專(zhuān)利名稱(chēng)：葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法。
背景技術(shù)：
葉酸類(lèi)化合物受體在一部分人體腫瘤(卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、脈絡(luò)膜癌、室管膜細(xì)胞癌等)細(xì)胞表面過(guò)分表達(dá)，而正常組織很少由葉酸類(lèi)化合物受體過(guò)分表達(dá)。(Gruner BA，weitman SD.Invest New Drugs，1998-1999(pub 1999)，16(3)205～219)對(duì)葉酸類(lèi)化合物受體的研究發(fā)現(xiàn)，它們有潛力作為抗癌治療靶點(diǎn)，能被幾種治療途徑利用，如化療、免疫治療、放射治療和基因治療等；同時(shí)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)顯示它們也能為腫瘤顯像提供靶點(diǎn)，用于腫瘤診斷。
由于葉酸類(lèi)化合物作為靶向腫瘤的生理性配體，與腫瘤特異性單克隆抗體相比，具有低費(fèi)用、高度化學(xué)穩(wěn)定性和生物學(xué)穩(wěn)定性、與有機(jī)溶劑的生理相容性、無(wú)免疫原性、與受體的高度親和性、體積小而有利于較快的腫瘤外滲和完全的細(xì)胞內(nèi)浸潤(rùn)等優(yōu)點(diǎn)，而且葉酸類(lèi)化合物受體及其配體的結(jié)合具有特異性、選擇性、飽和性、親合力強(qiáng)和生物效應(yīng)明顯等特點(diǎn)?？梢岳门潴w為藥物或放射性核素的載體，通過(guò)葉酸類(lèi)化合物受體介導(dǎo)作用，增加藥物在病灶局部的濃度、提高療效，降低毒副作用，達(dá)到靶向治療目的，因此葉酸類(lèi)復(fù)合物作為腫瘤診斷和治療藥物的載體具有很大的研究開(kāi)發(fā)前景。
葉酸類(lèi)化合物可由受體介導(dǎo)途徑胞吞入細(xì)胞，Leamon和Low發(fā)現(xiàn)葉酸類(lèi)復(fù)合物也可由此途徑吞入細(xì)胞，并且該途徑具以下特點(diǎn)不破壞復(fù)合物、有利于親水性藥物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)、有飽和性，(Christopher P.Leamon，Joseph A.Reddy.Folate-targeted chemotherapy[J].Advanced Drug Delivery Reviews2004，56(8)1127-1141)，是一種向細(xì)胞內(nèi)傳送藥物的較好策略。目前已利用葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)靶向腫瘤傳送的分子復(fù)合物包括①蛋白質(zhì)毒素；②低分子化療劑；③放射顯像劑；④磁共振顯像劑；⑤放射治療劑；⑥包裹藥物的脂質(zhì)體；⑦基因；⑧反義寡核苷酸；⑨核糖酶；⑩免疫治療劑。對(duì)葉酸復(fù)合物的體外研究顯示，與同樣制劑的非靶向形式相比，其效能和靶向性有明顯提高。(李萌，劉敏，陸偉躍.葉酸復(fù)合物研究進(jìn)展[J].2002，23(1)6～8)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提出一種葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法。
本發(fā)明提出的葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法，其具體步驟如下1、制備聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品將聚乙二醇(PEG)溶于二氯甲烷中，聚乙二醇在二氯甲烷中的濃度為50-500mg/ml；對(duì)甲苯磺酰氯溶于吡啶中，對(duì)甲苯磺酰氯在吡啶中的濃度為0.5-2g/ml；將兩種溶液混合，在N2條件下攪拌，室溫反應(yīng)18-30小時(shí)，分離提純，真空干燥，得到聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品，其中聚乙二醇與對(duì)甲苯磺酰氯的摩爾比為1∶2-1∶5；2、制備雙端氨基聚乙二醇將步驟1得到的聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