專利名稱：鷹嘴豆提取物在制備防治肥胖和2型糖尿病食品中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆提取物在制備防治肥胖和2型糖尿病的食品中的應用。
背景技術(shù)：
提取物是植物藥應用的重要環(huán)節(jié)和方式。歐美各國25％處方至少含有1種來自高等植物的提取物或化合物。在美國，植物提取物占草藥市場的95％以上，生藥材和其他產(chǎn)品占有率不到5％。在德國，以提取物為主要形式的草藥產(chǎn)品占全國藥品市場總額的10％，占全國OTC市場近30％，可見植物藥提取物在國外有著較好的應用基礎(chǔ)和廣泛的市場。在中國，中藥提取物的開發(fā)方興未艾，不少研究機構(gòu)和制藥公司已開發(fā)出黃芪提取物、葛根提取物、山楂提取物等上百種中藥提取物，而銀杏標準提取物中有效成分含量是原料中的50倍，大大提高了藥物的療效。
關(guān)于大豆的研究，目前美國市場上已經(jīng)有300多種大豆異黃酮功能食品，年銷售額近20億美元。在歐洲、日本、韓國等國家和地區(qū)，以大豆異黃酮為主要成分的保健食品已成為一種新型暢銷食品，含有大豆異黃酮的保健食品達數(shù)十種之多。據(jù)統(tǒng)計，目前國際市場對大豆異黃酮的年需求量已達1500噸，但實際年產(chǎn)量僅為300噸。
鷹嘴豆(Nuhut、奴乎特、諾胡提、Cicer arietinumL)，因形如鷹頭、在種臍附近有喙狀突起而得名，是豆科植物野豌豆屬植物中的一個稀有品種，起源于亞洲西部和近東地區(qū)，主要分布在世界溫暖而又比較干旱的地區(qū)，在印度為第一大食用豆類作物。鷹嘴豆在我國新疆已有2500年的生長歷史，并作為維藥載入《新疆維吾爾藥志》。鷹嘴豆營養(yǎng)豐富，其中蛋白質(zhì)的含量為14.9-24.6％，脂肪約6.4％，多為對人體十分有利的不飽和脂肪酸，如″喀布爾″型鷹嘴豆的脂肪中含油酸50.3％，亞油酸40％。進一步分析發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆中氨基酸含量是燕麥的三倍，且人體必須的8種氨基酸全部具有，亞油酸比大豆高20％，鐵、鋅、鈣、磷等微量元素均高于其它豆類，這對于降低血脂和膽固醇水平，加強中老年中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制和心血管的保護有很大作用。
在我國，鷹嘴豆作為一種維藥一直被應用到日常疾病的臨床治療中，也積累了不少特殊的治療秘方，特別是對糖尿病、心血管病、腎虛等疾病作用明顯，同時鷹嘴豆又是優(yōu)秀的營養(yǎng)食品。據(jù)新疆的調(diào)查，全區(qū)有維藥600余種，較常用的360種左右，其中本地產(chǎn)資源約160種，占維藥種數(shù)的27％。常用維藥中，屬于民族專用的約有30種，其中包括新疆鷹嘴豆。據(jù)古代文獻《飲膳正要》《本草拾遺》《救荒本草》等記載，鷹嘴豆有生津降血脂功效。
現(xiàn)有資料分析，早在六、七十年代就有文獻陸續(xù)報道鷹嘴豆能降低實驗引起的小鼠/兔子血清甘油三脂和膽固醇水平，本發(fā)明人研究采用自由進食的方法，旨在建立與人類肥胖最接近的動物模型，研究發(fā)現(xiàn)長期高脂飲食導致小鼠體重明顯增加，而鷹嘴豆具有減輕肥胖小鼠體重的作用。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆顯著降低血清LDL-C和TG，升高HDL-C，并能有效降低骨骼肌組織的脂滴沉積，改善高脂飲食引起的肝糖元含量增加和血管內(nèi)膜的增厚。分子生物學水平研究還發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆顯著降低長期高脂飲食小鼠脂肪組織的Leptin和LPL RNA水平，升高Adiponectin水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于研究鷹嘴豆提取物的應用。
