專利名稱：葛根素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葛根素的一種新的用途，尤其是在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應用。
背景技術：
葛根素(puerarin)是從豆科植物野葛(puerarialobata)甘葛藤(puerarin thomsonii)根中提取的一種黃酮苷。在國內(nèi)，1974年方起程等成功地提取了葛根素，1993年葛根素被衛(wèi)生部批準用于臨床。作為改善心腦血管循環(huán)的新藥，因其毒性低，安全范圍廣，療效好而成為臨床上應用較多的藥物。
子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)是指有功能的子宮內(nèi)膜出現(xiàn)于子宮腔內(nèi)壁以外的部位。它引起的繼發(fā)性痛經(jīng)、不孕、慢性盆腔痛等癥狀嚴重影響患者的生活質量。盡管子宮內(nèi)膜異位癥為婦科良性疾病，但它具有侵襲性、廣泛種植、易復發(fā)的特征，與惡性腫瘤十分相似。子宮內(nèi)膜異位癥是育齡婦女的一個常見病和多發(fā)病，發(fā)病率高達15％，并且發(fā)病率呈逐年上升趨勢。雖然子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)現(xiàn)已有100多年的歷史，并且多年來對子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理進行了深入廣泛的研究，但其確切的發(fā)病機理還不十分清楚。由于病因不明，目前治療方法有多種，尚無一種藥物能達到根治效果。因此，積極探索有效的治療方法具有十分重要的意義。
臨床和實驗研究證實，子宮內(nèi)膜異位癥是激素依賴性疾病。子宮內(nèi)膜異位癥患者初潮前無發(fā)病，絕經(jīng)后異位的內(nèi)膜可逐漸萎縮被吸收，如使用雌激素替代療法，此病還會復發(fā)。而切除卵巢或服用danozol使機體處于低雌激素狀態(tài)，病灶可明顯縮小，療程結束后隨著體內(nèi)雌激素水平的恢復，有的病人也會復發(fā)?？梢娮訉m內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病。異位內(nèi)膜可隨卵巢周期性變化而出現(xiàn)周期性增生、分泌變化，但變化不一定與子宮腔內(nèi)膜變化同步；卵巢雌/孕激素的周期性分泌，對異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜起同樣的作用，但雌二醇可能起主導作用，特別是中期的雌二醇峰在刺激子宮內(nèi)膜增厚的同時，也可刺激異位的內(nèi)膜生長。因此子宮內(nèi)膜異位癥的激素治療一般采用假孕療法和假絕經(jīng)療法，能夠取得一定的療效。但由于此二醇水平的降低，導致患者出現(xiàn)類似更年期樣的改變，帶來了比較明顯的副作用。同時此類藥物價格昂貴，且長期服用導致肝功能損害，停藥后又易復發(fā)，這些缺點限制了這些藥物的應用。
植物雌激素為一系列來自植物的復合物，存在于大部分植物、水果和蔬菜中，植物雌激素的結構和甾體類激素相似，可與體內(nèi)的雌激素受體結合，但其活性較人類雌激素弱102-105倍，有雌激素和抗雌激素雙重效應，如何發(fā)揮何種效應取決于內(nèi)源性雌激素水平和植物雌激素的種類和數(shù)量。葛根素是中藥葛根的主要有效成分，是一種植物雌激素，具有弱雌激素樣活性的化合物，能夠和內(nèi)源性雌激素競爭性地與雌激素受體結合形成雌激素受體復合物，占據(jù)了受體結合部位，阻止了體內(nèi)雌激素分子與受體相結合，因而有效地減弱了靶細胞對雌激素的應答，而起到了抗雌激素作用。另外，植物雌激素與雌激素受體結合后，刺激性激素結合球蛋白的產(chǎn)生，并抑制酪氨酸酶和雌激素合成酶的活性，從而減輕雌激素的促細胞的增殖作用。
同時實驗證實，葛根素的急性和亞急性毒性遠小于合成的雌激素，不且不會在體內(nèi)殘留，保證了人體健康。由于子宮內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病，而葛根素具有雌激素樣和抗雌激素樣作用，且其作用具有靶向性，能否將葛根素用于治療子宮內(nèi)膜異位癥，以拓展葛根素的應用領域，是人們所十分關注的課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術問題是公開葛根素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應用，以拓展葛根素的應用領域，同時克服現(xiàn)有技術存在的上述缺陷。