品和氨水反應(yīng)，氨水濃度為25-28mg/ml，反應(yīng)溫度為120-200℃，反應(yīng)壓力為1-10MPa，反應(yīng)時(shí)間為12-40小時(shí)，聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品在氨水中的濃度為50-200mg/ml，然后將所得產(chǎn)物冷卻至室溫，分離提純，水洗至中性，旋轉(zhuǎn)蒸干，即得到雙端氨基聚乙二醇(PEG-(NH2)2)；3、制備活化的聚乳酸類(lèi)共聚物將聚乳酸類(lèi)共聚物、二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)按比例分別加入到二氯甲烷中，反應(yīng)18-30小時(shí)，純化干燥，得到活化的聚乳酸類(lèi)共聚物；聚乳酸類(lèi)共聚物在二氯甲烷中的濃度為50-1000mg/ml，聚乳酸類(lèi)共聚物∶二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)∶N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的摩爾比為1∶1∶1-1∶5∶5；4、制備聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體將活化后的聚乳酸類(lèi)共聚物溶于二氯甲烷中，聚乳酸類(lèi)共聚物在二氯甲烷中的濃度為50-1000mg/ml，向溶液中滴加步驟2中所得到的雙端氨基聚乙二醇，攪拌，在充氮的條件下反應(yīng)6-10小時(shí)，純化，過(guò)濾，真空干燥，即得到聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體，活化的聚乳酸類(lèi)共聚物與雙端氨基聚乙二醇摩爾比為1∶2-1∶10；5、制備葉酸類(lèi)化合物的復(fù)合物將步驟4中得到的聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體溶于二甲亞砜中，向其中加入葉酸類(lèi)化合物、二環(huán)己基碳酰亞胺，在室溫下反應(yīng)5-10小時(shí)，然后純化，冷凍干燥，得到干燥的產(chǎn)物；聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體在二甲亞砜中濃度為30-500mg/ml，其中聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2、葉酸和二環(huán)己基碳酰亞胺三者摩爾比為1∶2∶2-1∶10∶10。
本發(fā)明中，所述聚乙二醇的分子量為3000-10000。
本發(fā)明中，所述聚乳酸類(lèi)共聚物為聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)或它們之中任兩種單體的共聚物之一種。
本發(fā)明中，所述聚乳酸類(lèi)共聚物的重均分子量為5000-10000。
本發(fā)明中，所述葉酸類(lèi)化合物為葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸、四氫蝶呤、喋酰多谷酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸或8-去氮葉酸等中的一種。
本發(fā)明中，聚乳酸類(lèi)共聚物與葉酸類(lèi)化合物連接而成的復(fù)合物作為載體具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)由于聚乳酸類(lèi)共聚物具有良好的生物相容性和生物降解性，在體內(nèi)經(jīng)水解和酶解作用可完全代謝為CO2和H2O，在體內(nèi)無(wú)聚集，對(duì)人體無(wú)毒無(wú)害；聚乙二醇的親水性可以使共聚物的膠束被識(shí)別，減小被攝取的機(jī)會(huì)；(2)利用腫瘤特有的高通透性和高截留性(enhanced permeability and retention effect，EPReffect)，將聚乳酸類(lèi)共聚物和葉酸類(lèi)化合物的復(fù)合物制成納米級(jí)的膠束能夠穿透腫瘤部位的毛細(xì)血管壁進(jìn)入腫瘤組織，又由于腫瘤組織的淋巴系統(tǒng)發(fā)育不完善，不能通過(guò)淋巴導(dǎo)管將膠束排出，造成膠束在腫瘤部位積蓄并釋藥，從而達(dá)到治療腫瘤的目的；(3)葉酸類(lèi)化合物具有選擇性地在腫瘤組織濃集的特性，因此具有作為腫瘤靶向給藥載體的潛能，且制備簡(jiǎn)單、可以規(guī)模生產(chǎn)、不會(huì)引起抗體產(chǎn)生、對(duì)多種腫瘤有效的優(yōu)點(diǎn)；(4)利用本發(fā)明方法可以將其制成各種含抗腫瘤藥物的緩釋制劑，例如毫微球、納米粒、膠束等，不僅可以有效的到達(dá)靶位置還能具有一定的緩釋性能，起到高效低毒的作用。
