專利名稱：治療腦缺血再灌注損傷的藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療腦缺血再灌注損傷的藥物。尤其是涉及含活性組分水飛薊賓-卵磷脂復(fù)合物的治療腦缺血再灌注損傷的藥物。
背景技術(shù)：
缺血再灌注損傷一直是腦血管病治療的重點(diǎn)課題。中性粒細(xì)胞在缺血再灌注損傷中起著極其重要的作用。再灌注期間，中性粒細(xì)胞大量浸潤于病變組織，一方面可機(jī)械性堵塞微循環(huán)通道，影響組織(特別是缺血半影區(qū))的血液供應(yīng)，另一方面，活化的白細(xì)胞可釋放大量的毒性氧自由基和蛋白水解酶，損害局部的血管，導(dǎo)致血管通透性加強(qiáng)，造成組織水腫。進(jìn)入組織的白細(xì)胞可進(jìn)一步釋放上述毒性物質(zhì)，破壞殘存的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，從而加重神經(jīng)組織的損傷。此外，白細(xì)胞還釋放一些炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，加重炎性反應(yīng)，從而吸引更多的白細(xì)胞進(jìn)入組織，形成惡性循環(huán)，直到組織完全破壞。而這種惡性循環(huán)的形成，是通過缺血/再灌注損傷細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達(dá)的上調(diào)來實(shí)現(xiàn)的。
溶栓療法是近年來缺血性卒中治療上的一個重要進(jìn)展，通過重建腦血流，使缺血區(qū)在產(chǎn)生不可逆性損傷前恢復(fù)供血，可以明顯改善神經(jīng)功能，但伴發(fā)而來的再灌注損傷，包括血腦屏障的破壞、嚴(yán)重腦水腫以及腦出血，限制了急性溶栓療法的療效。即使不進(jìn)行該治療，自發(fā)的血栓或栓子溶解也可導(dǎo)致再灌注損傷，只有滲透性利尿劑或開顱減壓等降低顱內(nèi)壓的措施可起到部分作用，目前尚無真正有效的治療再灌注損傷的方法。而炎癥反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的主要成分，對抗炎癥的各項研究具有深遠(yuǎn)的臨床意義。此外，炎癥反應(yīng)持續(xù)至缺血后數(shù)天，因此抗炎治療可以擴(kuò)大治療時間窗，而后者是缺血性卒中治療中的關(guān)鍵點(diǎn)。所以準(zhǔn)確確定炎癥通路中的各種成分及其相互作用和研究開發(fā)抑制ICAM-1表達(dá)、抑制中性粒細(xì)胞的藥物是一個新的研究課題，為缺血再灌注損傷的治療提供新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供的治療腦缺血再灌注損傷的藥物含有50％以上的活性組分水飛薊賓-卵磷脂復(fù)合物(SLC)。
水飛薊賓(silybin)是一種黃酮類天然抗氧化劑，1968年由Wagner等從菊科植物水飛薊中提取，對血小板聚集及血栓的形成有很好的抑制作用，有證據(jù)表明水飛薊賓具有抗菌、抗毒素、抗氧化和減少自由基的作用。一般認(rèn)為，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是介入細(xì)胞因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子表達(dá)的中心轉(zhuǎn)錄因子。抗氧化合物能有效地抑制NF-κB的活性，因而抑制粘附因子的表達(dá)。