發(fā)明人驚訝的發(fā)現(xiàn)，葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥具有十分顯著的療效，可以用于制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物。發(fā)明人同時發(fā)現(xiàn)，中小劑量葛根素(用藥劑量大鼠灌胃200mg/kg和60mg/kg體重天)對子宮內(nèi)膜異位癥具有明顯的治療作用，動物試驗證明，本發(fā)明的葛根素大鼠靜脈注射用量在200mg/kg時，沒有任何毒副作用所說的葛根素，采用市售產(chǎn)品，如陜西賽德高科生物股份有限公司的產(chǎn)品。
可以將葛根素與醫(yī)藥學上可接受的載體以組合物的形式，施加于需要治療的對象，一般用量為60～200mg/公斤體重天，具體可綜合各種情況等進行變化。
所說的載體是指藥學領域常規(guī)的藥物載體，如稀釋劑水等，葛根素與上述載體構成的組合物，組合物中，優(yōu)選的含量為10～50mg/ml，可以通過口服的形式施加于需要這種治療的對象。
動物試驗證明，中小劑量葛根素對子宮內(nèi)膜異位癥具有明顯的治療作用，更重要的是葛根素與danazol相比，具有無可比擬的安全性。效果比較好，基本不會造成不良影響。因而葛根素具有治療子宮內(nèi)膜異位癥的前景。
為了更好地理解本發(fā)明的實質，以下將用葛根素的藥理試驗及其結果來說明其在制藥領域中的新用途。
具體實施例方式
實施例1水溶劑取1000ml無熱源去離子的純凈蒸餾水將30000mg葛根素溶解，混合均勻，消毒配置成30mg/ml的水溶劑，裝瓶制成成品。
實施例21材料1.1實驗動物健康、性成熟未交配的SD雌性大鼠90只，鼠齡70d-80d，每只大鼠體重160-180g。大鼠由復旦大學醫(yī)學院動物中心提供，由本院動物實驗中心動物房，采用12h明12h暗交替飼養(yǎng)。
1.2主要器材Forma725型-80℃低溫冰箱(美國)，BCD-248普通冰箱(上凍青島海爾集團)，Olympus PM-10AD型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，高速低溫離心機(德國Hereaus公司)，Access全自動微?；瘜W發(fā)光分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，Array 360特定蛋白分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)，勻漿器，濕盒，恒溫溫箱，浸蠟箱，包埋箱，切片機，烘箱等。
1.3主要試劑細胞色素芳香化酶P450單克隆抗體(購自北京中山生物工程公司)，雌激素受體α單克隆抗體(購自Santa Cruz公司)，兔二抗(購自日本NICHIREI公司)，葛根素(≥98％，購自陜西賽德高科生物股份有限公司)；danazol(上海華聯(lián)制藥有限公司，100mg/粒)，TES緩沖液，全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析儀(美國)，DAB，Tris(PH7.6)，1％鹽酸，PBS緩沖液，10％福爾馬林，甲醇，乙醇，脫鈣劑，二甲苯，石蠟，蘇木素-伊紅(HE)染色劑等。
1.4方法1.4.1子宮內(nèi)膜異位癥模型的建立子宮內(nèi)膜異位癥模型根據(jù)(俞超芹，劉玉環(huán)，彭新萍，等．內(nèi)異方對子宮內(nèi)膜異位癥IL-6、IL-10的調節(jié)作用．第二軍醫(yī)大學學報，1999，20(9)621)文獻俞超芹等方法制作2％戊巴比妥鈉0.3ml腹腔麻醉，開腹找到子宮，剪下右側子宮長約3cm，行兩端結扎包埋術，剝離剪下的子宮內(nèi)膜，切成3塊4mm×4mm大小的內(nèi)膜片段，用4/0腸線分別固定于對側子宮的中段、Y型分叉處和卵巢附近。另設假手術組，即按上述方法剪下右側子宮長約3cm，行端端結扎包埋術，將3塊4mm×4mm大小的自體脂肪用4/0無損傷縫線分別固定于對側子宮的中段、Y型分叉處和卵巢附近。4周后麻醉剖腹探查，見移植的內(nèi)膜組織體積增大，呈透明結節(jié)狀、囊狀，出現(xiàn)澄清液體集聚，被結締組織覆蓋并有血管形成。
1.4.2分組處理將模型大鼠隨機分為5組1)非治療組雙蒸水灌胃，每日2ml/只；2)實施例1的葛根素水溶劑大劑量組灌胃，每日600mg/kg；3)實施例1的葛根素水溶劑中劑量組灌胃，每日200mg/kg；4)實施例1的葛根素水溶劑小劑量組灌胃，每日60mg/kg；5)danazol組灌胃，每日400mg/kg，共4周；另外，假手術組雙蒸水灌胃，每日2ml/只；以上6組均在同等條件下飼養(yǎng)4周。在飼養(yǎng)過程中丟失10只大鼠，病死2只，灌胃不當死亡4只，故實驗結束時余74只大鼠。
