專利名稱：一類異喹啉衍生物、制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種全新的降低血漿膽固醇，調(diào)節(jié)血脂的化合物。更具體涉及一類9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽為代表的異喹啉衍生物的用途。
背景技術(shù)：
動脈粥樣硬化心腦血管疾病(如冠心病，中風(fēng))是中國和西方國家致死疾病中的主要?dú)⑹?。其主要病因是高血清總膽固?Gordon et al.1981；Stamler et al.1986；PoolingProject Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病學(xué)調(diào)查揭示，血清總膽固醇每增加1％，冠心病危險(xiǎn)因素增加2％(NCEPR 1991)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，降低血清膽固醇水平可以減少冠心病的發(fā)病率，阻滯動脈粥樣硬化的發(fā)展(LPCP 1984；Frick 1987)。膽固醇不溶于水，不能在血液里轉(zhuǎn)運(yùn)。它們必需與脂蛋白結(jié)合才能在血液里運(yùn)轉(zhuǎn)。人血液里有四種脂蛋白負(fù)責(zé)膽固醇的運(yùn)載。它們是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，極低密度脂蛋白(VLDL)和中間密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的總膽固醇由LDL運(yùn)載。LDL攜帶內(nèi)源或外源膽固醇，穿過血管壁，進(jìn)入內(nèi)皮下(subendothelium)。在內(nèi)皮下，LDL膽固醇被氧化成氧化型LDL膽固醇，并通過清道夫受體被巨噬細(xì)胞以膽固醇酯的形式在細(xì)胞內(nèi)積聚。大量膽固醇酯積聚在巨噬細(xì)胞內(nèi)形成了泡沫細(xì)胞。積聚了大量膽固醇酯的泡沫細(xì)胞沉積在血管內(nèi)皮下，形成了動脈粥樣硬化斑塊核心。資料表明，由LDL運(yùn)載的膽固醇是導(dǎo)致動脈粥樣硬化冠心病的主要根源(Goldsteinl989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth 1992)。所以LDL膽固醇被稱為壞膽固醇。膽固醇引起的動脈粥樣硬化不但是冠心病的主要根源，同時也是腦血管疾病，如腦血栓形成，中風(fēng)的重要病因。此外人腦細(xì)胞內(nèi)積聚的高膽固醇酯還可能和老年性癡呆癥的形成有關(guān)。體內(nèi)膽固醇來源有內(nèi)源和外源。外源膽固醇來自于飲食，內(nèi)源膽固醇是自體合成的結(jié)果。內(nèi)源膽固醇合成亢進(jìn)和家族性高膽固醇血癥在西方國家較為普遍。這種疾病必須通過藥物控制。在美國，40％以上的成年人的LDL膽固醇(壞膽固醇)含量超過正常水平。由于膽固醇在形成心腦血管疾病中的重要作用，近十多年來，美國及歐洲藥廠都把其抗動脈粥樣硬化藥的研究和開發(fā)放到降低血清總膽固醇及LDL膽固醇上。這些藥中療效最顯著的是他丁類藥物，如Merck制藥公司的Zocor和輝瑞制藥公司的Lipitor。這些藥的作用機(jī)理都是抑制人體膽固醇合成的關(guān)鍵酶，HMG輔酶A還原酶(HMG-CoA Reductase)的活力。十多年臨床結(jié)果顯示，HMG輔酶A還原酶抑制劑能顯著的降低血清總膽固醇，防止及降低動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生，發(fā)展和死亡。
HMG輔酶A還原酶抑制劑抑制了膽固醇合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇衰竭。細(xì)胞內(nèi)膽固醇衰竭誘導(dǎo)了肝臟細(xì)胞LDL受體的表達(dá)。肝臟LDL受體的增加可以使血漿中LDL-C清除加快，這使得人類心血管疾病的危險(xiǎn)性大大降低。LDL受體的表達(dá)通過細(xì)胞內(nèi)膽固醇介導(dǎo)的負(fù)反饋機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)由LDL受體啟動子區(qū)固醇調(diào)節(jié)因子(SRE-1)和SRE結(jié)合蛋白(SREBP)的相互作用進(jìn)行控制。在非激活的狀態(tài)下，SREBP存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與另一種穿膜蛋白質(zhì)，SREBP裂解激活蛋白(SCAP)結(jié)合，它是SREBP激活的分子伴侶。SCAP有一個對膽固醇敏感的區(qū)域，通過激活SCAP-SREBP轉(zhuǎn)運(yùn)活性來清除固醇。膽固醇清除完后，SCAP轉(zhuǎn)運(yùn)SREBP到高爾基體中，在這里將前提蛋白的N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域通過特殊的接切進(jìn)行釋放?；罨腟REBP轉(zhuǎn)到核中，與LDL受體啟動子區(qū)SRE-1結(jié)合，激活LDL受體的轉(zhuǎn)錄。