專利名稱：一種絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)及其制備方法和在氣管缺損重建中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，機(jī)體在因炎癥、外傷、腫瘤或其他病變導(dǎo)致氣管大范圍受損、切除較長(zhǎng)段氣管的情況下，需修復(fù)缺損氣管。長(zhǎng)期以來(lái)，氣管軟骨缺損的修復(fù)問(wèn)題，一直困擾著臨床醫(yī)生。一期端端吻合術(shù)僅適合于局部缺損的修復(fù)，當(dāng)缺損長(zhǎng)度超過(guò)6.0cm時(shí)，由于吻合口張力高而易產(chǎn)生吻合口漏等嚴(yán)重并發(fā)癥。組織工程技術(shù)研究的突飛猛給氣管重建帶來(lái)新的希望，但自1994年初步嘗試后再無(wú)突破性進(jìn)展，仍處于實(shí)驗(yàn)和探索階段，仍有問(wèn)題亟待解決。許多學(xué)者嘗試應(yīng)用同種異體移植、自體組織移植以及人工材料替代物等方法，效果均不夠理想。人工氣管完善應(yīng)用更關(guān)鍵的是如何在人工氣管內(nèi)腔表面引入具有調(diào)節(jié)氣管粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)代謝作用的材料，促進(jìn)粘膜上皮爬行再生。在眾多的生物材料中，膠原被認(rèn)為是較理想的選擇。然而，膠原屬于異體動(dòng)物組織提取物，存在傳染病毒等疾病的潛在可能性，且制作過(guò)程復(fù)雜，而絲素屬于天然蛋白，來(lái)源豐富，價(jià)格適宜。國(guó)外學(xué)者研究了不同的人體細(xì)胞株在絲素蛋白膜上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明，絲蛋白和膠原蛋白一樣，可以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。
絲素蛋白是一種天然結(jié)構(gòu)性蛋白，主要由三種簡(jiǎn)單的氨基酸甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成，它們約占蛋白總量的85％。絲素膜在皮膚、口腔及眼睛等部位的生物相容性良好，抗原性不明顯，皮下埋植試驗(yàn)表明無(wú)明顯炎癥或占位現(xiàn)象發(fā)生。有研究表明由于絲素蛋白中不僅含有相當(dāng)比例的OH、COOH、NH2等帶極性基團(tuán)的氨基酸殘基，使再生絲素蛋白膜的親水性強(qiáng)；成纖維細(xì)胞因其膜表面富含纖維粘連蛋白、組蛋白等，與生物材料表面粘附作用的能力強(qiáng)，再生絲素膜表面所攜帶的結(jié)構(gòu)信息，顯然對(duì)成纖維細(xì)胞的粘附和增殖具有重要作用。另一方面還含有一定比例的帶正電荷的氨基酸殘基，這也為成纖維細(xì)胞在再生絲素膜表面的粘附和增殖創(chuàng)造了良好條件。
絲素蛋白有良好的生物相容性，無(wú)毒，無(wú)刺激性，在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用，如醫(yī)用絲素蛋白皮膚再生膜、隱形眼鏡、細(xì)胞培養(yǎng)基及人工腦膜的實(shí)驗(yàn)研究等等。但迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)絲素蛋白在氣管缺損重建方面應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)。本發(fā)明的另一目的是提供制備所述鈦網(wǎng)的方法。本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供所述鈦網(wǎng)在臨床氣管缺損重建中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用醫(yī)用鈦網(wǎng)作為支撐材料，以絲素蛋白為涂層，制成絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)復(fù)合體，所述的絲素蛋白濃度為6-12％(重量/體積)，所述鈦網(wǎng)孔隙不封閉。本發(fā)明利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)成纖維細(xì)胞和粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，能加速愈合，減少并發(fā)癥，又可以長(zhǎng)期或永久有效支撐管腔。
本發(fā)明絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)可用作臨床氣管缺損修補(bǔ)，能為探討絲素蛋白在促進(jìn)氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥的作用提供有意義的參考。