2觀察指標與方法2.1子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、異位灶重量以及處理組對異位灶的抑制率1)子宮系數(shù)＝子宮濕重mg/體重kg2)卵巢系數(shù)＝卵巢濕重mg/體重kg3)異位灶生長抑制率＝(非治療組平均異位灶重量-治療組平均異位灶重量)/非治療組平均異位灶重量×100％2.2肝、腎、骨骼以及子宮內(nèi)膜、卵巢、異位內(nèi)膜組織的病理形態(tài)學2.2.1取材和處理根據(jù)陰道涂片，分別于治療結束動情前期斷頭處死。
1)立即取部分肝、腎、卵巢、子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織，用10％福爾馬林固定。
2)另取部分卵巢、子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織立即凍存于-80℃低溫冰箱中。
3)用脫鈣劑將骨骼脫鈣48小時后，自來水沖洗2小時，再次置入10％福爾馬林中固定。
2.2.2石蠟標本制備將10％福爾馬林固定的肝、腎、骨骼、卵巢、子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織制成病理切片(第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院病理科協(xié)助完成)。
1)第一步脫水將組織置于70％乙醇浸泡30分鐘，然后置于90％乙醇浸泡30分鐘，其次置于95％乙醇浸泡30分鐘，再次置于95％乙醇浸泡30分鐘，最后置于100％乙醇浸泡30分鐘。
2)第二步透明將脫水后的標本置于二甲苯浸泡30分鐘，重復兩次，直至肉眼觀察組織呈透明狀，完成透明。
3)第三步浸蠟將透明后的標本放入石蠟，再置于浸蠟箱，溫度調至56～58℃進行浸蠟處理30分鐘，重復三次，完成浸蠟。
4)第四步包埋將浸蠟處理過的組織取出放入充滿熔融石蠟的包埋框，使其冷卻從而形成鑄塊，完成包埋。
5)第五步切片用AO切片機將鑄塊切成5微米的切片。
2.2.3蘇木素-伊紅染色1)將切片脫蠟至水。
2)甲醇固定15分鐘。
3)95％乙醇處理30秒。
4)自來水30秒。
5)蘇木素染液染色5分鐘。
6)自來水2分鐘。
7)75％鹽酸乙醇溶液分化30秒。
8)自來水2分鐘。
9)溫熱水(50℃)5分鐘。
10)單蒸水1分鐘。
11)95％乙醇溶液1分鐘。
12)酸化伊紅乙醇2分鐘。
13)95％酒精和純酒精脫水各2次，每次2分鐘。
14)二甲苯透明10秒。
15)中性樹膠封片，完成封固。
16)干燥后鏡下觀察，隨機挑選視野，拍照。
2.3血清磷、鈣含量測定2.3.1取材斷頭后立即用不抗凝試管收集血液，室溫靜置2小時后，3000r/分鐘離心15分鐘，取血清。
2.3.2實驗方法用偶氮砷III比色自動生化分析儀測定血清鈣的含量，用紫外分光光度自動生化分析儀測定血清磷的含量(長海醫(yī)院檢驗科協(xié)助完成)。
2.4卵巢、子宮內(nèi)膜、異位子宮內(nèi)膜與血清雌二醇水平測定2.4.1取材取卵巢、子宮內(nèi)膜與異位內(nèi)膜組織標本，稱重，將組織剪碎，加入冰TES緩沖液1ml，4℃冰浴45s，4℃條件下105000g/分鐘離心60分鐘，分別吸取上清液，置低溫下待側。
2.4.2實驗方法用全自動微粒子化學發(fā)光免疫分析法檢測血清、子宮、卵巢和異位灶中雌二醇的水平(中國科學院上海藥物研究所協(xié)助完成)。
2.5雌激素受體α、細胞色素芳香化酶P450免疫組織化學測定2.5.1實驗方法1)分別將子宮內(nèi)膜、卵巢和異位灶石蠟切片用二甲苯脫臘后，用75％乙醇固定30分鐘。
2)用含0.5％過氧化氫的甲醇處理后，進行抗原修復。
3)分別與稀釋成1∶100的抗體-鼠抗人ERα單克隆抗體、鼠抗人芳香化酶單克隆抗體-在4℃孵育15小時。
4)Tris(PH7.6)沖洗3次后，滴加稀釋為1∶500的過氧化物酶標記的兔抗體γ-球蛋白(二抗)，濕盒室溫下孵育4h。
5)用Tris(PH7.6)沖洗3次，DAB-H202顯色10分鐘后，置入自來水中終止反應。
6)蘇木素中襯染1分鐘，自來水沖洗。
7)用1％鹽酸分化后，自來水沖洗。
8)酒精梯度脫水，吹干。
9)滴加樹膠封片。
10)光學顯微鏡下隨機選取視野，計數(shù)每個視野的細胞染色數(shù)目。并計算細胞的染色率。
11)PBS代替I抗作陰性對照，已知陽性片為陽性對照。
2.5.2結果判定方法陽性染色為棕黃色顆粒，定位于細胞漿中，觀察染色切片中10個具有代表意義的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞中的陽性細胞數(shù)，取平均數(shù)作為結果。其中陽性染色細胞數(shù)＜25％為(+)，25％-50％為(++)，＞50％為(+++)，無陽性細胞為(-)。
2.6統(tǒng)計學處理用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計。