細(xì)胞間粘附分子、中性粒細(xì)胞在缺血再灌注腦區(qū)的上調(diào)和浸潤中起著極其重要的作用。缺血再灌注期間ICAM-1的表達(dá)和中性粒細(xì)胞的浸潤不僅影響了局部的血液供應(yīng)而且還可直接破壞腦組織結(jié)構(gòu)。本發(fā)明從水飛薊賓-卵磷脂復(fù)合物(SLC)具有抗自由基和抗脂質(zhì)過氧化的作用來改變ICAM-1的表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤的原理出發(fā)，發(fā)現(xiàn)了水飛薊賓-卵磷脂復(fù)合物復(fù)合物對腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。
腦缺血再灌注后，ICAM-mRNA和ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加，中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)亦明顯增加，腦梗塞面積擴(kuò)大和組織含水量增加。水飛薊賓-卵磷脂復(fù)合物復(fù)合物能下調(diào)ICAM-1的表達(dá)和抑制白細(xì)胞的聚集，特別是減少中性粒細(xì)胞的聚集和粘附，從而減少蛋白水解酶、溶酶體酶、氧自由基和其他效應(yīng)分子的釋放，使酶類和自由基引起的鏈鎖反應(yīng)削弱，阻止細(xì)胞膜的崩解。同時，抑制缺血再灌注損傷時的PAF和EAA的大量釋放，改善神經(jīng)癥狀，縮小梗塞面積和減輕腦水腫，對缺血再灌注腦損傷有一定的保護(hù)作用。
經(jīng)口服給藥時，首先使本發(fā)明與常規(guī)的藥用輔劑如賦形劑、潤滑劑、崩解劑等混合，將其制成顆粒劑、膠囊、片劑等形式；經(jīng)非口服給藥時，可以注射液、輸液劑或栓劑等形式給藥。制備上述制劑時，可使用常規(guī)的制劑技術(shù)。
本發(fā)明另一方面提供制備治療腦缺血再灌注損傷的藥物的方法稱取水飛薊賓28～60g，溶入熱丙酮1250～1450ml中，得暗紅色澄明液體，45～58℃保溫，加入卵磷脂47～70g，攪拌，直至溶液澄明，約5～15min，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應(yīng)0.5～1.5h，拆除回流裝置，真空濃縮至反應(yīng)液體積為135～315ml，迅速加入到正己烷2856～3686ml中，得黃色沉淀物，上層液體為黃白色乳濁液，加壓過濾，用正己烷洗滌沉淀，置于真空干燥箱中室干燥，得黃色固體產(chǎn)物86～125g。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1 活性成分為SLC的治療腦缺血再灌注損傷的藥物的制備稱取水飛薊賓(上海朝暉藥廠)43g，溶入熱丙酮1350ml中，得暗紅色澄明液體，55℃保溫，加入卵磷脂(四川英格爾公司)68g，攪拌，約10min，直至溶液澄明，接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應(yīng)1h，拆除回流裝置，真空濃縮至反應(yīng)液體積為270ml，迅速加入到正己烷3150ml中，得黃色沉淀物，上層液體為黃白色乳濁液，加壓過濾，用正己烷洗滌沉淀，置于真空干燥箱中室干燥，得黃色固體產(chǎn)物103g。
通過下面的試驗(yàn)說明本發(fā)明藥物的活性。數(shù)據(jù)資料x±S表示，應(yīng)用單因素方差分析，直線回歸分析處理數(shù)據(jù)，以P＜0.05差異有顯著性，P＜0.01差異有非常顯著性。
試驗(yàn)實(shí)施例1 按照實(shí)施例1制得的活性成分為SLC的藥物對缺血再灌注時腦組織ICAM-1mRNA表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)方法動物和分組蒙古種沙土鼠，體重80-100克，雌雄不拘，由上海市生物制品研究所動物研究實(shí)驗(yàn)中心提供。按隨機(jī)數(shù)字表，將動物分為假手術(shù)對照組、缺血組、缺血再灌注組、SLC(制備方法見實(shí)施例1)組和缺血再灌注溶劑組。SLC組又分為100mg/kg組、200mg/kg和300mg/kg三個亞組，除假手術(shù)組外，每組又設(shè)1h、3h、6h、12h、24h5個時相點(diǎn)，每組5只。