本發(fā)明所述的絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)通過(guò)下述方法和步驟制備1、制備絲素蛋白采用廢桑蠶生絲在NaHCO3(0.5wt％)水溶液中脫膠，將脫膠絲溶于9.3mol/L的LiBr水溶液中，攪拌至蠶絲完全溶解。過(guò)濾，除去未溶解的蠶絲及雜質(zhì)，得絲素蛋白鹽溶液，用去離子水透析除去溶液中的LiBr，得濃度為4％的絲蛋白，再濃縮，PEG透析，所得絲素蛋白溶液離心去除雜質(zhì)，留上清液。所得的絲素蛋白濃度為20％，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。通過(guò)稱重法測(cè)定絲素蛋白溶液的濃度，可根據(jù)需要稀釋為6-12％不同濃度的溶液，同時(shí)避免引起構(gòu)象的變化。
2、制備絲素涂層鈦網(wǎng)采用醫(yī)用鈦網(wǎng)(市購(gòu))制成與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物氣管相同弧度的、粗細(xì)相同的具有一定彈性的類氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)的形狀，環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌后，鈦網(wǎng)反復(fù)浸蘸于上述低溫(4攝氏度)保存的稀釋濃度為6-12％的絲素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反復(fù)6-10次，使其表面均勻涂布有絲素材料，并使鈦網(wǎng)孔隙不封閉，以上過(guò)程均無(wú)菌操作。
3、氣管缺損重建動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用清潔級(jí)新西蘭雄性大白兔25只(由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重2.3-2.5KG，平均2.4KG，兔齡均為3個(gè)月，隨機(jī)分為有絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)組(n＝12)、單純鈦網(wǎng)組(n＝12)。正常家兔(n＝1)作為對(duì)照。
結(jié)果1)有絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組所有家兔術(shù)后均無(wú)呼吸困難，術(shù)后4周、8周、12周分別取材，均見(jiàn)氣管重建處結(jié)構(gòu)理想，絲素鈦網(wǎng)表面覆蓋生長(zhǎng)半透明纖維組織，并且組織內(nèi)有微血管生長(zhǎng)見(jiàn)，且與周圍組織無(wú)粘連。
氣管內(nèi)窺鏡檢查，見(jiàn)氣管腔內(nèi)粘膜光滑，管腔無(wú)明顯狹窄，無(wú)疤痕及肉芽組織生長(zhǎng)。
氣管CT檢查或切取重建處氣管行CT檢查，均未見(jiàn)明顯氣管狹窄，CT僅有部分氣管粘膜極輕微局限性增厚，AIR STRUCTURE影像學(xué)重建，重建處氣管腔亦顯示無(wú)狹窄。
組織病理切片檢查見(jiàn)缺損重建處粘膜細(xì)胞組成與正常氣管粘膜無(wú)明顯差異，主要有纖毛柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等組成。
掃描電鏡檢查，8周時(shí)生長(zhǎng)良好，纖毛較長(zhǎng)、較密，但是方向性仍然稍差且比正常氣管粘膜纖毛短及稀疏，12周時(shí)恢復(fù)正常，與正常氣管粘膜纖毛無(wú)明顯差異。
2)單純鈦網(wǎng)重建組所有家兔術(shù)后均不同程度的并發(fā)頸部皮下氣腫，其中2例并發(fā)全身皮下氣腫，1例家兔于埋植術(shù)后5天及重建術(shù)后14天出現(xiàn)腹瀉，另外一例家兔在重建術(shù)后17天時(shí)，出現(xiàn)腹瀉，不進(jìn)食，逐漸消瘦，死亡。另有家兔術(shù)后并發(fā)頸部皮下腫塊，取材時(shí)見(jiàn)氣管重建處鈦網(wǎng)表面疤痕組織。
死亡家兔氣管內(nèi)窺鏡檢查，見(jiàn)氣管腔內(nèi)感染粘膿栓形成及重建處紅色炎性肉芽組織生長(zhǎng)，管腔明顯狹窄，有疤痕及肉芽組織生長(zhǎng)，有明顯的分泌物。
氣管CT檢查見(jiàn)氣管腔重度狹窄，甚至完全無(wú)腔隙，
組織病理學(xué)檢查顯示大量肉芽組織增生，及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜下纖維組織層比絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組粘膜下纖維組織層厚，纖毛較稀疏。