細胞色素芳香化酶P450和ERα陽性率的數(shù)據(jù)屬構成比資料，采用X2檢驗，計量資料采用單因素方差分析。
結果1子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、異位灶重量以及處理組對異位灶的抑制率表1子宮系數(shù)、卵巢系數(shù)、異位內(nèi)膜重量以及處理組對異位內(nèi)膜的抑制率(x±s)

與非治療組相比，#P＜0.001。
檢驗結果提示葛根素大、中、小劑量組、danazol組、假手術組及非治療組子宮系數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。葛根素大、中、小劑量組、danazol組、假手術組及非治療組卵巢系數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。葛根素大、中、小劑量組異位灶重量均顯著低于非治療組(P＜0.001)，但與danazol組之間均無顯著差異(P＞0.05)。而葛根素小劑量組異位灶重量低于其它治療組，但統(tǒng)計學上無明顯差異(P＞0.05)。大、中、小劑量的葛根素和danazol對異位灶均有較強的抑制作用，但各治療組之間的抑制作用無明顯差異(P＞0.05)。
2肝、腎和骨骼病理形態(tài)學2.1肝臟1)假手術組小葉結構完好，肝竇清晰，肝細胞呈放射性排列，大小均勻，單核，核漿比例正常，膽管上皮細胞呈立方型。
2)葛根素大劑量組與假手術組基本相似。
3)葛根素中劑量組與假手術組基本相似。
4)葛根素小劑量組與假手術組基本相似。
5)非治療組與假手術組基本相似。
6)danazol組肝細胞脂肪樣變性，胞漿透明度增加，細胞胞漿不清，部分細胞核崩解，肝板破壞，匯管區(qū)增粗。
2.2腎臟1)假手術組腎盂上皮細胞呈假復層(適合功能要求)，上皮完整。
2)葛根素大、中、小劑量組、非治療組以及danazol組與假手術組腎臟形態(tài)無明顯改變。
2.3骨骼1)假手術組骨小梁粗壯，排列整齊并連接成網(wǎng)，間隙較小，形態(tài)結構完整，骨小梁密度、面積正常，無減少。
2)非治療組與假手術組基本相似。
3)葛根素大劑量組骨小梁變細，骨皮質變薄，形態(tài)結構性差，有扭曲和斷裂，小梁間間隙增大，骨小梁密度和面積減少。
4)葛根素中劑量組骨小梁稍細，排列尚整齊并連接成網(wǎng)，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大，骨小梁密度、面積無明顯減少。
5)葛根素小劑量組與假手術組基本相似。
6)danazol組骨小梁稍細，排列尚整齊并連接成網(wǎng)，部分區(qū)域骨小梁間隙略增大，骨小梁密度、面積無明顯減少。
3血清磷、鈣含量表2血清磷、鈣含量(x±s，n＝6，mmol/ml)

與假手術組相比*P＜0.03；與葛根素小劑量組相比#P＜0.05。
檢驗結果提示葛根素大、中、小劑量組、danazol組、假手術組以及非治療組之間血清磷含量均無顯著差異(P＞0.05)；葛根素大劑量組的血清鈣含量與假手術組有顯著差異(P＜0.03)，與非治療組和danazol組相比血清鈣含量無明顯差異(P＞0.05)；葛根素中、小劑量組血清鈣含量與假手術組、非治療組比較均無顯著差異(P＞0.05)；葛根素大劑量組、danazol組血清鈣的含量明顯少于葛根素小劑量組(P＜0.05)；葛根素中劑量組血清鈣的含量與葛根素小劑量組、danazol組比較無顯著差異(P＞0.05)。4血清、子宮內(nèi)膜、卵巢及異位內(nèi)膜中雌二醇水平表3血清、子宮內(nèi)膜、卵巢及異位內(nèi)膜中的雌二醇水平(x±s，n＝6，pg/ml)

與非治療組相比，△P＜0.05；與非治療組相比，#P＜0.001；與非治療組相比，*P＜0.01；與假手術組相比，▲P＜0.001。
檢驗結果提示非治療組血清中雌二醇水平顯著高于假手術組和其他治療組(P＜0.003)，葛根素大劑量組的血清雌二醇水平顯著降低，明顯低于假手術組(P＜0.001)，葛根素中、小劑量組以及danazol組的血清雌二醇水平也明顯低于非治療組，但與假手術組相比無明顯差異(P＞0.05)。非治療組與其他各組之間的子宮內(nèi)膜雌二醇水平均無顯著差異(P＞0.05)。非治療組卵巢雌二醇水平與假手術組之間無明顯差異(P＞0.05)，葛根素三個劑量組以及danazol組的卵巢雌二醇水平明顯下降，且與非治療組、假手術組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而葛根素三個劑量組之間以及與danazol組的卵巢雌二醇水平相比均無明顯差異(P＞0.05)。葛根素三個劑量組及danazol組異位內(nèi)膜中雌二醇水平與非治療組相比均明顯下降(P＜0.05)，葛根素三個劑量組之間的異位內(nèi)膜中雌二醇水平也無明顯差異(P＞0.05)。非治療組的異位內(nèi)膜中雌二醇水平明顯高于子宮內(nèi)膜雌二醇水平(P＜0.01)。