研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆醇提物(約0.02g/kg/day)的效果顯著好于其原藥材(約0.5g/kg/day)，可見該提取物中的藥效物質(zhì)富集程度高。同時還發(fā)現(xiàn)醇提物的療效優(yōu)于水提取物，說明傳統(tǒng)的水煎劑方式不完全適合鷹嘴豆，因此運用鷹嘴豆的醇提物作為藥物制劑和食品的原料，對于成品質(zhì)量的提高，療效的穩(wěn)定將起著積極的意義，同時有利于加深鷹嘴豆藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)研究，拓展該藥安全性。
通常，胰島素耐量試驗(ITT)是小鼠腹腔注射胰島素后觀察血糖的改變情況，可以反映機體對外源性胰島素的敏感性，是反映胰島敏感性的一個重要指標，本發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)高脂小鼠對外源性胰島素的反應明顯下降，特別是給藥3小時后血糖明顯高于對照組，而給予鷹嘴豆及提取物3個月后具有一定的改善胰島素抵抗的作用，以醇提物作用最顯著。因此，鷹嘴豆提取物可以用于制備防治肥胖和2型糖尿病、增加胰島素敏感性的藥物和食品。
本發(fā)明提供了鷹嘴豆提取物在制備防治肥胖和2型糖尿病食品中的應用。
本發(fā)明的鷹嘴豆提取物包括用水或醇提取得到的提取物。
本發(fā)明的鷹嘴豆提取物是采用下列方法制得的a、醇提物的制備將碎成1-5mm的鷹嘴豆粉置于錐形瓶中，加入適量乙醇，用超聲波提取4-5次，每次2小時，濾紙過濾，合并濾液，控制溫度在40度以下，加壓濃縮得到醇提物；b、水提物的制備將碎成1-5mm的鷹嘴豆粉置于燒杯中，加入適量去離子水，用超聲波提取3次，每次3小時，紗布過濾，濾液進一步離心，取上清液，溫度低于60度，減壓濃縮上清液，得到水提物；c、鷹嘴豆提取物配制將步驟a或b方法制得的鷹嘴豆提取物置于研缽內(nèi)研細，逐漸加入助懸劑DMSO研磨，再用超聲粉碎器進一步助懸，使均勻分散成混懸劑，制成10倍濃度的混懸液，其中DMSO的添加濃度為0.1％.臨用前用蒸餾水稀釋，制成飲用液，飲用液中的提取物濃度為4-8g/L。


圖1鷹嘴豆提取物對高脂小鼠體重的影響(一) 鷹嘴豆醇提物能夠降低高脂飲食引起的體重增加，喂養(yǎng)90天后有統(tǒng)計學差異**＜0.01。Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p＜0.05，**＜0.01VS.高脂飲食組1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖2鷹嘴豆提取物對高脂小鼠體重的影響(二) 喂養(yǎng)90天后高脂飲食組、正常飲食組、高脂加鷹嘴豆組、高脂飲食同時給予鷹嘴豆水提物、醇提物組的體重分別為52.13±3.0g、69.00±6.26g、63.78±11.28g、62.33±7.04g 3和57.11±6.13g，說明鷹嘴豆醇提物能顯著降低高脂飲食引起的體重增加(p＜0.01)，而鷹嘴豆食組和水提物組雖然也有減重趨勢，但尚未有統(tǒng)計學差異。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p＜0.05，**＜0.01VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖3空腹血糖 于小鼠開始分組喂養(yǎng)60天時測定空腹血糖、正常飲食組、高脂飲食組、鷹嘴豆水提取物和鷹嘴豆醇提取物分別為2.96±0.6mM、4.01±0.94mM、3.47±1.1mM和3.01±0.55mM。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p＜0.05VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)脂飲食+鷹嘴豆水提組，4)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖4內(nèi)臟脂肪(附睪)重量 喂養(yǎng)100天后高脂加鷹嘴豆組、高脂飲食同時給予鷹嘴豆水提物、醇提物組的附睪脂肪重量分別為1.15±0.37g、3.28±0.59g、3.35±1.34g、3.12±0.98g 和2.22±0.62g，鷹嘴豆醇提物組能顯著降低高脂飲食引起的附睪脂肪重量增加(p＜0.05)，而鷹嘴豆食組和水提物組的附睪脂肪重量與高脂組比無差異。