掃描電鏡檢查顯示與絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組相比纖毛更稀疏、短、方向性差、自凈功能差，表面有少許分泌物附著3)應(yīng)用SAS6.12統(tǒng)計(jì)軟件，用cmh卡方，評(píng)分方法為修正的ridit評(píng)分，并以時(shí)間因素分層檢驗(yàn)兩組重建氣管最狹窄處的增生組織的橫截面積的差異及相對(duì)應(yīng)處氣管的內(nèi)截面面積的差異；用確切概率法檢驗(yàn)兩組其他術(shù)后并發(fā)癥(窒息死亡；皮下氣腫；頸部感染)的差異。表1是術(shù)后并發(fā)癥“窒息死亡”對(duì)比。表2是術(shù)后并發(fā)頸部感染情況。表3是皮下氣腫情況。
表1窒息死亡 未出現(xiàn)窒息 合計(jì)絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組 0 11 11單純鈦網(wǎng)重建組 5 6 11合計(jì) 5 17 22確切概率法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(p＜0.05)。
表2頸部感染 頸部無(wú)感染 合計(jì)絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組 0 11 11單純鈦網(wǎng)重建組 2 9 11合計(jì) 2 20 22確切概率法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)顯著性(p＞0.05)。
表3出現(xiàn)皮下氣腫 無(wú)皮下氣腫 合計(jì)絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組 3 8 11單純鈦網(wǎng)重建組110 11合計(jì) 148 22確切概率法檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(p＜0.05＝。
4)使用16排螺旋CT(美國(guó)GE公司產(chǎn))AW4.0 work station進(jìn)行圖像分析，計(jì)算家兔重建氣管最狹窄處的增生組織的橫截面積以及相對(duì)應(yīng)處氣管的內(nèi)截面面積。表4是家兔重建氣管最狹窄處的增生組織的橫截面積(mm2)。表5是相對(duì)應(yīng)處氣管的內(nèi)截面面積。
表4

結(jié)果表明，絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組家兔重建氣管最狹窄處的增生組織的橫截面積最小值為1.24mm2，最大值為5.78mm2，平均為3.15±1.58mm2，中位數(shù)為3.35。
單純鈦網(wǎng)重建組家兔重建氣管最狹窄處的增生組織的橫截面積最小值為4.35mm2，最大值為28.56mm2，平均為18.15±7.85mm2，中位數(shù)為16.65。
兩組數(shù)據(jù)用cmh卡方，評(píng)分方法為修正的ridit評(píng)分，并以時(shí)間因素分層檢驗(yàn)兩組重建氣管最狹窄處的增生組織的橫截面積的差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性(p＜0.05)。
表5

結(jié)果表明，絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組家兔氣管重建處的內(nèi)截面積最小值為26.79mm2，最大值為29.69mm2，平均為28.37±0.86mm2。
單純鈦網(wǎng)重建組家兔氣管重建處的內(nèi)截面積最小值為26.31mm2，最大值為29.46mm2，平均為28.13±1.01mm2。
兩組數(shù)據(jù)以時(shí)間因素分層檢驗(yàn)兩組重建氣管處氣管的內(nèi)截面面積的差異，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無(wú)顯著性(p＝0.19＞0.05)，而且，時(shí)間分層因素檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異亦無(wú)顯著性(p＝0.35＞0.05)。
本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，絲素可以明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，成纖維細(xì)胞緊密附著在絲素表面，方向一致，且呈有極性的生長(zhǎng)，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示毛細(xì)血管和氣管粘膜細(xì)胞在絲素誘導(dǎo)生成的成纖維細(xì)胞表面生長(zhǎng)良好，無(wú)肉芽組織增生。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)絲素表面生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞并不是無(wú)限制增殖，而是具有一定的極性、層次和厚度，但是在不同部位和不同面積的絲素表面厚度完全不同。