5卵巢、子宮內(nèi)膜組織形態(tài)觀察5.1卵巢組織形態(tài)1)假手術組鏡下見多個黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細胞呈多層(多為6-8層)，形態(tài)完整、排列整齊，卵泡膜細胞呈梭形排列。
2)葛根素大劑量組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術組基本相似。
3)葛根素中劑量組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術組基本相似。
4)葛根素小劑量組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術組基本相似。
5)非治療組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術組基本相似。
6)danazol組卵巢形態(tài)均無明顯改變，與假手術組基本相似。
5.2在位子宮內(nèi)膜組織形態(tài)1)假手術組在位內(nèi)膜上皮細胞形態(tài)規(guī)則，呈正常高柱狀，內(nèi)膜腺體數(shù)量較多，腺上皮細胞和間質細胞形態(tài)規(guī)則。
2)葛根素大劑量組內(nèi)膜上皮細胞發(fā)生腫脹，出現(xiàn)空泡、變性。內(nèi)膜腺體直徑小，數(shù)量少，間質細胞也少，內(nèi)膜上皮較薄。
3)葛根素中劑量組在位內(nèi)膜上皮細胞形態(tài)規(guī)則，上皮呈正常高柱狀，內(nèi)膜腺體、腺上皮細胞以及間質細胞基本沒改變。
4)葛根素小劑量組與假手術組基本相似。
5)非治療組內(nèi)膜上皮細胞層次較亂，上皮增生，內(nèi)膜腺體、腺上皮細胞以及間質細胞基本沒改變。
6)danazol組在位內(nèi)膜上皮細胞呈扁平立方形，并且出現(xiàn)了較多的上皮細胞殘跡，內(nèi)膜腺體數(shù)量少，間質細胞少，內(nèi)膜上皮較薄。
5.3異位子宮內(nèi)膜組織形態(tài)1)非治療組異位內(nèi)膜上皮細胞形態(tài)規(guī)則，呈正常高柱狀，內(nèi)膜腺體較多，但直徑較小，間質細胞較多。
2)葛根素大劑量組異位內(nèi)膜腺上皮細胞形態(tài)改變，發(fā)生腫脹，并出現(xiàn)空泡、變性，間質細胞形態(tài)改變，數(shù)量減少。
3)葛根素中劑量組異位內(nèi)膜上皮細胞層次紊亂，細胞出現(xiàn)空泡、變性，內(nèi)膜腺體數(shù)量減少，間質細胞也較少。
4)葛根素小劑量組異位內(nèi)膜上皮細胞萎縮，出現(xiàn)了較多的上皮細胞殘跡，空泡較多，內(nèi)膜腺體非常少，間質細胞也較少。
5)danazol組異位內(nèi)膜上皮細胞呈扁平立方形，并且出現(xiàn)了較多的上皮細胞殘跡，內(nèi)膜腺體少，間質細胞較少，并出現(xiàn)了許多空泡。
6雌激素受體α的表達6.1卵巢雌激素受體α的表達表4雌激素受體α在卵巢的表達(x±s，n＝6)

檢驗結果提示葛根素大、中、小劑量組、danazol組、假手術組以及非治療組之間卵巢雌激素受體α的表達無明顯差異(P＞0.05)。
6.2在位內(nèi)膜雌激素受體α的表達表5在位內(nèi)膜中雌激素受體α的表達
(x±s，n＝6)

檢驗結果提示葛根素大、中、小劑量組、danazol組、假手術組以及非治療組之間在位內(nèi)膜雌激素受體α的表達無明顯差異(P＞0.05)。
6.3異位內(nèi)膜雌激素受體α的表達表6雌激素受體α在異位內(nèi)膜的表達(x±s，n＝6)

檢驗結果提示葛根素大、中、小劑量組、danazol組以及非治療組之間異位內(nèi)膜雌激素受體α的表達均無明顯差異(P＞0.05)。
7細胞色素芳香化酶P450的表達7.1在位內(nèi)膜細胞色素芳香化酶P450的表達表7細胞色素芳香化酶P450在在位子宮內(nèi)膜的表達(x±s，n＝6)

與非治療組相比△P＜0.05；與假手術組相比☆P＜0.05。
檢驗結果提示細胞色素芳香化酶P450在正常子宮內(nèi)膜中無表達，在子宮內(nèi)膜異位癥組的在位內(nèi)膜中均有表達。葛根素小劑量組在位內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達與非治療組相比有明顯差異(P＜0.05)，而與假手術組相比差異不明顯(P＞0.05)；葛根素大、中劑量組、danazol組在位內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達與非治療組相比無明顯差異(P＞0.05)，與假手術組相比差異明顯(P＜0.05)；葛根素大、中、小劑量組之間的在位內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達無明顯差異(P＞0.05)；葛根素大、中、小劑量組與danazol組相比，在位內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達也無明顯差異(P＞0.05)。
