52400.1 150 98 64500.1 160 135 84.4600.1 160 143 89.4700.1 160 145 90.6800.1 160 153 95.6總計(jì)940 752 80表2肺癌各階段病變發(fā)生詳細(xì)情況(單位只)誘癌后時(shí)間 灌注動(dòng)物 病變類型(天) (只) 原位癌 早期浸潤癌 浸潤癌 成癌動(dòng)物總數(shù)20 15032 41 5 7840 15036 53 9 9850 16019 94 22 13560 16015 81 47 14370 16011 68 66 14580 1606 62 85 153合計(jì) 940119399 234 752細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的輔助蛋白，分子量為33-36KD，是細(xì)胞內(nèi)DNA合成所不可缺少的。PCNA蛋白表達(dá)的變化在肺癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，對(duì)于判斷細(xì)胞增殖活躍和惡性程度具有重要參考價(jià)值。因此申請(qǐng)人對(duì)利用本發(fā)明誘發(fā)的肺癌進(jìn)行了PCNA表達(dá)的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以判斷模型中肺癌細(xì)胞增殖活躍和惡性程度。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在正常肺組織中僅發(fā)現(xiàn)少量PCNA陽性細(xì)胞；原位癌時(shí)陽性表達(dá)率上升到60.0％，且陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增多到上皮的中層；早期浸潤癌和浸潤癌階段PCNA陽性表達(dá)率進(jìn)一步增高，達(dá)到76％和100％，并且顯色呈強(qiáng)陽性的細(xì)胞增多，甚至整個(gè)癌巢都可呈陽性表達(dá)。提示細(xì)胞增殖活性的改變?cè)诎┳冊(cè)缙陔A段就部分發(fā)生，且增殖活性的改變與癌變的進(jìn)程相關(guān)。對(duì)照組的10例肺細(xì)支氣管粘膜上皮細(xì)胞中有4例少部分細(xì)胞可見PCNA蛋白顯色呈陽性，但陽性細(xì)胞數(shù)小于10％，結(jié)果判斷為陰性。實(shí)驗(yàn)組肺組織中，陽性細(xì)胞數(shù)目增多，主要分布于上皮或癌巢基底細(xì)胞層，其他部位少見(圖4、5)。PCNA蛋白陽性表達(dá)率在原位癌、早期浸潤癌和浸潤癌中呈明顯遞增趨勢(shì)，分別為60.0％、76.0％和100.0％，與對(duì)照組(0/10例)比較，差異有高度顯著性(p＜0.01)(表3)。此試驗(yàn)證明本發(fā)明誘發(fā)肺癌細(xì)胞增殖活躍，有明顯惡性腫瘤特征。
表3正常組織及癌變組織中PCNA蛋白表達(dá)n PCNA 陽性率(％) P值- + ++ +++對(duì)照組正常粘膜上皮 10 100 0 0 0(0.0)實(shí)驗(yàn)組原位癌 52 1 2 0 3(60.0)早期浸潤癌 25 6 4 6 9 19(76.0)浸潤癌 20 0 4 5 1120(100.0)＜0.01*注*為實(shí)驗(yàn)組內(nèi)癌變不同階段PCNA陽性表達(dá)率比較結(jié)果總之，本發(fā)明中的致癌質(zhì)碘油混懸液能在肺內(nèi)高效、特異地誘發(fā)肺鱗癌，誘癌率高，成癌時(shí)間短，不污染環(huán)境，且配置方法簡(jiǎn)便，易于進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，是建立肺癌模型的理想致癌質(zhì)溶液。
權(quán)利要求
1.一種誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，它由下述配比的原料制成的混懸液甲基膽蒽60-100毫克二乙基亞硝胺80-100毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽60-80毫克二乙基亞硝胺80-85毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽60毫克二乙基亞硝胺80毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽80毫克二乙基亞硝胺85毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽85毫克二乙基亞硝胺90毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽90毫克二乙基亞硝胺95毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽95毫克二乙基亞硝胺100毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液，其特征是甲基膽蒽100毫克二乙基亞硝胺100毫克罌粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
9.一種用于實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的一種誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液的制備方法，包括下列步驟A、稱取甲基膽蒽和二乙基亞硝胺；B、將甲基膽蒽和二乙基亞硝胺加入罌粟子之碘化脂酸乙脂中，攪拌均勻；C、將步驟B的混合物置于70～75℃溫箱中溶解11～13小時(shí)，取出備用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘發(fā)鼠肺鱗癌模型的致癌質(zhì)混懸液及制備方法，將甲基膽蒽和二乙基亞硝胺及罌粟子之碘化脂酸乙酯按比例混合均勻，然后置于一定溫度溫箱中溶解一定時(shí)間，取出備用。本發(fā)明方法簡(jiǎn)便，配方合理，能高效、特異地誘發(fā)大鼠肺鱗癌，具有誘癌效率高、成癌時(shí)間短、不污染環(huán)境，是建立肺癌模型的理想致癌質(zhì)溶液。
文檔編號(hào)A61K49/00GK1724074SQ20051001906
公開日2006年1月25日 申請(qǐng)日期2005年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月8日
發(fā)明者劉銘球, 田鴻生, 楊飛, 江曼, 刁路明, 魯植艷, 夏東, 張玉霞, 鄒祖玉, 葉波, 陳洪雷, 李紅鋼, 劉絢, 胡雪峰, 劉駿方, 梅列軍 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)