相反，在膽固醇充裕的情況下，SCAP-SREBP復(fù)合體沒有活性，存在在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，而LDL受體的表達(dá)保持低水平的表達(dá)。他丁類藥物抑制膽固醇生物合成限速酶HMG輔酶A活性，從而抑制膽固醇合成。抑制膽固醇合成導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇衰竭，激活SCAP-SREBP轉(zhuǎn)位，從而導(dǎo)致LDL受體水平上升，最終降低了血液中LDL-C的水平。血漿中LDL-C水平的降低減少了心血管疾病死亡率和發(fā)病率。但是，盡管他丁類藥物在降低血漿LDL-C的水平，減少心血管疾病死亡率和發(fā)病率方面有效，但還是有必要尋找新的降低LDL-C藥物。因?yàn)橛行┗颊卟荒芎芎玫啬褪芩∷幬?。更重要的是，很多患者單用他丁藥物不能有效降低LDL-C水平。此外他丁類化合物在臨床上引發(fā)的肌纖維融解和肝損傷使人們對該藥的安全性產(chǎn)生了很大的擔(dān)憂。所以，為了治療高脂血癥有必要發(fā)展其它作用機(jī)制和化學(xué)結(jié)構(gòu)不同于他丁類化合物的藥物來提高LDL受體表達(dá)。
本發(fā)明公開了一類從中草藥中提取的新的降膽固醇的小分子化合物，該類小分子化合物是以9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽為代表的異喹啉類衍生物。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽可直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞低密度脂蛋白受體(LDLR)的增加，由肝臟大量攝取低密度脂蛋白膽固醇在肝臟轉(zhuǎn)化來降低血膽固醇含量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一類9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供該類衍生物的制備方法。
本發(fā)明再一目的是公開該類衍生物的用途。
本發(fā)明可通過下列步驟實(shí)施1、一類結(jié)構(gòu)如下的異喹啉類衍生物 及它的生理可接受的鹽其中R1，R2，R3，R4為C1-C5的直鏈、支鏈烷烴、苯基、取代苯基、羧酸基；R5為H或CH3。
以以下兩類天然產(chǎn)物為起始原料。這兩類天然產(chǎn)物可從植物黃連(包括野黃連、石柱黃連等)、三顆針、黃藤、延胡索(元胡)、黃柏、十大功勞等中草藥中提取分離獲得。
具體以以下結(jié)構(gòu)9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓為起始原料獲得衍生物 以上化合物I在PCl5，CH2Cl2條件下，脫去氧橋鍵，得到其相應(yīng)醇，產(chǎn)率可達(dá)70％。
化合物II與鹵代烷烴或酸酐、酰氯或磺酸酐、磺酰氯反應(yīng)可得到其相應(yīng)醚或酯。
化合物II、鹵代烷烴、氫氧化鈉按1∶1.1∶1.2當(dāng)量投料，在THF或二氧六環(huán)等溶劑中回流反應(yīng)6-8小時，可以90％以上產(chǎn)率得到其相應(yīng)產(chǎn)物III。
同樣化合物II、酸酐、酰氯或磺酸酐、磺酰氯、三乙胺按1∶1.1∶1.2當(dāng)量投料，在溶劑二氯甲烷中，0-10℃反應(yīng)6小時，可以近100％的產(chǎn)率得到其相應(yīng)產(chǎn)物III。
化合物III在不同條件下，可有選擇的脫去一個或兩個甲基，得到相應(yīng)單醇或二醇；進(jìn)一步與鹵代烷烴或酸酐、酰氯或磺酸酐、磺酰氯反應(yīng)，可得到相應(yīng)酯或醚。
化合物III在氫鹵酸HI，AC2O中回流反應(yīng)2小時，可脫去兩個甲氧基，得到其相應(yīng)化合物IV。
化合物III在BBr3，CH2Cl2中室溫反應(yīng)2小時，可選擇性的脫去一個甲基，得到化合物V或VI。
化合物IV、鹵代烷烴、氫氧化鈉按1∶2.2∶2.4當(dāng)量投料，在THF或二氧六環(huán)等溶劑中回流反應(yīng)6-8小時，可以90％以上產(chǎn)率得到其相應(yīng)產(chǎn)物VII。
同樣化合物IV、酸酐、酰氯或磺酸酐、磺酰氯、三乙胺按1∶2.2∶2.4當(dāng)量投料，在溶劑二氯甲烷中，0-10℃反應(yīng)6小時，可以100％的產(chǎn)率得到其相應(yīng)產(chǎn)物VII。
化合物V或VI、鹵代烷烴、氫氧化鈉按1∶1.1∶1.2當(dāng)量投料，在THF或二氧六環(huán)等溶劑中回流反應(yīng)6-8小時，可以90％以上產(chǎn)率得到其相應(yīng)產(chǎn)物VIII或IX。
同樣化合物V或VI、酸酐、酰氯或磺酸酐、磺酰氯、三乙胺按1∶1.1∶1.2當(dāng)量投料，在溶劑二氯甲烷中，0-10℃反應(yīng)6小時，可以100％的產(chǎn)率得到其相應(yīng)產(chǎn)物VIII或IX。
同樣方法對(B)類天然產(chǎn)物作結(jié)構(gòu)修飾，得到相應(yīng)衍生物。
9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽的作用原理采用激發(fā)人源LDLR的方法來提高人肝細(xì)胞LPLR產(chǎn)生。激發(fā)人肝細(xì)胞LDLR基因表達(dá)，升高人肝細(xì)胞LDLR產(chǎn)生，增加人肝臟細(xì)胞清除膽固醇的能力。由此來達(dá)到調(diào)節(jié)和控制血脂變化，治療動脈粥樣硬化心血管病、脂質(zhì)代謝紊亂病、脂蛋白代謝紊亂病和高血壓的目的。