7.2異位內(nèi)膜細胞色素芳香化酶P450的表達表8細胞色素芳香化酶P450在異位子宮內(nèi)膜的表達(x±s，n＝6)

與非治療組相比★P＜0.001；與葛根素大、中劑量組、danazol組相比#P＜0.05。
檢驗結果提示細胞色素芳香化酶P450在子宮內(nèi)膜異位癥組的異位內(nèi)膜均有表達。葛根素小劑量組異位內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達與非治療組相比有明顯差異(P＜0.001)；葛根素小劑量組異位內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達與葛根素大、中劑量組、danazol組相比，差異顯著(P＜0.05)。葛根素大、中劑量組、danazol組異位子宮內(nèi)膜中細胞色素芳香化酶P450的表達與非治療組相比無明顯差異(P＞0.05)。
討論1子宮內(nèi)膜異位癥動物模型的選擇目前子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制尚不明了，藥物治療和術后復發(fā)率較高。由于倫理學問題，很難在人體中進行子宮內(nèi)膜異位癥的對照研究，更不能反復進行創(chuàng)傷性檢查。為了研究子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機理和治療效果，需要建立子宮內(nèi)膜異位癥的理想模型。理想的動物模型應該盡可能與人類疾病相似，且規(guī)范化，能夠準確地再現(xiàn)該疾病的特點，能可靠地反映疾病的發(fā)展變化規(guī)律，還應對臨床有適用性和可控性，復制時經(jīng)濟易行[23]。子宮內(nèi)膜異位癥常用的動物模型有猴、狒狒、兔和大鼠等。猴和狒狒像人一樣有月經(jīng)，所以是最理想的動物模型。但由于價格、飼養(yǎng)及實驗動物缺乏等方面的問題，難以在實驗室廣泛使用。而兔無月經(jīng)，又無動情周期，無自發(fā)性排卵，其生育特點也不同于人類，與人體情況相差較大。近年來，許多研究以大鼠作為子宮內(nèi)膜異位癥的動物模型，大鼠雖無月經(jīng)，但其動情周期與人月經(jīng)周期相似，有一定規(guī)律性。許多研究表明，實驗性大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型可以反映人類子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理過程[27]。我們在大鼠動情周期的動情期制作子宮內(nèi)膜異位癥模型，利用陰道涂片觀察其動情期，并且在此期移植的子宮內(nèi)膜成活率高，模型使用可靠。
本研究觀察到子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位子宮內(nèi)膜移植物體積增大，并有液體積聚，說明其具有活性。對照組大鼠建模后4周移植物的體積和外觀與治療結束時相比無明顯差異，表明子宮內(nèi)膜移植物的生長在移植后的4周已基本穩(wěn)定，這與Katsuki的研究結果符合。
研究證明，人正常子宮內(nèi)膜無細胞色素芳香化酶P450表達，而子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位和異位內(nèi)膜均有細胞色素芳香化酶P450表達。而本研究中也發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的在位和異位子宮內(nèi)膜中均有細胞色素芳香化酶P450的表達，而假手術組子宮內(nèi)膜卻無細胞色素芳香化酶P450的表達，證實了大鼠子宮內(nèi)膜異位癥與人子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理有一定的相似性。
2子宮內(nèi)膜異位癥異位灶雌激素的來源據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，局部異位灶由于以下原因導致雌激素水平相對增高1)異位內(nèi)膜特異表達的轉錄刺激因子ST-1與cAMP激活啟動區(qū)2位點結合后激活異位內(nèi)膜芳香化酶基因表達信號系統(tǒng)；本實驗已提示異位灶中有芳香化酶P450的表達。2)異位內(nèi)膜分泌的前列腺素PGE2通過cAMP依賴受體Ep2誘導異位內(nèi)膜間質細胞芳香化酶的表達。雌激素又刺激內(nèi)膜間質細胞環(huán)氧化酶2表達，促進PGE2合成，而PGE2是已知芳香化酶最強的誘導劑，因此異位病灶局部形成一個正反饋環(huán)，不斷合成雌激素，刺激異位內(nèi)膜不斷生長。3)雌酮和雌二醇可以相互轉化，雌二醇轉化雌酮由17β-HSD-2作用，雌酮經(jīng)17β-HSD-1作用而轉化為雌二醇。而異位內(nèi)膜異常表達17β-HSD-1，而17β-HSD-2缺乏，其結果是異位內(nèi)膜的雌二醇水平高于宮腔內(nèi)膜，有利于異位內(nèi)膜生長。
