專利名稱：一種用于防治牛子宮內(nèi)膜炎的溶葡萄球菌酶凍干粉劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及凍干生物制劑，具體涉及溶葡萄球菌酶凍干粉劑背景技術(shù)子宮內(nèi)膜炎是奶牛的常見病之一，奶牛產(chǎn)后發(fā)生子宮內(nèi)膜炎可造成子宮復(fù)舊時(shí)間延長(zhǎng)，使發(fā)情周期紊亂。炎性滲出物可改變子宮內(nèi)環(huán)境的酸堿度，不利于精子和卵子的生存，使受胎率下降，導(dǎo)致不孕，同時(shí)還可長(zhǎng)期刺激子宮內(nèi)壁感受器，通過反射，使激素調(diào)節(jié)失調(diào)，引起卵巢疾病。另外還可繼發(fā)乳房炎，蹄葉炎等。
奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率在15-20％之間，其中多數(shù)發(fā)生于產(chǎn)后。在英國(guó)，奶牛不孕癥有95％是由子宮內(nèi)膜炎引起的，而美國(guó)因不孕癥帶來的損失也高達(dá)2.5億美元。引起子宮內(nèi)膜炎的病原菌較多，主要有葡萄球菌，鏈球菌和大腸桿菌等。目前世界上治療子宮內(nèi)膜炎均使用抗生素，但是抗生素治療存在許多不利因素。如(1)容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性；(2)單一藥物抗菌譜不廣；(3)容易造成抗生素殘留；(4)其它副作用。近年來由于抗生素的大量使用，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，尤其是金黃色葡萄球菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，且耐藥性呈明顯上升趨勢(shì)，難于治療。歐美國(guó)家早在40多年前就投入大量人力、物力研究替代抗生素的藥物但至今尚無明確結(jié)果。
中醫(yī)、中獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用天然藥物(中草藥)來治療人類和動(dòng)物的疾病，現(xiàn)被譽(yù)為天然醫(yī)學(xué)。如CN1302634A(治療子宮炎癥的藥)，但是由于中藥的藥效作用慢，以致病情遷延不愈，或反復(fù)發(fā)作，因而臨床使用效果并不好。
US 4692452(Method for treatment of endometritis in mammalian females)，報(bào)道了用化學(xué)制劑治療動(dòng)物(尤其是奶牛)的子宮內(nèi)膜炎，但是化學(xué)制劑往往對(duì)子宮內(nèi)膜具有刺激性，會(huì)造成子宮內(nèi)膜纖維化，以致于形成疤痕，不利于奶牛進(jìn)一步的配種受孕。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是提供一種預(yù)防和治療牛子宮內(nèi)膜炎的溶葡萄球菌酶凍干粉劑，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是提供該種溶葡萄球菌酶凍干粉劑的制備方法。
本發(fā)明的發(fā)明構(gòu)思是這樣的溶葡萄球菌酶是一種革蘭氏陽性菌的溶菌素。組成該類革蘭氏陽性菌(例如金黃色葡萄球菌)細(xì)胞壁肽聚糖的四肽側(cè)鏈的氨基酸，依次為L(zhǎng)-丙氨酸，D-谷氨酸，L-賴氨酸，D-丙氨酸而首位的L-丙氨酸通過一個(gè)酰胺鍵與胞壁酸相連，該聚糖鏈四肽側(cè)鏈第3位的L-賴氨酸，通過五肽(五個(gè)甘氨酸)交聯(lián)橋聯(lián)結(jié)到相鄰聚糖鏈四肽側(cè)鏈D-丙氨酸羧基上。由此縱橫交叉，左右聯(lián)結(jié)構(gòu)成十分堅(jiān)韌的三維立體多孔結(jié)構(gòu)，并聚合成較厚的肽聚糖層。