本發(fā)明采用9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含為代表對以上所述的作用機(jī)理進(jìn)行基因、受體研究作詳細(xì)描述如下9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含升高人肝臟細(xì)胞株HepG2中LDL受體表達(dá)。在培養(yǎng)基中包含0.5％不含脂蛋白的小牛血清(LPDS)和LPDS與固醇補(bǔ)充物(8μg/ml膽固醇)，加入I(10、20、30μg/ml)進(jìn)行培養(yǎng)。
處理的細(xì)胞內(nèi)的LDL受體mRNA數(shù)量定為1，從9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含處理的細(xì)胞(一種加固醇，一種不加)內(nèi)得到的LDLR的mRNA數(shù)據(jù)，根據(jù)該數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。(a)在HepG2細(xì)胞中，LDL受體的mRNA誘導(dǎo)的劑量依賴型。細(xì)胞用所標(biāo)濃度的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含處理8小時，抽取總RNA用實(shí)時定量PCR分析LDLR和GPD的表達(dá)。
(b)9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含提高細(xì)胞表面LDLR的表達(dá)。
實(shí)時定量PCR測定LDLR mRNA提取LDL受體和GAPD的總RNA并進(jìn)行分析。為進(jìn)行定量PCR測定，我們用1μg RNA為模板，以隨機(jī)引物利用Superscript II進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，42℃進(jìn)行30分鐘。我們用ABI prism7900-HT序列檢測系統(tǒng)和Master Mix對cDNA進(jìn)行了實(shí)時PCR測定。用人LDL受體和GAPD的pre-Developed Taqman分析液估計(jì)LDL受體和GAPD的mRNA表達(dá)水平。實(shí)時PCR探針包括大鼠LDLR和大鼠GAPD都購買于美國Applied biosystems公司。實(shí)時定量RT-PCR檢測結(jié)果加入10.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含化合物后，LDL受體的mRNA水平最早從2.5小時后開始上升，9小時后，與對照相比，LDL受體的mRNA水平升到最高，達(dá)到2.5倍，且在24小時內(nèi)都保持高水平。加入20.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽及含后LDL受體的mRNA水平升高達(dá)3.7倍，30.0μg/ml水平升高達(dá)4.5倍(見表1)。這種作用具有劑量依賴效應(yīng)。
ELISA方法測定HepG2細(xì)胞株LDLR量LDLR是細(xì)胞膜上LDL的特異性受體。它特異性結(jié)合LDL，降LDL攜帶的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞內(nèi)代謝排除體外。
1)將HepG2細(xì)胞(ATCC公司)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時。
2)細(xì)胞固定取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，加入50μl/孔的PBST，30秒后去除PBST。將96孔板敞蓋置37℃，30分鐘后取出，加固定液(70％甲醇+3％H2O2)100μl/孔，5分鐘后去除固定液，再加PBST，200μl/孔，放置20分鐘，用PBST再洗兩次；加抗體封閉液(含1％(w/v)BSA的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，室溫封閉1小時。
3)抗體孵育及顯色。棄去抗體封閉液，用PBST洗兩次，將一抗Anti-LDLR，monoclonalrabbit anti-human antibody，(Santa)按1∶50用封閉液稀釋，50μl/孔，4℃放置過夜。棄去一抗反應(yīng)液，用PBST洗板3次，將二抗Polyclonal donkey anti rabbit IgG-HRP，(Novus Biologicals)按1∶100用封閉液稀釋，50μl/孔，37℃孵育1小時。棄去二抗反應(yīng)液，用PBST洗5次，加底物顯色液100μl/孔，避光室溫放置30分鐘，加2M硫酸終止反應(yīng)，顯色液用酶標(biāo)儀測定其492nm處吸光值作為細(xì)胞LDLR表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果加入10.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后，LDL受體的水平升高達(dá)到2.0倍，加入20.