本研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥動物模型外周血、卵巢雌二醇水平明顯高于假手術組，子宮內(nèi)膜異位癥模型的異位灶雌二醇水平明顯高于在位內(nèi)膜，且在位內(nèi)膜與異位灶中均存在芳香化酶P450的表達。上述結果提示，異位病灶雌激素的來源可能有以下幾種途徑(1)卵巢雌二醇合成增多。卵巢利用血液中膽固醇通過若干酶的催化作用，合成雄烯二酮(A)和睪酮(T)。排卵前，在促卵泡激素(FSH)作用下卵泡成熟，顆粒細胞內(nèi)芳香化酶受FSH活化，雄烯二酮和睪酮經(jīng)芳香化而轉化成雌酮和雌二醇。本實驗證實子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠卵巢中方香化酶P450的活性增強，促進了雄烯二酮和睪酮向雌酮和雌二醇的轉化。(2)異位病灶的自分泌和旁分泌也是雌激素的一個來源。實驗表明，異位病灶中有較強的芳香化酶P450的表達，可在局部合成雌激素，促進異位內(nèi)膜生長。
3子宮內(nèi)膜異位癥異位子宮內(nèi)膜雌激素受體的研究雌激素通過與靶細胞內(nèi)的雌激素受體α結合，促進或抑制一些蛋白的表達，誘發(fā)一系列的生物效應。子宮內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病，異位灶的生長與雌二醇息息相關，我們推測異位灶除雌激素水平升高以外，其雌激素受體α表達是否亦增強，導致其對雌激素敏感性增強。故我們測定了局部雌激素受體α，研究其在異位子宮內(nèi)膜中的表達。
實驗結果提示，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位病灶中確實存在雌激素受體α，但是與正常對照的子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位癥在位子宮內(nèi)膜的雌激素受體α表達沒有差異。經(jīng)葛根素治療后，在位和異位內(nèi)膜雌激素受體α的表達也沒有明顯改變，說明子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶中的雌激素受體α表達并沒有增強。因市場上沒有適用于大鼠標本的雌激素受體β抗體，所以本實驗沒有對這種抗體進行相同的研究。
4葛根素治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效及機理子宮內(nèi)膜異位癥大鼠用三種劑量的葛根素治療4周后，移植物體積縮小，內(nèi)膜呈萎縮狀態(tài)。有部分移植物甚至消失，而小劑量葛根素的治積效果更佳，大部分大鼠的移植物消失。
葛根素治療子宮內(nèi)膜異位癥的機理，有以下幾種可能一是葛根素的抗雌激素作用。葛根素競爭性地與雌激素受體結合，占據(jù)了受體結合部位，阻止了體內(nèi)雌激素分子與受體相結合，因而有效地減弱了靶細胞對雌激素的應答，從而抑制了異位內(nèi)膜的生長。
其次，葛根素抑制了異位病灶雌激素的自分泌。
我們發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位灶雌二醇水平明顯高于在位內(nèi)膜組織，而葛根素治療后異位灶雌二醇水平顯著下降，提示葛根素抑制了異位灶雌二醇的分泌，而其抑制異位灶雌二醇的自分泌與減少異位灶中芳香化酶P450的表達有關。研究顯示，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的在位和異位子宮內(nèi)膜中均有細胞色素芳香化酶P450的表達，而正常子宮內(nèi)膜中卻無細胞色素芳香化酶P450的表達。提示子宮內(nèi)膜異位癥局部雌激素產(chǎn)生較正常子宮內(nèi)膜增加，進一步證實子宮內(nèi)膜異位癥的存在與雌激素密切相關。小劑量葛根素治療后，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的異位病灶中細胞色素芳香化酶P450的表達均明顯減弱，提示了葛根素通過抑制細胞色素芳香化酶P450的表達，使局部雌激素生成減少，從而抑制了異位內(nèi)膜的生長。
第三，葛根素能夠抑制卵巢中雌激素的合成。實驗結果表明，小劑量葛根素明顯減弱了卵巢的細胞色素芳香化酶P450的表達，降低了卵巢雌二醇的合成，進而有效地抑制異位內(nèi)膜的生長。