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p＜0.05，VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。圖5糖負荷后2小時小鼠血糖水平鷹嘴豆醇提物量組顯著降低高脂小鼠餐后2小時血糖水平(＜0.01)，而鷹嘴豆食組和水提物組餐后血糖無明顯改變。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，**＜0.01VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖6ITT180分鐘的血糖值 喂養(yǎng)3個月后ITT試驗顯示與高脂飲食組相比，鷹嘴豆組、鷹嘴豆水提物和醇提物組均顯著降低小鼠腹腔注射胰島180分鐘后的血糖水平，均為p＜0.01，即顯著改善了高脂飲食引起的胰島素敏感性降低。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，***＜0.01VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖7ITT血糖變化曲線 喂養(yǎng)3個月后鷹嘴豆組、鷹嘴豆水提物、醇提物組均顯著增加長期高脂飲食引起的胰島素敏感性降低，均為p＜0.01。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，**＜0.01VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖8、9、10、11喂養(yǎng)100天后鷹嘴豆組、鷹嘴豆提取物大、小劑量組均顯著改善高脂飲食引起的甘油三脂、膽固醇和低密度脂蛋白升高，其中鷹嘴豆醇提物組藥效優(yōu)于其余兩組，同時鷹嘴豆醇提還有升高高密度脂蛋白水平的趨勢，但無統(tǒng)計學差異。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p＜0.05，**＜0.01VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組(圖11除外)，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
圖12與正常飲食組相比，高脂飲食組、鷹嘴豆食組和水提物組餐后2小時胰島素水平升高，而鷹嘴豆水醇提組升高不明顯。(Mean±SD，2Exp.(n＝8-10/exp)，*p＜0.05，**＜0.01VS.高脂飲食組)1)正常飲食組，2)高脂飲食組，3)高脂飲食+鷹嘴豆食組，4)高脂飲食+鷹嘴豆水提組，5)高脂飲食+鷹嘴豆醇提組。
具體實施例方式
本發(fā)明人通過下列實驗對鷹嘴豆提取物在防治肥胖和2型糖尿病中的效果檢測實施例1、材料與方法1.昆明小鼠體重40克左右，分為5組正常飲食組、高脂飲食組、高脂加鷹嘴豆食組、高脂飲食加鷹嘴豆醇提物組(0.2g/kg/day)、高脂加鷹嘴豆水提物組(0.4g/kg/day)，觀察時間100天。
2.飲食成分(1)普通飼料碳水化合物60％、蛋白質(zhì)22％、脂肪10％、其它8％(2)高脂飼料由普通飼料加豬油、奶粉、魚粉和白砂糖配制而成，其中碳水化合物40％、蛋白質(zhì)13％、脂肪40％、其它7％
(3)高脂加鷹嘴豆食組每50kg高脂飼料中撤去5kg的普通飼料，由同樣5公斤的鷹嘴豆替代，其總熱量以及碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪比例與高脂組相近。
3.鷹嘴豆提取物制備a、醇提物的制備將碎成1-5mm的鷹嘴豆粉置于錐形瓶中，加入適量乙醇，用超聲波提取4-5次，每次2小時。濾紙過濾，合并濾液，控制溫度在40度以下，加壓濃縮得到醇提物。
b、水提物的制備將碎成1-5mm的鷹嘴豆粉置于燒杯中，加入適量去離子水，用超聲波提取3次，每次3小時。紗布過濾，濾液進一步離心，取上清液。溫度低于60度，減壓濃縮上清液，得到水提物。
c、鷹嘴豆提取物配制將鷹嘴豆提取物置于研缽內(nèi)研細，逐漸加入助懸劑DMSO研磨，再用超聲粉碎器進一步助懸，使均勻分散成混懸劑，制成10倍濃度的混懸液，其中DMSO的添加濃度為0.1％.臨用前用蒸餾水稀釋，制成飲用液自由飲用，飲用液中的提取物濃度為4-8g/L。