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后LDL受體的水平升高達(dá)2.9，加入30.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后LDL受體的水平升高達(dá)3.8倍。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽降低高脂肪高膽固醇飼料喂飼的大鼠血脂的研究按下面的實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施從西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司(SIPPR/BK Ltd)獲得雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠。體重在180-200g之間(動物合格證號滬動合證字152號)。飼養(yǎng)于室溫22-24℃，濕度50-70％，常壓環(huán)境，自然晝夜。每籠3-4只大鼠，給予西普爾-必凱公司的基礎(chǔ)大鼠飼料(chow)，自由進(jìn)水(除菌純凈水)。Chow飼料喂飼預(yù)養(yǎng)4天后，大鼠飼料換成高脂高膽固醇飼料(5％椰子油，0.5％膽固醇)繼續(xù)喂養(yǎng)1星期。大鼠眼眶采血發(fā)生于1星期后的下午(5:00-7:00)，血樣4℃放置30分鐘后，在4℃環(huán)境中，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取血清，4℃冰箱保存，次日送檢測定血脂。根據(jù)血脂水平，隨機(jī)分組，15只/組，使每組動物達(dá)到均衡隨機(jī)。每天上午6:00至8:00和下午4:00至6:00分別以灌胃途徑給于用CMC混勻的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽。動物口服給予三個劑量。10mg/kg/d，30mg/kg/d和100mg/kg/d，一共給藥14天。陰性對照組僅灌胃給予等量的CMC，同時設(shè)立辛伐他丁(Simvastatin)(10mg/kg/day)作為陽性對照組，Simvastatin是國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的有效調(diào)節(jié)血脂藥，其主要作用在于降低血清總膽固醇和LDL膽固醇。14天后，禁食12小時以上，于下午(5:00-7:00)眼眶后采血，按以上方法得血清，4℃冰箱保存，次日送檢測定血脂。動物無痛苦(乙醚吸入法)處死后立即取肝，除去殘血，稱肝重和體重，計(jì)算肝重/體重比率。
血樣分析血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶。給藥前后各測定血樣一次。用DAKE-RXL全自動生化分析儀測定血樣品。使用試劑為原裝定標(biāo)液、質(zhì)控、測試試劑盒(Roche)。
結(jié)果顯示9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽能顯著降低血清總膽固醇，降低程度隨劑量升高而下降，三個劑量的降低百分率分別為21％，29％，41％，Simvastatin陽性對照組降低54％(圖1)。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽能顯著降低LDL-C，降低程度呈劑量依賴型，三個劑量的降低百分率分別為21％，32％，42％，Simvastatin陽性對照組降低53％(圖2)。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽能顯著降低血清TG，降低程度呈劑量依賴型，三個劑量的降低百分率分別為46％，51％，62％，Simvastatin陽性對照組降低49％(圖3)。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽在100mg/kg劑量時降低TG效果明顯好于Simvastatin陽性對照組。
以上這些血樣分析數(shù)據(jù)具有重要的預(yù)防和治療外周血管疾病、冠心病、中風(fēng)疾病和血管再狹窄等血管疾病的作用。本發(fā)明的另一實(shí)施方案為治療和預(yù)防外周血管疾病、冠心病、中風(fēng)疾病和血管再狹窄等血管疾病。它包括對需要治療的哺乳動物給予9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽的有效劑量。有效劑量是指治療或預(yù)防哺乳動物血管病所需要的劑量。該化合物通常以約50mg至2000mg/天給藥，每天一至四次給藥。這些相同的劑量水平可用于降低血清總膽固醇、LDL-C和TG水平，治療和預(yù)防心血管疾病。
本發(fā)明的有益效果1)本發(fā)明采用從常用植物中提取分離獲得的化合物為起始原料，來源比較廣，制備衍生物化學(xué)合成比較簡便，且產(chǎn)率比較高。相對成本低，適合工業(yè)生產(chǎn)。
2)本發(fā)明提供的化合物從疾病的發(fā)病機(jī)理來設(shè)計(jì)，并用實(shí)驗(yàn)證實(shí)采用調(diào)節(jié)人血脂變化來治療血脂代謝紊亂等疾病效果明顯，證實(shí)該類化合物能在上述疾病的治療藥物中應(yīng)用。