5葛根素治療子宮內(nèi)膜異位癥的副作用葛根素能夠有效地治療子宮內(nèi)膜異位癥，但它是否有一定的副作用呢？對此，我們做了以下的研究(1)卵巢。組織病理學觀察卵巢形態(tài)學基本無改變；而卵巢系數(shù)也與假手術組沒有明顯差別，提示了葛根素除了降低卵巢雌二醇合成外，對卵巢沒有明顯毒性作用。(2)子宮及子宮內(nèi)膜。葛根素治療組的子宮系數(shù)與假手術組基本沒有差別；組織病理學觀察葛根素中、小劑量組的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞形態(tài)規(guī)則，內(nèi)膜腺體比較多，腺上皮細胞呈正常高柱狀，間質細胞基本沒改變；葛根素大劑量組的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞發(fā)生腫脹，出現(xiàn)空泡、變性，內(nèi)膜腺體直徑小，數(shù)量少，間質細胞也少，內(nèi)膜上皮較薄。這些現(xiàn)象與經(jīng)danazol治療后子宮內(nèi)膜的改變基本相似。提示了大劑量的葛根素對子宮內(nèi)膜具有一定的不良影響。(3)肝腎。組織形態(tài)學觀察未發(fā)現(xiàn)葛根素對肝腎有不良影響。(4)骨骼臨床與實驗研究均已證實，內(nèi)源性雌激素水平的降低可導致骨質疏松的發(fā)生，而本實驗結果提示，大劑量葛根素治療后，出現(xiàn)骨質疏松的表現(xiàn)骨小梁變細，骨皮質變薄，形態(tài)結構性差，有扭曲和斷裂，小梁間間隙增大，骨小梁密度和面積減少。而未發(fā)現(xiàn)中小劑量葛根素對骨骼產(chǎn)生不良的影響骨小梁粗壯，排列整齊并連接成網(wǎng)，間隙較小，形態(tài)結構完整，骨小梁密度，面積正常，無減少。這可能因為大劑量的葛根素與雌激素受體競爭結合力比較強，大大地降低了內(nèi)源性雌激素的作用，抑制了骨中鈣質的沉著，導致骨質丟失，引起骨質疏松。為了進一步了解葛根素對骨骼的影響情況，我們又對血清磷和血清鈣的測定，發(fā)現(xiàn)葛根素大、中、小劑量組血清磷的含量與danazol組、假手術組以及非治療組相比無明顯變化；但葛根素大劑量組的血清鈣含量雖然與非治療組相比無明顯改變，卻低于假手術組，并且血清鈣的含量明顯少于葛根素小劑量組，danazol組血清鈣含量也低于于葛根素小劑量組，這可能因為大劑量的葛根素抑制了內(nèi)源性雌激素，血中雌激素減少，引起血清鈣的降低。而danazol是一種17α乙炔睪丸酮的衍生物，它通過對垂體促性腺激素的抑制，使FSH、LH水平下降，或直接抑制產(chǎn)生卵巢類固醇的酶，抑制卵巢類固醇的產(chǎn)生，造成持續(xù)性卵巢功能低落，也會導致內(nèi)源性雌激素水平的降低，進一步引發(fā)血清鈣的減少。
總之，中、小劑量的葛根素既能夠有效地治療子宮內(nèi)膜異位癥，并且沒有明顯的副作用；而大劑量的葛根素不僅抑制了異位內(nèi)膜組織，也使正常子宮內(nèi)膜的生長受到了抑制，而且還對骨骼產(chǎn)生了不良影響，引起了骨質疏松。
另外，danazol雖然廣泛應用于治療子宮內(nèi)膜異位癥，但許多學者的認為其可引起輕度或中度肝細胞損害，對肝功能、脂代謝方面造成不利影響，在本實驗中也已證實其對肝臟有損害。
結論本課題研究了植物雌激素對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥治療作用。葛根素能夠抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位灶的生長，其作用機制可能為1.與雌激素受體α競爭性結合，阻斷了內(nèi)源性雌二醇的作用；2.減弱異位內(nèi)膜細胞色素芳香化酶P450的表達，抑制了異位內(nèi)膜的雌激素自分泌；3.減弱卵巢細胞色素芳香化酶P450的表達，降低了卵巢雌激素的合成，有效地減弱了靶細胞對雌激素的應答，從而抑制了異位內(nèi)膜的生長。
研究表明，中小劑量葛根素治療子宮內(nèi)膜異位癥，效果比較好，基本不會造成不良影響，是一種值得進一步開發(fā)研究的藥物。
權利要求
1.葛根素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了葛根素在制備治療子宮內(nèi)膜異位癥藥物中的應用。動物試驗證明，葛根素對宮內(nèi)膜異位癥具有明顯的治療作用，更重要的是葛根素與danazol(丹那唑)相比，具有無可比擬的安全性。葛根素效果比較好，基本不會造成不良影響，因而具有子宮內(nèi)膜異位癥的治療的前景。
文檔編號A61P15/00GK1899295SQ20051002792
公開日2007年1月24日 申請日期2005年7月20日 優(yōu)先權日2005年7月20日
發(fā)明者俞超芹, 石書芳 申請人:俞超芹, 石書芳