腦缺血再灌注動物模型的建立蒙古種沙土鼠再飼料和水供應(yīng)充足條件下，飼養(yǎng)一周，經(jīng)10％烏拉坦(1.25g/kg)腹腔注射麻醉后，將動物仰臥固定于解剖板上，沿頸中線切開皮膚，分離兩側(cè)腺體及頸肌，暴露氣管及左右兩側(cè)頸動脈，將頸總動脈與神經(jīng)分離，穿線備用，同時進(jìn)行氣管插管，實(shí)驗(yàn)室室溫26±1℃，動物直腸溫度通過電熱毯維持在37±0.2℃。其中假手術(shù)組僅作手術(shù)，不結(jié)扎動脈。缺血再灌注組用無損傷血管夾鉗夾兩側(cè)頸總動脈60min后，放開動脈夾。
ICAM-1mRNA原位雜交制備感受態(tài)JM109大腸桿菌，將質(zhì)量轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，裂解細(xì)菌后離心，分離純化質(zhì)粒DNA，再用EcokI和Kpn I兩種限制性內(nèi)切酶雙切質(zhì)粒CDNA，經(jīng)電泳分離和透析得到高純度DNA探針片斷。用地高辛隨機(jī)引物法標(biāo)記CDNA探針。腦組織做冰凍切片進(jìn)行原位雜交，24小時(45℃孵育)；加地高辛抗體后NBI/BICP顯色，封片。結(jié)果用CMIAS計算機(jī)醫(yī)學(xué)圖像分析儀處理，單位以面密度(目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場總面積)表示。
腦缺血60min時，腦組織中ICAM-1mRNA明顯增加，而假手術(shù)對照組表達(dá)不明顯。缺血再灌注組、溶劑組和SLC治療組于缺血再灌注1h ICAM-1mRNA表達(dá)明顯增加，再灌注6h達(dá)高峰，以后逐漸下降，至24h仍維持較高的表達(dá)水平。缺血前30min給予SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg后，缺血再灌注腦組織中ICAM-1mRNA表達(dá)均較溶劑組下降，P＜0.05和P＜0.01(表1)。
表1.缺血再灌注時腦組織ICAM-1mRNA表達(dá)的變化(x±s)

注與缺血組比較△P＜0.01；與缺血再灌注比較#P＞0.05；與溶劑組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗(yàn)實(shí)施例2 ICAM-1蛋白質(zhì)表達(dá)水平測定動物模型制備，分組(n＝10)，給藥方法同前。取待測腦組織，冰凍切片用SP免疫組織化學(xué)染色法進(jìn)行，DAB顯色，結(jié)果用CMIAS計算機(jī)醫(yī)學(xué)圖像分析儀處理，單位以面密度表示。
腦缺血60min時，腦組織中ICAM-1蛋白表達(dá)較假手術(shù)組由0.02±0.017增加到0.04±0.021(P＜0.05)。缺血再灌注組、溶劑組和SLC治療組于缺血再灌注1h時，ICAM-1蛋白表達(dá)明顯增加，而且隨著再灌注時間延長呈增加趨勢，至24h達(dá)高水平。缺血前30min給予SLC 100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg后，缺血再灌注腦組織中ICAM-1mRNA表達(dá)各時相點(diǎn)均較溶劑組降低(P＜0.05或P＜0.01)。在SLC各治療組中，ICAM-1蛋白表達(dá)與SLC的劑量有較好的量效關(guān)系(表2)。
表2.缺血再灌注時腦組織ICAM-1蛋白表達(dá)的變化(x±s)