圖1是9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)降低高脂S-D大鼠血清總膽固醇。
圖2是9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)降低S-D大鼠血清低密度脂蛋白膽固醇。
圖3是9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)降低S-D大鼠血清甘油三酯。
具體實(shí)施例方式
天然產(chǎn)物的提取和分離實(shí)施例1取三棵針的根粉碎后用0.5～1％硫酸浸泡一晝夜，次日傾出或過濾，提取液(一般可收集8～10倍量，后一半留作下一批套用)加食鹽飽和，10％鹽酸中和至酸性，放置過夜，濾取析出的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽粗品。
精制時將粗品加熱水溶解，用石灰水調(diào)節(jié)到PH8.5～9.8，冷卻，濾除雜質(zhì)，濾液加濃鹽酸至PH2，冷卻至30℃以下，濾取析出的沉淀，水洗至中性，再用5～10倍量70％酒精加熱至溶解，過濾，冷卻，濾取析出的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽精品。
天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)修飾實(shí)施例29，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽亞甲基醛宿醇的水解 37.6g(0.1mol)9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽，2eq PCl5，在500ml CH2Cl2中回流反應(yīng)2hrs，旋蒸去除溶劑CH2Cl2，加入200ml水，回流反應(yīng)3hrs完成反應(yīng)。冷卻析出晶體，抽濾得到產(chǎn)品。涼干得到產(chǎn)品21.5g，產(chǎn)率60％。
實(shí)施例39，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽亞甲基醛宿醇的水解物的修飾 3.6g(II)，5eq Et3N，100ml CH2Cl2。0-5℃，攪拌下滴加入2.4eq乙酰氯。加完后再在室溫下攪拌反應(yīng)6hrs。旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用乙醇重結(jié)晶的白色晶體4.2g。產(chǎn)率89％。
同樣，化合物II與鹵代烷烴或酸酐、酰氯或磺酸酐、磺酰氯反應(yīng)可得到其相應(yīng)醚或酯。
實(shí)施例49，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽甲基醚的水解及修飾
4.2g(III)，2eq BBr3，50ml CH2Cl2，5-10℃反應(yīng)2hrs旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱分離得IV 1.2g，V 0.6g，VI0.5g.
IV，V，VI分別作類似上述2中的結(jié)構(gòu)修飾，可分別得到其相應(yīng)產(chǎn)物VII，VIII，IX。
同樣的實(shí)施方式適用于下列化合物的獲得 9，10-Dimethoxy-[1，3]dioxolo[4，5-g]isoquino[3，2-a]isoquinolin-7-ylium；chloride(9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽)以上述化合物制作的藥物可接受的鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、吡啶鹽、銨鹽、煙酸酯鹽、異煙酸酯鹽、NR4R5R6鹽等。
實(shí)施例5實(shí)時定量PCR測定LDLR mRNA提取LDL受體和GAPD的總RNA并進(jìn)行分析。為進(jìn)行定量PCR測定，我們用1μg RNA為模板，以隨機(jī)引物利用Superscript II進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，42℃進(jìn)行30分鐘。我們用ABI prism 7900-HT序列檢測系統(tǒng)和Master Mix對cDNA進(jìn)行了實(shí)時PCR測定。用人LDL受體和GAPD的pre-Developed Taqman分析液估計(jì)LDL受體和GAPD的mRNA表達(dá)水平。實(shí)時PCR探針包括大鼠LDLR和大鼠GAPD都購買于美國Applied biosystems公司。實(shí)時定量RT-PCR檢測結(jié)果加入10.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后，LDL受體的mRNA水平最早從2.5小時后開始上升，9小時后，與對照相比，LDL受體的mRNA水平升到最高，達(dá)到2.5倍，且在24小時內(nèi)都保持高水平。加入20.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后LDL受體的mRNA水平升高達(dá)3.7倍，30.0μg/ml水平升高達(dá)4.5倍(見表1)。這種作用具有劑量依賴效應(yīng)。
表1 9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)對HepG2細(xì)胞株LDLR mRNA表達(dá)的影響