本發(fā)明采用醫(yī)用鈦網(wǎng)作為支撐材料，既可以利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)成纖維細(xì)胞和粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，加速愈合，減少并發(fā)癥，又可以長(zhǎng)期或永久有效支撐管腔。與單純鈦網(wǎng)相比，帶有絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)用于家兔的氣管重建具有更多的優(yōu)點(diǎn)，由于絲素可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管的生長(zhǎng)，氣管前埋植兩周后的鈦網(wǎng)表面半透明的纖維組織完全膜閉所有網(wǎng)孔，此時(shí)用于氣管重建，可以完全封閉氣管壁，使其內(nèi)外不會(huì)相通，避免了皮下氣腫和局部感染的發(fā)生。氣管缺損邊緣正常氣管的粘膜便沿絲素涂層鈦網(wǎng)表面的薄層成纖維細(xì)胞表面生長(zhǎng)，及時(shí)快速地完全覆蓋支架管腔面，有效地防止了肉芽生長(zhǎng)、氣管狹窄及由于狹窄導(dǎo)致窒息死亡等并發(fā)癥的發(fā)生。組織學(xué)檢查顯示生長(zhǎng)覆蓋在材料表面的粘膜生長(zhǎng)良好，電鏡檢查顯示其纖毛方向性好，自凈功能與正常氣管粘膜無(wú)異，而且鈦網(wǎng)作為支架可以保持一定的彈性、長(zhǎng)度和足夠的硬度以對(duì)抗負(fù)壓，將絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)用于氣管重建未發(fā)現(xiàn)鈦網(wǎng)移位現(xiàn)象，材料表面的成纖維細(xì)胞與機(jī)體殘余氣管邊緣組織的生長(zhǎng)融合良好。
本發(fā)明采用絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)用于氣管重建，解決了在人工氣管內(nèi)腔表面引入具有調(diào)節(jié)氣管粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)代謝作用的材料的問(wèn)題，可以促進(jìn)粘膜上皮爬行，避免術(shù)后氣管再度狹窄，獲得了滿意的效果，具有理想氣管替代物的五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是具有高度生物相容性的合成材料；血管適宜在移植物內(nèi)生長(zhǎng)；具上皮組織或適宜于上皮組織生長(zhǎng)；有充分的長(zhǎng)度以滿足不同程度的缺損修復(fù)；具有足夠硬度以對(duì)抗負(fù)壓?？蛇M(jìn)一步推廣到臨床應(yīng)用于環(huán)行較大面積氣管組織缺損的重建。


圖1-3內(nèi)窺鏡檢測(cè)結(jié)果，其中a絲素涂層鈦網(wǎng)重建12周，b單純鈦網(wǎng)重建后肉芽增生，c單純鈦網(wǎng)重建12周時(shí)狹窄。
圖2是絲素涂層鈦網(wǎng)重建處粘膜纖毛，其中a×2000術(shù)后4周重建處，b×2000術(shù)后8周重建處，c×2000術(shù)后12周重建處，已恢復(fù)正常。
圖3是單純鈦網(wǎng)重建處粘膜纖毛，其中a×2000術(shù)后4周重建處，b×2000術(shù)后8周重建處，c×2000術(shù)后12周重建處。
圖4是絲素涂層鈦網(wǎng)重建CT檢查結(jié)果，其中a重建4周，b重建8周，c重建12周，d矢狀位重建，eAIR STRUCTURE顯示重建處氣管腔狹窄(箭頭指)。
圖5是單純鈦網(wǎng)重建CT檢查結(jié)果，其中a重建8周窒息，b重建12周狹窄，c冠狀位重建，d矢狀位重建，eAIR STRUCTURE顯示重建處氣管腔狹窄(箭頭指)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1制備絲素蛋白采用廢桑蠶生絲在100℃的NaHCO3(0.5wt％)水溶液中脫膠45分鐘，并將脫膠絲溶于9.3mol/L的LiBr水溶液中，在45℃下不斷攪拌約2個(gè)小時(shí)至蠶絲完全溶解。用八層醫(yī)用紗布過(guò)濾，除去未溶解的蠶絲及雜質(zhì)，得到的絲素蛋白鹽溶液，用去離子水透析四天以除去溶液中的LiBr，透析袋的截流分子量為12,000～14,000Da。所制備的絲蛋白濃度為4％左右，進(jìn)一步對(duì)其濃縮，繼續(xù)用10％的PEG透析一天，透析好的絲素蛋白溶液以6000rpm轉(zhuǎn)速離心15分鐘去除雜質(zhì)，留上層清液。所得的絲素蛋白濃度為20％，作為儲(chǔ)存液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍㄟ^(guò)稱重法測(cè)定絲素蛋白溶液的濃度，可根據(jù)需要可稀釋為6-12％不同濃度的溶液。透析好的樣品要盡量避免強(qiáng)烈攪拌和震蕩以及接觸有機(jī)溶劑等，以防引起構(gòu)象的變化，稀釋過(guò)程中也要盡量避免攪拌過(guò)于劇烈。