溶葡萄球菌酶可切斷肽聚糖中的GIy-GIy鍵，由于溶葡萄球菌酶獨(dú)特的殺菌機(jī)理，使其不同于一般的抗生素?？股氐淖饔靡话闶且种萍?xì)菌生長(zhǎng)，促使細(xì)菌產(chǎn)生新的耐藥質(zhì)粒或新酶來阻止抗菌素的作用。而該酶則是迅速裂解細(xì)菌殺死細(xì)菌，作用時(shí)間短，細(xì)菌不容易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)殺菌效果好，對(duì)耐甲氧苯青霉素(MRSA)的金黃色葡萄球菌同樣有較強(qiáng)的殺菌能力。
1991年，美國(guó)普林斯頓Cyanamid公司農(nóng)業(yè)研究所的Oldham ER等用溶葡萄球菌酶治療耐藥性金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎，證明了溶葡萄球菌酶對(duì)于治療此病的有效性。次年他們又研究了局部使用重組溶葡萄球菌酶治療奶牛乳腺炎時(shí)引起體內(nèi)的免疫反應(yīng)，認(rèn)為重組溶葡萄球菌酶作為體內(nèi)注射劑是有效和安全的，并提出溶葡萄球菌酶可以替代傳統(tǒng)的抗生素。
因此，本公司在多年研究溶葡萄球菌酶的基礎(chǔ)上，根據(jù)牛子宮內(nèi)膜炎的特點(diǎn)，開發(fā)出了用于預(yù)防和治療子宮內(nèi)膜炎的重組溶葡萄球菌酶凍干粉制劑，可以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的殺菌效果不理想，特別是對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌殺菌效果不理想的缺陷，同時(shí)，也可以克服細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性，易產(chǎn)生藥物蓄積和殘留，病情易反復(fù)發(fā)作并影響后續(xù)的受孕配種的問題。
同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)溶葡萄球菌酶在溶液狀態(tài)時(shí)或者在有大量游離水存在下，該酶穩(wěn)定性較差，難以長(zhǎng)期穩(wěn)定保存。相反，如果將該酶冷凍干燥后密封低溫可以長(zhǎng)期保存而不損失生物活性，因此，我們選擇該酶為凍干劑型，這也是生物技術(shù)產(chǎn)品常用的劑型。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供一種種溶葡萄球菌酶凍干粉劑，組成及重量百分含量為溶葡萄球菌酶0.1％～10％；牛血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸鹽1％～50％。
其中所述及的磷酸鹽為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二鈉。
一種溶葡萄球菌酶凍干粉劑，其組成及重量百分含量為溶葡萄球菌酶0.1％～10％；牛血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸二氫鉀1％～30％；磷酸氫二鈉1％～50％。
本發(fā)明還提供溶葡萄球菌酶凍干粉劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)稱取固體磷酸鹽，配制磷酸鹽緩沖液A；(2)稱取甘氨酸、甘露醇，量取牛血清白蛋白，加入部分的溶液A中，溶解，得到溶液B；(3)量取溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，補(bǔ)加溶液A至終體積，得到溶葡萄球菌酶的半成品溶液；(4)無菌操作，用微孔濾膜正壓過濾已經(jīng)配制好的溶葡萄球菌酶半成品溶液，貯存于2～8℃；(5)將微濾完的溶液分裝到容器中，同時(shí)加半塞，凍干。
本發(fā)明公開的溶葡萄球菌酶凍干粉劑具有如下特點(diǎn)1、殺菌效果強(qiáng)。該制劑對(duì)革蘭氏陽性菌尤其是金黃色葡萄球菌，具有很強(qiáng)的殺菌作用。體外實(shí)驗(yàn)作用5分鐘即可達(dá)到99.9％的殺菌率，如果作用10分鐘甚至20分鐘，可使殺菌率達(dá)到100％，見表1。