4、鷹嘴豆提取物的飲用方式兌入飲用水中自由飲用(0.4-0.8％)5、胰島素耐量試驗按1IU/kg腹腔注射常規(guī)胰島素，并在0、15、30、60、90、120、180分鐘割尾靜脈用freestyle血糖儀測定血糖值。
6、口服糖耐量試驗及胰島素釋放試驗(IRT)口服糖耐量試驗用20％的葡萄糖溶液，以2g/kg體重的劑量灌胃，分別于空腹及給糖后120min經(jīng)尾靜脈采血，胰島素釋放試驗同步進行。
7、100天后小鼠斷頭處死，分離血清，血清甘油三脂、膽固醇、高密度及低密度脂蛋白采用生化法，由瑞金醫(yī)院檢驗科測定。
結(jié)果1.鷹嘴豆提取物對高脂小鼠體重的影響喂養(yǎng)100天后正常飲食組、高脂飲食組、高脂加鷹嘴豆食組、高脂飲食同時給予鷹嘴豆水提物、醇提物組的體重分別為52.13±3.0g、69.00±6.26g、63.78±11.28g、62.33±7.04g 3和57.11±6.13g，說明鷹嘴豆醇提物能顯著降低高脂飲食引起的體重增加(p＜0.01)，而鷹嘴豆食組和水提物組雖然也有減重趨勢，但尚未有統(tǒng)計學差異。(圖1，2)2.空腹血糖于小鼠開始分組喂養(yǎng)60天時測定空腹血糖、正常飲食組、高脂飲食組、鷹嘴豆水提取物和醇提取物組的血糖值分別為2.96±0.6mM、4.01±0.94mM、3.47±1.1mM和3.01±0.55mM。(圖3)3.內(nèi)臟脂肪(附睪)重量喂養(yǎng)100天后五組的附睪脂肪重量分別為1.15±0.37g、3.28±0.59g、3.35±1.34g、3.12±0.98g和2.22±0.62g，鷹嘴豆醇提物組能顯著降低高脂飲食引起的附睪脂肪重量增加(p＜0.05)，而鷹嘴豆食組和水提物組的附睪脂肪重量與高脂組比無差異。(圖4)4.鷹嘴豆提取物對長期高脂喂養(yǎng)小鼠胰島素敏感性的影響喂養(yǎng)90天后鷹嘴豆食組、鷹嘴豆水提物、醇提物組均顯著增加長期高脂飲食引起的胰島素敏感性降低，三組藥效作用無明顯不同。(圖6，7)5.鷹嘴豆提取物對高脂小鼠脂代謝的影響喂養(yǎng)100天后鷹嘴豆食組、鷹嘴豆水提物、醇提物組均顯著改善高脂飲食引起的甘油三脂、膽固醇和低密度脂蛋白升高，其中鷹嘴豆醇提物組藥效優(yōu)于其余兩組，見下圖。三治療組的高密度脂蛋白水平均高于高脂飲食組，但尚未有統(tǒng)計學意義。(圖9-11)


注與高脂飲食組比*p＜0.05，**p＜0.01；與高脂+鷹嘴豆組比△p＜0.056.灌服葡萄糖后2小時小鼠血糖和胰島素水平鷹嘴豆醇提物量組顯著降低高脂小鼠餐后2小時血糖水平，而鷹嘴豆食組餐后血糖無明顯改變；同時鷹嘴豆水提物組雖然有減低餐后胰島素水平的趨勢，但尚未達到統(tǒng)計學差別。同時，與正常飲食組相比，高脂飲食組、鷹嘴豆食組和水提物組餐后2小時胰島素水平升高，而鷹嘴豆水醇提組升高不明顯。圖5，12)

注與高脂飲食組比**p＜0.01；與正常組比△p＜0.01實施例2、材料與方法1.昆明小鼠體重40克左右，分為5組正常飲食組、高脂飲食組、高脂加鷹嘴豆食組、高脂飲食加鷹嘴豆醇提物組(0.2g/kg/day)、高脂加鷹嘴豆水提物組(0.4g/kg/day)，觀察時間100天。
2.飲食成分(1)普通飼料碳水化合物60％、蛋白質(zhì)22％、脂肪10％、其它8％(2)高脂飼料由普通飼料加豬油、奶粉、魚粉和白砂糖配制而成，其中碳水化合物40％、蛋白質(zhì)13％、脂肪40％、其它7％(3)高脂加鷹嘴豆食組每50kg高脂飼料中撤去5kg的普通飼料，由同樣5公斤的鷹嘴豆替代，其總熱量以及碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪比例與高脂組相近。
3.鷹嘴豆提取物的飲用方式同實例1。
4、鷹嘴豆提取物制備同實例1。
實驗一觀察喂養(yǎng)期間小鼠體重變化于小鼠分組喂養(yǎng)0、30、60及90天時測定體重，觀察小鼠在喂養(yǎng)期間體重變化情況，并比較各組間體重差異是否顯著，見Fig1、2。小鼠開始用于實驗時體重無差異，分組喂養(yǎng)30天后，各組間小鼠體重出現(xiàn)差異，高脂飲食喂養(yǎng)組小鼠體重增加明顯快于其他組，鷹嘴豆醇提物治療組、水提物治療組和正常對照組體重均低于高脂飲食喂養(yǎng)組，但差別無顯著性，喂養(yǎng)90天后，鷹嘴豆醇提物治療組療效優(yōu)于水提物組和鷹嘴豆食組，與高脂模型組相比p＜0.05。提示在高脂飲食喂養(yǎng)的同時給予鷹嘴豆醇提物治療可以使小鼠避免因高脂飲食導致的體重明顯增加，在進食量相同的情況下體重與正常對照組接近。