注與缺血組比較△P＜0.01；與缺血再灌注比較#P＞0.05；與溶劑組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗(yàn)實(shí)施例3 SLC對缺血再灌注時腦組織中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)的影響動物模型制備，分組(n＝10)，給藥方法同前。中性白細(xì)胞中存在髓過氧化酶(Myeloperoxidase enzyme，MPO)，每個細(xì)胞所含酶的量是一定的，約占細(xì)胞干重的5％。該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點(diǎn)可以分析酶的活力，從而定量出中性粒細(xì)胞的數(shù)目。其原理為
利用供氫體鄰聯(lián)茴香胺供氫體后生成黃色化合物在440nm處有最大吸收峰，以定量測定酶的活力，從而推導(dǎo)出中性粒細(xì)胞的數(shù)目。Bradly首先在大鼠皮膚組織中應(yīng)用MPO法測定了炎癥反應(yīng)時中性粒細(xì)胞的的浸潤情況，本研究對此法加以改進(jìn)應(yīng)用于測定缺血腦組織中的MPO，觀察不同情況下腦組織中中性粒細(xì)胞浸潤的不同。
在缺血再灌注1h后，中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)即已開始明顯增加，以后在各時相點(diǎn)呈進(jìn)行性增加趨勢，在12h時相點(diǎn)達(dá)高峰，至24h無下降趨勢。SLC治療組的變化規(guī)律類似于缺血再灌注組，但在程度上則明顯低于缺血再灌注組(P＜0.05或P＜0.01)(表3)。
表3.缺血再灌注時腦組織中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)的變化(x±s)

注與缺血再灌注比較△P＞0.05；與溶劑組比較*P＜0.01試驗(yàn)實(shí)施例4 水飛薊賓-卵磷脂對腦梗塞面積的影響動物模型制備，分組(n＝10)，給藥方法同前。每組沙土鼠隨機(jī)取5只，斷頭取腦，低溫取右腦視交叉前后2mm做連續(xù)冠狀切片，置于2％TTC鹽水緩沖液中，37℃避光孵育30min。TTC購自Sigma公司，批號8877。TTC染色后，可見正常腦組織被染成紅色，壞死組織不著色。以10％福爾馬林溶液固定，在CMIAS型計算機(jī)圖像分析儀上測定腦梗塞面積，計算出腦梗塞面積百分比(梗塞面積/大腦面積×100％)。
TTC染色后，正常腦組織為深紅色，梗塞區(qū)為蒼白色，分界明顯。梗塞可累及基底節(jié)及皮質(zhì)區(qū)。CMIAS型分析儀上測量梗塞面積，對照組大腦冠狀切面上未見梗塞。腦缺血60min時，缺血組的腦梗塞面較對照組明顯增加；再灌注30min后，腦梗塞面積由缺血時的17.71±1.97進(jìn)一步增加到19.16±1.92(P＜0.05)，與溶劑組比較無明顯差異。缺血前給予SLC100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg后，腦梗塞面積分別比溶劑組降低29.39％(P＜0.05)，42.29％(P＜0.01)和60.84％(P＜0.01)，具有較好的量效關(guān)系(表4)。
表4 SLC對沙土鼠腦梗塞面積的影響(x±s，n＝10)

注與對照組比較#P＜0.01；與缺血組比較△P＜0.05；與溶劑組比較*P＜0.05，**P＜0.01試驗(yàn)實(shí)施例5 局灶性腦梗塞沙土鼠神經(jīng)癥狀的評定動物模型制備，分組(n＝10)，給藥方法同前。沙土鼠手術(shù)后4h、24h、72h動態(tài)進(jìn)行神經(jīng)癥狀評定，記錄沙土鼠神經(jīng)癥狀。0級無明顯異常；I級手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收或屈曲；II級除I級癥狀外，尚有向健側(cè)打圈；III級除II級癥狀外，身體倒向健側(cè)；IV級肢體癱瘓，不能爬行。
沙土鼠術(shù)后1h-2h蘇醒，按4h、24h、72h進(jìn)行神經(jīng)功能評定，對照組未見行為異常，均為0級；溶液組術(shù)后可觀察到明顯的行為障礙。余各組沙土鼠神經(jīng)癥隨時間延長于72h有不同程度的緩解，與溶液組比較有統(tǒng)計學(xué)意義。SLC對大腦梗塞后沙土鼠神經(jīng)功能評級的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。