2、ELISA測定HepG2細(xì)胞株LDLR量LDLR是細(xì)胞膜上LDL的特異性受體。
1)將HepG2細(xì)胞(ATCC公司)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)24小時。
2)細(xì)胞固定取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，加入50μl/孔的PBST，30秒后去除PBST。將96孔板敞蓋置37℃，30分鐘后取出，加固定液(70％甲醇+3％H2O2)100μl/孔，5分鐘后去除固定液，再加PBST，200μl/孔，放置20分鐘，用PBST再洗兩次；加抗體封閉液(含1％(w/v)BSA的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4)，室溫封閉1小時。
3)抗體孵育及顯色。棄去抗體封閉液，用PBST洗兩次，將一抗Anti-LDLR，monoclonalrabbit anti-human antibody，(Santa)按1∶50用封閉液稀釋，50μl/孔，4℃放置過夜。棄去一抗反應(yīng)液，用PBST洗板3次，將二抗Polyclonal donkey anti rabbit IgG-HRP，(Novus Biologicals)按1∶100用封閉液稀釋，50μl/孔，37℃孵育1小時。棄去二抗反應(yīng)液，用PBST洗5次，加底物顯色液100μl/孔，避光室溫放置30分鐘，加2M硫酸終止反應(yīng)，顯色液用酶標(biāo)儀測定其492nm處吸光值作為細(xì)胞LDLR表達(dá)水平。試驗(yàn)結(jié)果加入10.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后，LDL受體的水平升高達(dá)到2.0倍，加入20.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后LDL受體的水平升高達(dá)2.9，加入30.0μg/ml的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽后LDL受體的水平升高達(dá)3.8倍(見表2)。
表2 9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)對HepG2細(xì)胞株LDL受體含量的影響

3、9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽降低高脂肪高膽固醇飼料喂飼的大鼠血脂的研究按下面的實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施。
從西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司(SIPPR/BK Ltd)獲得雄性清潔級Sprague-Dawley大鼠。體重在180-200g之間(動物合格證號滬動合證字152號)。飼養(yǎng)于室溫22-24℃，濕度50-70％，常壓環(huán)境，自然晝夜。每籠3-4只大鼠，給予西普爾-必凱公司的基礎(chǔ)大鼠飼料(chow)，自由進(jìn)水(除菌純凈水)。Chow飼料喂飼預(yù)養(yǎng)4天后，大鼠飼料換成高脂高膽固醇飼料(5％椰子油，0.5％膽固醇)繼續(xù)喂養(yǎng)1星期。大鼠眼眶采血發(fā)生于1星期后的下午(5:00-7:00)，血樣4℃放置30分鐘后，在4℃環(huán)境中，5000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取血清，4℃冰箱保存，次日送檢測定血脂。根據(jù)血脂水平，隨機(jī)分組，15只/組，使每組動物達(dá)到均衡隨機(jī)。每天上午6:00至8:00和下午4:00至6:00分別以灌胃途徑給于用CMC混勻的9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽。動物口服給予三個劑量。10mg/kg/d，30mg/kg/d和100mg/kg/d，一共給藥14天。陰性對照組僅灌胃給予等量的CMC，同時設(shè)立Simvastatin(10mg/kg/day)作為陽性對照組，Simvastatin是國際醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的有效調(diào)節(jié)血脂藥，其主要作用在于降低血清總膽固醇和LDL膽固醇。14天后，禁食12小時以上，于下午(5:00-7:00)眼眶后采血，按以上方法得血清，4℃冰箱保存，次日送檢測定血脂。動物無痛苦(乙醚吸入法)處死后立即取肝，除去殘血，稱肝重和體重，計(jì)算肝重/體重比率。
血樣分析血清總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶。給藥前后各測定血樣一次。用DAKE-RXL全自動生化分析儀測定血樣品。使用試劑為原裝定標(biāo)液、質(zhì)控、測試試劑盒(Roche)。