具體實(shí)施例方式
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例11、雙端氨基聚乙二醇的制備步驟20g PEG4000溶于100ml二氯甲烷，形成溶液1，對(duì)甲苯磺酰氯3.81g溶于吡啶76ml，形成溶液2使溶液1和溶液2兩者混合，N2條件下攪拌，室溫反應(yīng)24小時(shí)，將反應(yīng)產(chǎn)物純化，真空干燥后得到PEG-對(duì)甲苯磺酸酯純品。將16g PEG-對(duì)甲苯磺酸酯純品和160ml 25％---28％的氨水置于250ml的耐壓容器中，在140℃下密閉反應(yīng)6h，冷至室溫。純化干燥，即可得雙端氨基聚乙二醇。
2、PLA和端氨基PEG反應(yīng)將2.5gPLA，分子量為8000溶于二氯甲烷，加入0.103g二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)和0.57gN-羥基丁二酰亞胺(NHS)，充氮?dú)?h，室溫反應(yīng)24h，其中PLA、NHS、DCC三者的摩爾比為1/2/2。純化干燥，得到活化的PLA粉末。
將1g活化后的PLA溶于8ml二氯甲烷，將溶液緩慢地滴加入緩慢攪拌的2.1g端氨基PEG，分子量為4000，溶于2ml二氯甲烷所得到的溶液中，反應(yīng)在充氮?dú)獾臈l件下進(jìn)行6h，其中，PLA端氨基PEG的摩爾比為1/5，得到的溶液通過(guò)向高速攪拌的冰冷的乙醚中滴加而沉淀下來(lái)。過(guò)濾，真空干燥，得到PLA-PEG-NH2固體。
(1)紅外表征將上述得到的PLA-PEG-NH2固體采用紅外表征，結(jié)果顯示在IR(KBr)3492cm-1處的峰為-NH的伸縮振動(dòng)峰，證明了氨基端的存在，1755cm-1處的峰為C＝O的伸縮振動(dòng)峰，1215cm-1的峰為C-O的伸縮振動(dòng)峰，由此可證明連上了PLA。
(2)核磁表征將上述得到的PLA-PEG-NH2固體采用紅外表征，結(jié)果顯示在1HNMR(CDCl3)δ＝5.1719ppm和5.1547ppm處的共振峰對(duì)應(yīng)于C-H鍵的化學(xué)位移，這證明了PLA結(jié)構(gòu)的存在。另外，3.64ppm處的共振峰對(duì)應(yīng)于亞甲基CH2上的氫的化學(xué)位移，1.60ppm處的共振峰對(duì)應(yīng)于甲基的化學(xué)位移。證明PLA與PEG連接。
3、葉酸復(fù)合物的合成以及提純將0.5g PLA-PEG-NH2溶于5ml二甲亞砜中，然后加入0.013g葉酸和0.013g二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行7h，然后與50ml蒸餾水混合，分離透析出沒(méi)有反應(yīng)的葉酸，冷凍干燥得到聚乳酸-葉酸復(fù)合物。
葉酸與聚乳酸復(fù)合物結(jié)構(gòu)的表征(1)紅外表征將上述得到的聚乳酸-葉酸復(fù)合物采用紅外表征，結(jié)果顯示在在846cm-1處的吸收峰為苯環(huán)上兩個(gè)相鄰氫的面外彎曲振動(dòng)峰，這表明物質(zhì)中含有苯環(huán)，在可能的組分中，只有葉酸含有苯環(huán)，因此可以證明體系中含有葉酸，而游離的葉酸分子已由離心分離除去，因此可判斷葉酸被連到了共聚物上。其余的峰為2929cm-1處的峰為飽和C-H伸縮振動(dòng)的吸收峰，1759cm-1處的吸收峰為C＝O的吸收峰，1536cm-1處的吸收峰為葉酸分子上的酰胺鍵中的N-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰，3328cm-1處的吸收峰為葉酸分子中的不飽和雙鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。這些都證明了葉酸結(jié)構(gòu)在聚合物中的存在。