表5 SLC對腦梗塞沙土鼠神經(jīng)功能評級的影響(x±s，n＝10)

注與對照組比較*P＜0.001；與溶劑組比較△P＜0.05，△△P＜0.01
試驗(yàn)實(shí)施例6 局灶性腦梗塞沙土鼠腦組織含水量的測定動物模型制備，分組(n＝10)，給藥方法同前。斷頭取腦，用精密天平稱取全腦濕重，于100℃烤箱中烘烤24h。稱取干重。按Gotoh方法算含水量(濕重-干重)/濕重×100。
腦缺血60min時，腦組織中的含水量較假手術(shù)對照組的40.68±1.86增加到61.38±1.28(P＜0.01)；再灌注30min后，腦組織中的含水量升高至64.32±1.60(P＜0.01)；缺血前給予SLC100mg/kg，200mg/kg，400mg/kg后，腦組織含水量分別比溶劑組降低10.23％(P＜0.05)，17.73％(P＜0.01)和25.71％(P＜0.01)，且具有較好的量效關(guān)系(表6)。
表6 SLC對MCAO沙土鼠腦含水量的影響(x±s，n＝10)

注與對照組比較#P＜0.01；與缺血再灌注比較*P＜0.01；與溶液組比較△P＜0.05，△△P＜0.01試驗(yàn)結(jié)果顯示SLC具有很好的腦保護(hù)作用。SLC可通過以下途徑發(fā)揮作用的。下調(diào)ICAM-1的表達(dá)和抑制白細(xì)胞的聚集，特別是減少中性粒細(xì)胞的聚集和粘附，從而減少蛋白水解酶、溶酶體酶、氧自由基和其他效應(yīng)分子的釋放，使酶類和自由基引起的鏈鎖反應(yīng)削弱，阻止細(xì)胞膜的崩解。抑制缺血再灌注損傷時的PAF和EAA的大量釋放，改善神經(jīng)癥狀，縮小梗塞面積和減輕腦水腫，從而起到腦保護(hù)作用。下面的實(shí)施例說明包含本發(fā)明提供藥物的藥用制劑。
制劑實(shí)施例1 注射液本發(fā)明藥物(制備方法同實(shí)施例1) 150mg生理鹽水 5ml制劑實(shí)施例2 膠囊劑按照本領(lǐng)域已知的方法制備膠囊劑，每個膠囊中含有下述成分本發(fā)明藥物(制備方法同實(shí)施例1) 50mg乳糖 70mg玉米淀粉 25mg硬脂酸鎂 1mg合計 146mg
權(quán)利要求
1.治療腦缺血再灌注損傷的藥物，其特征在于含有50％以上的水飛薊賓—卵磷脂復(fù)合物。
2.權(quán)利要求1所述的治療腦缺血再灌注損傷的藥物，所述藥物為膠囊劑。
3.權(quán)利要求1所述的治療腦缺血再灌注損傷的藥物，所述藥物為注射液。
4.權(quán)利要求1所述的治療腦缺血再灌注損的藥物的制備方法，包括下列步驟a.稱取水飛薊賓28～60g，溶入熱丙酮中，得暗紅色澄明液體，45～58℃保溫；b.加入卵磷脂47～70g，攪拌，直至溶液澄明；c.接回流裝置，邊加熱保溫邊振蕩反應(yīng)0.5～1.5h，拆除回流裝置，真空濃縮至反應(yīng)液體積為135～315ml，迅速加入到烷烴中，得黃色沉淀物，加壓過濾，用烷烴洗滌沉淀，干燥，得黃色固體產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求4所述的治療腦缺血再灌注損傷的藥物的制備方法，其中所述的烷烴為正己烷。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療腦缺血再灌注損傷的藥物，其中包含的活性組分為水飛薊賓－卵磷脂復(fù)合物(SLC)，該治療腦缺血再灌注損傷的藥物對缺血再灌注腦損傷有一定的治療作用，本發(fā)明還公開了該藥物的制備方法。
文檔編號A61P9/10GK1810251SQ20051002355
公開日2006年8月2日 申請日期2005年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月25日
發(fā)明者吳曉華 申請人:上海市第七人民醫(yī)院