動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽能顯著降低血清總膽固醇，降低程度隨劑量升高而下降，三個劑量的降低百分率分別為21％，29％，41％，Simvastatin陽性對照組降低54％(圖1)。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽能顯著降低LDL-C，降低程度呈劑量依賴型，三個劑量的降低百分率分別為21％，32％，42％，陽性對照組gemfibrozil僅降低53％(圖2)。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽能顯著降低血清TG，降低程度呈劑量依賴型，三個劑量的降低百分率分別為46％，51％，62％，陽性對照組gemfibrozil僅降低49％(圖3)。
4、9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)降低高脂血癥患者血清總膽固醇、LDL-膽固醇和甘油三脂我們對50位高脂血癥患者(32位男性和18位女性)進(jìn)行了9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽降低血脂的試驗(yàn)。我們根據(jù)為中國人群推薦的高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)來確定他們是否可以被認(rèn)為是高膽固醇血癥(IIa和IIb)(Zhan，S.P.Etiologyand diagonosis of hyperlipidemia.Clinical serum and Lipid 1.72-94(1997))。我們將人群隨機(jī)分成9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽組(n＝30)和安慰劑組(n＝20)。
9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽治療組口服9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽三個月，每天兩次，每次0.6g。安慰劑組同樣時間、劑量服用安慰劑。治療之前取血樣，治療三個月后再取血樣。治療三個月后，用標(biāo)準(zhǔn)方法檢測血清中膽固醇，甘油三酯，HDL-C和LDL-C。同時檢測肝功能和腎功能。上述操作得到了所有的受試者的同意。
30名高膽固醇血癥患者中，9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽顯著降低血清中的總膽固醇達(dá)32％(p值小于0.01)，甘油三酯降低32％(p值小于0.05)，LDL-C降低29％(p值小于0.05)，但是HDL-C水平?jīng)]有變化(表3)。在這次的實(shí)驗(yàn)人群中，9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽在IIa型和IIb型病人中降低膽固醇的能力相同，但是，我們發(fā)現(xiàn)其降低甘油三酯的能力僅僅在IIa型病人中，在IIb型病人中沒有起到作用。在該人群中9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽還顯著提高了肝臟功能。病人對9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽耐受良好，沒有觀察到副作用。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽不改變腎臟功能，但是可以通過降低丙胺酸轉(zhuǎn)氨酶，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和r-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的水平來提高肝臟功能(表3)。安慰劑組這些都沒有改變。
表1 9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)對高膽固醇血癥患者血清脂質(zhì)含量的影響

表2 9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)對高膽固醇血癥患者肝和腎臟功能的影響

#引用于“國家臨床試驗(yàn)室手冊”；ALT丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；GGT gamma-谷氨銑肽轉(zhuǎn)移酶；Bil-T總膽紅素；Cr肌酸酐；BUN血尿素氮以上這些血樣分析數(shù)據(jù)具有重要的預(yù)防和治療外周血管疾病、冠心病、中風(fēng)疾病和血管再狹窄等血管疾病的作用。
經(jīng)過三個月的治療，高膽固醇血癥試驗(yàn)人員中血漿總膽固醇水平可以降低32％，甘油三酯水平降低32％，LDL-C水平降低29％。與他汀類藥物平均降低LDL-C水平達(dá)48％相比，9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽在0.6g/kg劑量下獲得的療效是中上等的。本臨床試驗(yàn)以0.6g/kg一天二次劑量進(jìn)行的治療高膽固醇血脂病研究是前期試驗(yàn)，通過改善治療程序和優(yōu)化給藥劑量，可能會有更高的降低膽固醇的效果。這個概念在我們進(jìn)行的大鼠試驗(yàn)中獲得支持?？梢詮母咧笫蟮脑囼?yàn)中觀察到，9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽對降低大鼠LDL-C的效應(yīng)具有劑量依賴性。9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽對所有受試者都有很好的耐受性，這和其他試驗(yàn)結(jié)果一致。