實(shí)施例2制備絲素涂層鈦網(wǎng)采用醫(yī)用鈦網(wǎng)(市購(gòu))制成與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔氣管相同弧度的，粗細(xì)相同的具有一定彈性的類氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)的形狀，環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌后，鈦網(wǎng)反復(fù)浸蘸于上述低溫保存的稀釋濃度為6％的絲素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反復(fù)6-10次，使其表面均勻涂布有絲素材料，并且保持鈦網(wǎng)孔隙不封閉，以上過(guò)程均無(wú)菌操作。
實(shí)施例3采用醫(yī)用鈦網(wǎng)(市購(gòu))制成與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔氣管相同弧度的，粗細(xì)相同的具有一定彈性的類氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)的形狀，環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌后，鈦網(wǎng)反復(fù)浸蘸于上述低溫保存的稀釋濃度為12％的絲素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反復(fù)6-8次，使其表面均勻涂布有絲素材料，并且保持鈦網(wǎng)孔隙不封閉，以上過(guò)程均無(wú)菌操作。
實(shí)施例4采用醫(yī)用鈦網(wǎng)(市購(gòu))制成與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物家兔氣管相同弧度的，粗細(xì)相同的具有一定彈性的類氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)的形狀，環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌后，鈦網(wǎng)反復(fù)浸蘸于上述低溫保存的稀釋濃度為10％的絲素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反復(fù)8次，使其表面均勻涂布有絲素材料，并且保持鈦網(wǎng)孔隙不封閉，以上過(guò)程均無(wú)菌操作。
實(shí)施例5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)25只清潔級(jí)新西蘭雄性大白兔(由復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重2.3-2.5KG，平均2.4KG，兔齡均為3個(gè)月，隨機(jī)分為絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)組(n＝12)、單純鈦網(wǎng)組(n＝12)。正常家兔(n＝1)作為對(duì)照。
1)絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組預(yù)置埋植術(shù)后7天及重建術(shù)后12天，每日兩次肌肉注射青霉素10萬(wàn)u/次。術(shù)后三天內(nèi)極少許進(jìn)食，第五天進(jìn)食量基本正常，術(shù)后體溫正常，基本在39.3-39.5℃左右，3例術(shù)后出現(xiàn)輕微頸部皮下氣腫，該組全部家兔術(shù)后無(wú)感染并發(fā)癥出現(xiàn)，一例家兔重建術(shù)后14天時(shí)，出現(xiàn)腹瀉，給予慶大霉素1萬(wàn)單位肌肉注射/天，3天后腹瀉停止，但是不進(jìn)食，逐漸消瘦后死亡，所有家兔術(shù)后均無(wú)呼吸困難，術(shù)后1周內(nèi)有輕度的喘鳴音，一周后逐漸消失，術(shù)后4周、8周、12周分別取材，均可見(jiàn)氣管重建處結(jié)構(gòu)理想，絲素鈦網(wǎng)表面覆蓋生長(zhǎng)半透明纖維組織，并且這層薄薄的組織內(nèi)有微血管生長(zhǎng)見(jiàn)，且與周圍組織無(wú)粘連。
氣管內(nèi)窺鏡檢查術(shù)后4周、8周、12周時(shí)檢查，可見(jiàn)氣管腔內(nèi)粘膜光滑，管腔無(wú)明顯狹窄，無(wú)疤痕及肉芽組織生長(zhǎng)，在4周時(shí)粘膜表面有少許分泌物。