實驗二喂養(yǎng)期間小鼠空腹血糖以及葡萄糖負荷后2h血糖水平于小鼠開始分組喂養(yǎng)60天時測定空腹及葡萄糖負荷(給予小鼠50％葡萄糖注射液灌胃，劑量為2g/kg體重后2h血糖變化。小鼠試驗前一日晚上開始禁食，12小時后用于試驗。于試驗0及2h時經(jīng)尾靜脈取血，用freestyle血糖儀測定血糖濃度，見圖3、5。鷹嘴豆顯著改善高脂喂養(yǎng)引起的糖耐量受損。
實驗三腹腔注射胰島素耐量試驗(ITT)胰島素耐量試驗按1IU/kg腹腔注射正規(guī)胰島素胰島素，并在0、15、30、60、90、120、180分鐘割尾靜脈用freestyle血糖儀測定血糖濃度。每組以0min時血糖值為基礎(chǔ)值，求得其它時間血糖值與基礎(chǔ)值的比值，觀察血糖下降情況，見Fig6、7。180分鐘后鷹嘴豆食組、水提物和醇提物治療組血糖均顯著低于模型組，提示鷹嘴豆提取物能糾正長期高脂飲食引起的胰島素敏感性降低，以醇提物組作用最顯著。
實驗四血清指標測定測定小鼠分組喂養(yǎng)100天時空腹甘油三酯(TG)、總膽固醇(TCh)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-Ch)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-Ch)水平，見圖8、9、10、11。鷹嘴豆提取物顯著降低長期高脂飲食引起的甘油三脂、膽固醇以及低密度脂蛋白膽固醇升高，以醇提物組作用最好，而對高密度脂蛋白膽固醇水平的影響不明顯。
實驗五喂養(yǎng)期間小鼠葡萄糖負荷后2h胰島素水平糖負荷2小時后與正常飲食組相比，高脂飲食組、鷹嘴豆食組和水提物組餐后2小時胰島素水平升高，而鷹嘴豆水醇提組升高不明顯。
權(quán)利要求
1.一種以下列方法制備的鷹嘴豆提取物在制備防治肥胖的食品中的應用a、鷹嘴豆醇提物的制備將碎成1-5mm的鷹嘴豆粉置于錐形瓶中，加入適量乙醇，用超聲波提取4-5次，每次2小時，濾紙過濾，合并濾液，控制溫度在40度以下，加壓濃縮得到醇提物；c、鷹嘴豆提取物制備將步驟a方法制得的鷹嘴豆提取物置于研缽內(nèi)研細，逐漸加入助懸劑DMSO研磨，再用超聲粉碎器進一步助懸，使均勻分散成混懸劑，制成10倍濃度的混懸液，其中DMSO的添加濃度為0.1％，臨用前用蒸餾水稀釋，制成飲用液，飲用液中的提取物濃度為4-8g/L。
2.一種以下列方法制備的鷹嘴豆提取物在制備防治肥胖食品中的應用b、鷹嘴豆水提物的制備將碎成1-5mm的鷹嘴豆粉置于燒杯中，加入適量去離子水等，用超聲波提取3次，每次3小時，紗布過濾，濾液進一步離心，取上清液，溫度低于60度，減壓濃縮上清液，得到水提物；c、鷹嘴豆提取物配制將步驟b方法制得的鷹嘴豆提取物置于研缽內(nèi)研細，逐漸加入助懸劑DMSO研磨，再用超聲粉碎器進一步助懸，使均勻分散成混懸劑，制成10倍濃度的混懸液，其中DMSO的添加濃度為0.1％，臨用前用蒸餾水稀釋，制成飲用液，飲用液中的提取物濃度為4-8g/L。
3.一種按權(quán)利要求1或所述的鷹嘴豆提取物在制備防治2型糖尿病的食品中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種鷹嘴豆提取物在制備防治肥胖和2型糖尿病的食品中的應用。本發(fā)明通過實驗檢測鷹嘴豆提取物對高脂食物喂養(yǎng)小鼠的影響，結(jié)果證實鷹嘴豆提取物能顯著降低長期高脂飲食引起的甘油三脂、膽固醇以及低密度脂蛋白膽固醇升高。在實驗中還發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆提取物能糾正長期高脂飲食引起的胰島素敏感性降低。
文檔編號A61P3/00GK1830464SQ20051002423
公開日2006年9月13日 申請日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者顧元駿, 楊穎 , 岳曉樺 申請人:駿神生物醫(yī)學(上海)有限公司, 顧元駿