本發(fā)明的實(shí)施方案為治療和預(yù)防外周血管疾病、冠心病、中風(fēng)疾病和血管再狹窄等血管疾病有用。它包括對需要治療的哺乳動物給予I化合物的有效劑量。有效劑量是指治療或預(yù)防哺乳動物血管病所需要的劑量。該化合物通常以約50mg至2000mg/天給藥，每天一至四次給藥。這些相同的劑量水平可用于血管疾病的治療和預(yù)防，降低血清總膽固醇，LDL-C和TG。
權(quán)利要求
1.一類結(jié)構(gòu)如下的異喹啉類衍生物 及它的生理可接受的鹽其中R1，R2，R3，R4為C1-C5的直鏈、支鏈烷烴、苯基、取代苯基、羧酸基；R5為H或CH3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異喹啉衍生物，其特征在于它的生理可接受的鹽包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、吡啶鹽、銨鹽、煙酸酯鹽、異煙酸酯鹽、NR4R6R6鹽。
3.如權(quán)利要求1所述的異喹啉類衍生物的制備方法由下列步驟組成 a.化合物I在PCl5，CH2Cl2為溶劑反應(yīng)脫去氧橋鍵得相應(yīng)醇化合物II；b.化合物II與鹵代烷烴或酸解、酰氯、磺酸醇酐或磺酰氯反應(yīng)得相應(yīng)的醚或酯化合物III；c.化合物III在不同條件下選擇性脫一個或兩個甲基，得到化合物IV，V，或VI；d.上述化合物IV，V或VI與鹵代烷或酸酐、酰氯或磺酸酐，或磺酰氯反應(yīng)得到相應(yīng)的酯或醚化合物VII、VIII、IX。
4.如權(quán)利要求1所述的異喹啉類衍生物的用途為在降低血清總膽固醇(TC)，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三脂(TG)的調(diào)節(jié)血脂變化；在預(yù)防和治療外周血管疾病、血管再狹窄疾病；在預(yù)防和治療冠心病和中風(fēng)疾病的藥物中應(yīng)用。
5.據(jù)權(quán)利要求1所述的異喹啉類衍生物的用途為在降低血清總膽固醇(TC)，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三脂(TG)的調(diào)節(jié)血脂變化的藥物中應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異喹啉類衍生物的用途為在預(yù)防和治療外周血管疾病、血管再狹窄疾病的藥品中應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異喹啉類衍生物的用途為在預(yù)防和治療冠心病和中風(fēng)疾病的藥物中應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的異喹啉類衍生物的用途，其特征在于天然產(chǎn)物四氫巴馬亭tetrahydropalmatineR1＝R2＝R3＝R4＝CH3，R5＝H紫堇堿corydalineR1＝R2＝R3＝R4＝R5＝CH3紫堇單酚堿corydalmineR1＝R2＝R3＝CH3，R4＝R5＝H四氫非洲防己胺terahydrocolumbamineR1＝R3＝R4＝CH3，R2＝R5＝H斯庫來堿R1＝R4＝CH3，R2＝R3＝R5＝H四氫藥根堿R1＝R5＝H，R2＝R3＝R4＝CH3去氫紫堇堿R1＝R2＝R3＝R4＝R5＝CH3非洲防己胺columbamineR1＝R3＝R4＝CH3，R2＝R5＝H9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽R1，R2＝-CH2-，R3，R4＝-CH2-，R5＝H同樣具有與權(quán)利要求4所述的異喹啉類衍生物的用途。
9.根椐權(quán)利要求1所述以9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽為代表的異喹啉類衍生物應(yīng)用于伺料添加劑喂伺雞、鴨等家禽使之生產(chǎn)低膽固醇含量的蛋類。
10.根椐權(quán)利要求1所述以9，10-二甲氧基-[1，3]二氧[4，5-g]異喹啉[3，2-a]異喹啉-7-內(nèi)鎓鹽酸鹽為代表的異喹啉類衍生物應(yīng)用于伺料添加劑喂伺奶牛使之生產(chǎn)低膽固醇、低脂肪含量的牛奶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類異喹啉類衍生物。喹啉類衍生物，以9，10－二甲氧基－[1，3]二氧[4，5－g]異喹啉[3，2－a]異喹啉－7－內(nèi)鎓鹽酸鹽(I)為代表，通過肝臟大量攝取低密度脂蛋白膽固醇在肝臟轉(zhuǎn)化成膽汁酸來降低血漿膽固醇含量。9，10－二甲氧基－[1，3]二氧[4，5－g]異喹啉[3，2－a]異喹啉－7－內(nèi)鎓鹽酸鹽是一種在降膽固醇機(jī)理上不同于他丁類藥物的新型降膽固醇化合物物。9，10－二甲氧基－[1，3]二氧[4，5－g]異喹啉[3，2－a]異喹啉－7－內(nèi)鎓鹽酸鹽和異喹啉類衍生物毒副作用極低，是一種非常安全的天然降膽固醇藥物。
文檔編號A61K31/4738GK1827618SQ20051002421
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月4日
發(fā)明者王文廣 申請人:周桂華, 王文廣