(2)核磁共振分析(1HNMR)將上述得到的聚乳酸-葉酸復(fù)合物采用紅外表征，結(jié)果顯示在5.17ppm對(duì)應(yīng)于N-H鍵上的氫的化學(xué)位移，3.64ppm對(duì)應(yīng)于亞甲基CH2的化學(xué)位移。觀察從1.0ppm到2.0ppm的峰出現(xiàn)裂分現(xiàn)象，這一段中，最左面的峰裂分為兩個(gè)雙峰，由“n+1”規(guī)則可知與之相鄰的基團(tuán)中含一個(gè)氫，第二個(gè)峰也分裂為兩個(gè)雙峰，這表明與它相鄰的基團(tuán)中共有一個(gè)氫，這種相鄰的兩個(gè)基團(tuán)上都只有一個(gè)氫的結(jié)構(gòu)在PLA-PEG中不存在，而在葉酸的結(jié)構(gòu)中大量存在，為NH-CH，因此證明連接上了葉酸。
(3)凝膠滲透色譜分析(GPC)將上述得到的聚乳酸-葉酸復(fù)合物采用紅外表征，結(jié)果顯示在游離的葉酸完全除去的情況下，PLA-PEG-folate的分子量大致符合PLA、PEG、folate三者的分子量的相加之和。也就證明了合成了葉酸-聚乳酸復(fù)合物。
(4)紫外表征a、測(cè)定葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線稱(chēng)取葉酸0.1018g，溶于25mlDMSO，取1ml稀釋至50ml。分別取1，2，3，4，5，6，8，10ml稀釋至10ml?？傻萌~酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線為C(μg/ml)＝0.83037+65.63382*A(r＝0.99953)b、測(cè)定并計(jì)算葉酸含量溶液配制稱(chēng)取制得的PLA-PEG-folate0.0237g，溶于少量的二甲亞砜中，再加入50ml容量瓶中定容，得到待測(cè)溶液。在波長(zhǎng)360.5±1nm處掃描，得到在標(biāo)準(zhǔn)曲線上最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)處的吸光度。計(jì)算出葉酸連接率為24.74％。
實(shí)施例2聚乳酸類(lèi)共聚物采用聚(乳酸-乙醇酸)(PLGA)，分子量8000，葉酸類(lèi)化合物采用亞葉酸，其它條件同實(shí)施例1，所得葉酸連接率為30.1％。
實(shí)施例3聚乳酸類(lèi)共聚物采用PCL，分子量5000，葉酸類(lèi)化合物采用1-去氮葉酸，其它條件同實(shí)施例1，所得葉酸連接率為35.7％。
實(shí)施例4聚乳酸類(lèi)共聚物采用分子量為30000的雙端氨基PEG，葉酸類(lèi)化合物采用2-去氨基-羥基葉酸，其它條件同實(shí)施例1，所得葉酸連接率為15.1％。
實(shí)施例5采用分子量為6000的雙端氨基PEG，葉酸類(lèi)化合物采用四氫葉酸，其它條件同實(shí)施例1，所得葉酸連接率為37.6％。
權(quán)利要求
1.一種葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法，其特征在于具體步驟如下(1)制備聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品將聚乙二醇即PEG溶于二氯甲烷中，聚乙二醇在二氯甲烷中的濃度為50-500mg/ml；對(duì)甲苯磺酰氯溶于吡啶中，對(duì)甲苯磺酰氯在吡啶中的濃度為0.5-2g/ml；將兩種溶液混合，在N2條件下攪拌，室溫反應(yīng)18-30小時(shí)，分離提純，真空干燥，得到聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品，其中聚乙二醇與對(duì)甲苯磺酰氯的摩爾比為1∶2-1∶5；(2)制備雙端氨基聚乙二醇將步驟(1)得到的聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品和氨水反應(yīng)，氨水濃度為25-28mg/ml，反應(yīng)溫度為120-200℃，反應(yīng)壓力為1-10MPa，反應(yīng)時(shí)間為12-40小時(shí)，聚乙二醇-對(duì)甲苯磺酸酯純品在氨水中的濃度為50-200mg/ml，然后將所得產(chǎn)物冷卻至室溫，分離提純，水洗至中性，