家兔麻醉固定后氣管CT檢查或切取重建處氣管行CT檢查所有家兔術(shù)后4周、8周、12周氣管CT檢查均未見(jiàn)明顯氣管狹窄，CT僅有部分氣管粘膜極輕微局限性增厚，AIR STRUCTURE影像學(xué)重建，重建處氣管腔亦顯示無(wú)狹窄。
組織病理切片檢查可見(jiàn)缺損重建處粘膜細(xì)胞組成與正常氣管粘膜無(wú)明顯差異，主要有纖毛柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等組成，粘膜表面纖毛生長(zhǎng)情況術(shù)后4周時(shí)生長(zhǎng)較好，部分區(qū)域密度稍稀疏，8周時(shí)覆蓋良好，12周時(shí)基本正常。粘膜下薄層成纖維細(xì)胞有序生長(zhǎng)，可見(jiàn)未完全吸收的絲素材料生物相容性好，絲素周圍成纖維組織生長(zhǎng)，偶見(jiàn)少許單核細(xì)胞，抗原反應(yīng)不明顯或無(wú)明顯異物排斥反應(yīng)。與正常的氣管病理切片(HE×400)相比，前者粘膜下多一層薄層纖維組織，且毛細(xì)血管豐富。
掃描電鏡檢查術(shù)后4周時(shí)纖毛稀疏、較短，方向性差，自凈功能差，表面有較多分泌物附著，部分區(qū)域裸露無(wú)纖毛；8周時(shí)生長(zhǎng)良好，纖毛較長(zhǎng)、較密，但是方向性仍然稍差且比正常氣管粘膜纖毛短及稀疏，自凈功能較好，表面無(wú)明顯分泌物；12周時(shí)恢復(fù)正常，與正常氣管粘膜纖毛無(wú)明顯差異。
2)單純鈦網(wǎng)重建組預(yù)置埋植術(shù)后7天及重建術(shù)后12天，每日兩次肌肉注射青霉素10萬(wàn)u/次，術(shù)后第三天開(kāi)始少許進(jìn)食，第7天進(jìn)食量基本正常，術(shù)后有2例家兔術(shù)后第2天至4天耳后體溫40.5℃左右，其中1例術(shù)后第4天，因?yàn)闅夤軆?nèi)感染粘膿栓形成及重建處肉芽共同導(dǎo)致窒息死亡，另外1例，術(shù)后一周頸前部皮下感染形成瘺管，其他家兔術(shù)后體溫正常，基本在39.3-39.5℃左右。還有4例家兔分別于術(shù)后5天、7天、17天、60天各窒息死亡一只。該組所有家兔術(shù)后均不同程度的并發(fā)頸部皮下氣腫，其中2例并發(fā)全身皮下氣腫，最高達(dá)每天自其背部皮下抽出氣體約300ml，1例家兔分別于埋植術(shù)后5天及重建術(shù)后14天再次出現(xiàn)腹瀉，予慶大霉素肌肉注射1萬(wàn)單位/天，3天后腹瀉停止，并逐漸開(kāi)始進(jìn)食，恢復(fù)健康，另外一例家兔在重建術(shù)后17天時(shí)，出現(xiàn)腹瀉，給予慶大霉素1萬(wàn)單位/天肌肉注射2天后腹瀉停止，但不進(jìn)食，逐漸消瘦，再經(jīng)過(guò)3天后死亡。另有一例家兔術(shù)后并發(fā)頸部皮下腫塊，約2cm直徑，球形有光滑的包膜。取材時(shí)可見(jiàn)氣管重建處鈦網(wǎng)表面疤痕組織。
術(shù)后4天時(shí)窒息死亡的家兔氣管內(nèi)窺鏡檢查，可見(jiàn)氣管腔內(nèi)感染粘膿栓形成及重建處紅色炎性肉芽組織生長(zhǎng)，管腔明顯狹窄，另外4例分別于術(shù)后5天、7天、17天、60天各窒息死亡的家兔，氣管內(nèi)窺鏡檢查可見(jiàn)氣管腔內(nèi)明顯的不同程度的肉芽組織形成，管腔非常狹窄；術(shù)后4周、8周、12周時(shí)檢查，可見(jiàn)氣管腔內(nèi)粘膜不光滑，管腔有不同程度的狹窄，有疤痕及肉芽組織生長(zhǎng)，4周時(shí)氣管粘膜表面有明顯的分泌物。
術(shù)后包括窒息死亡的家兔CT檢查可見(jiàn)氣管腔重度狹窄，甚至完全無(wú)腔隙，術(shù)后4周、8周、12周氣管CT檢查均可見(jiàn)不同程度的氣管狹窄，AIR STRUCTURE重建亦顯示重建處氣管腔狹窄。
氣管內(nèi)增生組織組織病理學(xué)切片檢查術(shù)后窒息死亡的5只家兔，可見(jiàn)大量肉芽組織增生，及少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；重建術(shù)后缺損重建處有纖維疤痕組織增生，其他細(xì)胞組成與正常氣管粘膜無(wú)明顯差異，主要有纖毛柱狀細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等組成，粘膜表面纖毛生長(zhǎng)情況術(shù)后4周時(shí)疤痕組織表面纖毛生長(zhǎng)差，密度稀疏；8周時(shí)疤痕組織表面纖毛生長(zhǎng)稍好，但是差于絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組；12周時(shí)可見(jiàn)粘膜下纖維組織層比絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組粘膜下纖維組織層厚外，纖毛也較稀疏。
掃描電鏡檢查家兔管腔面可見(jiàn)氣管粘膜纖毛生長(zhǎng)情況術(shù)后4周時(shí)與絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組相比纖毛更稀疏、短、方向性差、自凈功能差，表面有少許分泌物附著；8周時(shí)生長(zhǎng)稍好，纖毛稍長(zhǎng)、稍密，但是仍然差于絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組，部分區(qū)域尚未完全纖毛覆蓋，并且方向性欠佳；12周時(shí)仍未完全恢復(fù)正常，與正常氣管粘膜、絲素涂層的鈦網(wǎng)重建組相比有一定的差異，方向性沒(méi)有后兩組好，纖毛短于后兩組。
權(quán)利要求
1.一種絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)，其特征是采用醫(yī)用鈦網(wǎng)作支撐材料，以絲素蛋白為涂層，制成絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)復(fù)合體，所述的絲素蛋白重量/體積濃度為6-12％，所述鈦網(wǎng)孔隙不封閉。
2.按權(quán)利要求1所述的絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)，其特征是所述的絲素蛋白重量/體積濃度為10％。
3.按權(quán)利要求1所述的絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)，其特征是所述的鈦網(wǎng)為氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)形狀。
4.權(quán)利要求1所述的絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)的制備方法，其特征是通過(guò)下述方法和步驟1)制備絲素蛋白采用廢桑蠶生絲在NaHCO3 0.5wt％水溶液中脫膠，將脫膠絲溶于9.3mol/L的LiBr水溶液，攪拌至蠶絲溶解。過(guò)濾，除去未溶解的蠶絲及雜質(zhì)，得絲素蛋白鹽溶液，去離子水透析除去溶液中的LiBr，再濃縮，PEG透析，離心，留上清液，得濃度為20％絲素蛋白，置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，稱重法測(cè)定絲素蛋白溶液濃度，根據(jù)需要稀釋為6-12％不同濃度的溶液，避免引起構(gòu)象的變化。2)制備絲素涂層鈦網(wǎng)采用醫(yī)用鈦網(wǎng)制成與氣管相同弧度的、粗細(xì)相同的具有一定彈性的類氣管環(huán)樣結(jié)構(gòu)的形狀，環(huán)氧乙烷熏蒸滅菌后，鈦網(wǎng)反復(fù)浸蘸于上述低溫保存的稀釋濃度為6-12％的絲素溶液，取出放入烘箱60度烘干，反復(fù)6-10次，使其表面均勻涂布有絲素材料，并使鈦網(wǎng)孔隙不封閉。3)氣管缺損重建動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用清潔級(jí)新西蘭雄性大白兔25只，隨機(jī)分組為有絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)組、單純鈦網(wǎng)組和正常對(duì)照組。
5.權(quán)利要求1所述的絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)在制備氣管缺損重建中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)及其制備方法和在氣管缺損重建中應(yīng)用。本發(fā)明采用醫(yī)用鈦網(wǎng)作為支撐材料，以絲素蛋白為涂層，制成絲素蛋白涂層鈦網(wǎng)復(fù)合體。本發(fā)明利用絲素的良好生物相容性和促進(jìn)成纖維細(xì)胞和粘膜細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，能加速愈合，減少并發(fā)癥，又可以長(zhǎng)期或永久有效支撐管腔。本發(fā)明絲素蛋白涂層的鈦網(wǎng)可用作臨床氣管缺損修補(bǔ)，能為探討絲素蛋白在促進(jìn)氣管粘膜修復(fù)及臨床重建氣管缺損、減少重建氣管術(shù)后并發(fā)癥的作用提供有意義的參考。
文檔編號(hào)A61F2/04GK1739809SQ20051002746
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2005年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月1日
發(fā)明者趙霞, 倪玉蘇, 周梁, 嚴(yán)文洪, 邵正中, 陳新, 曹正兵 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院, 復(fù)旦大學(xué)