旋轉(zhuǎn)蒸干，得到雙端氨基聚乙二醇即PEG-(NH2)2；(3)制備活化的聚乳酸類(lèi)共聚物將聚乳酸類(lèi)共聚物、二環(huán)己基碳酰亞胺和N-羥基丁二酰亞胺按比例分別加入到二氯甲烷中，反應(yīng)18-30小時(shí)，純化干燥，得到活化的聚乳酸類(lèi)共聚物；聚乳酸類(lèi)共聚物在二氯甲烷中的濃度為50-1000mg/ml，聚乳酸類(lèi)共聚物∶二環(huán)己基碳酰亞胺∶N-羥基丁二酰亞胺的摩爾比為1∶1∶1-1∶5∶5；(4)制備聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體將活化后的聚乳酸類(lèi)共聚物溶于二氯甲烷中，聚乳酸類(lèi)共聚物在二氯甲烷中的濃度為50-1000mg/ml，向溶液中滴加步驟(2)中所得到的雙端氨基聚乙二醇，攪拌，在充氮條件下反應(yīng)6-10小時(shí)，純化，過(guò)濾，真空干燥，即得到聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體，活化的聚乳酸類(lèi)共聚物與雙端氨基聚乙二醇摩爾比為1∶2-1∶10；(5)制備葉酸類(lèi)化合物的復(fù)合物將步驟(4)中得到的聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體溶于二甲亞砜中，向其中加入葉酸類(lèi)化合物、二環(huán)己基碳酰亞胺，在室溫下反應(yīng)5-10小時(shí)，然后純化，冷凍干燥，得到干燥的產(chǎn)物；聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2固體在二甲亞砜中濃度為30-500mg/ml，聚乳酸類(lèi)共聚物-PEG-NH2、葉酸和二環(huán)己基碳酰亞胺三者摩爾比為1∶2∶2-1∶10∶10。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法，其特征在于所述聚乙二醇的分子量為3000-10000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法，其特征在于所述聚乳酸類(lèi)共聚物為聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯或它們之中任兩種單體的共聚物之一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法，其特征在于所述聚乳酸類(lèi)共聚物的重均分子量為5000-10000。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法，其特征在于所述葉酸類(lèi)化合物為葉酸、亞葉酸、二氫葉酸、四氫葉酸、四氫蝶呤、喋酰多谷酸、2-去氨基-羥基葉酸、1-去氨基-羥基葉酸、1-去氮葉酸、3-去氮葉酸或8-去氮葉酸中的一種。
全文摘要
本發(fā)明屬納米材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種葉酸類(lèi)化合物介導(dǎo)的主動(dòng)靶向載體的制備方法。本發(fā)明采用對(duì)甲苯磺酸酯法活化聚乙二醇，最終轉(zhuǎn)化端羥基變成端氨基，形成雙端氨基聚乙二醇后，與活化了的聚乳酸類(lèi)共聚物反應(yīng)，再利用端氨基與葉酸類(lèi)化合物連接，完成葉酸類(lèi)化合物與聚乳酸類(lèi)共聚物的復(fù)合物的合成，利用葉酸類(lèi)化合物受體在一部分人體腫瘤如卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、脈絡(luò)膜癌、室管膜細(xì)胞瘤等細(xì)胞表面過(guò)分表達(dá)，而正常組織很少有葉酸類(lèi)化合物受體過(guò)分表達(dá)的性質(zhì)，通過(guò)葉酸類(lèi)化合物與聚乳酸類(lèi)共聚物受體之間的親和力，使帶有葉酸基團(tuán)的藥物載體有著主動(dòng)靶向的效果。
文檔編號(hào)A61K49/10GK1733309SQ200510028249
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日
發(fā)明者任杰, 郁曉, 任天斌, 袁華 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)