2、穩(wěn)定性強(qiáng)。本品在凍干狀態(tài)下4～8℃低溫保存6個(gè)月，25℃常溫保存6個(gè)月，生物活性基本沒有改變。本品在4～8℃可以保存2年。本品加入溶媒溶解后，可以存放1月而生物活性不下降。
3、本發(fā)明為純生物制劑，克服了傳統(tǒng)化學(xué)類制劑對(duì)子宮粘膜具有刺激性，細(xì)菌容易產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)。易被機(jī)體所接受，且沒有任何毒副作用。
4、本制劑采用局部用藥的方式，較常用的全身性治療具有治療作用快，毒副作用小的特點(diǎn)，且使用方便，易于被獸醫(yī)和奶牛所接受。
5、本發(fā)明的制劑不僅可用于預(yù)防和治療奶牛的子宮內(nèi)膜炎，還可以用于預(yù)防和治療奶?；蚱渌麆?dòng)物的陰道炎、口蹄疫、口腔炎、皮膚潰瘍、皮膚外傷、全身性感染、外耳道炎癥等細(xì)菌感染性疾病。
表1對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效果

注原液酶濃度為400u/ml；陽性對(duì)照組平均菌數(shù)及范圍為7.25×105cfu/片(7.15-7.35×105cfu/片)；陰性對(duì)照組中和劑、PBS、培養(yǎng)基無細(xì)菌生長(zhǎng)。
本發(fā)明公開的溶葡萄球菌酶可用于治療奶牛急，慢性子宮內(nèi)膜炎；奶牛產(chǎn)后凈化子宮，防止或減少炎癥的發(fā)生，能促進(jìn)子宮黏膜修復(fù)，加強(qiáng)子宮收縮，消除炎癥，增強(qiáng)自凈能力，改善子宮內(nèi)環(huán)境，加速產(chǎn)后子宮的修復(fù)，有利于內(nèi)分泌的協(xié)調(diào)，提高受胎率。
臨床使用時(shí)，將每瓶藥物溶解于250ml無菌蒸餾水或無菌純凈水中，視病情輕重，每次子宮灌注100-250ml，每隔3天灌注1次。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1溶葡萄球菌酶凍干粉的制備1、組成和配比溶葡萄球菌酶0.4％；牛血清白蛋白10％；甘氨酸30％；甘露醇10％；磷酸二氫鉀15％；磷酸氫二鈉30％。
2、配制半成品稱取固體KH2PO4和Na2HPO4.12H2O，配制0.2mol/L磷酸鹽緩沖液A(pH值6.5磷酸鹽緩沖液，濃度為0.2M)。按照制劑處方，稱取所需的甘氨酸、甘露醇，量取所需體積的牛血清白蛋白，加入到部分A溶液中，攪拌并使溶解，得到溶液B。量取重組溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，使最終溶液中重組溶葡萄球菌酶生物活性為400U/ml，補(bǔ)加A溶液至終體積，此時(shí)得到的是重組溶葡萄球菌酶的半成品溶液。
3、微濾除菌無菌操作，用孔徑為0.22um的微孔濾膜(PALL公司)正壓過濾已經(jīng)配制好的重組溶葡萄球菌酶半成品溶液，貯存于2～8℃。
4、分裝用液體灌裝機(jī)將微濾完的半成品溶液分裝到容量為15ml的管制西林瓶中，每瓶分裝溶液1.0±0.1ml，同時(shí)加半塞。
5、凍干分裝完畢后，將西林瓶送入冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干。凍干過程分為預(yù)凍階段、主干燥階段、最后干燥階段。
實(shí)施例2兔皮下注射外用重組溶葡萄球菌酶重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^兔皮下注射外用重組溶葡萄球菌酶，觀察兔出現(xiàn)毒性反應(yīng)性質(zhì)、程度、發(fā)展和恢復(fù)情況，為臨床安全用藥的劑量設(shè)計(jì)和臨床毒副反應(yīng)監(jiān)測(cè)提供參考資料。
2、實(shí)驗(yàn)方法新西蘭白兔24只，體重2.5～3.0kg。外用重組溶葡萄球菌酶設(shè)3個(gè)劑量組，給藥劑量分別為100、20及4mg.kg-1(相當(dāng)于241936、48387和9677U·m-2)，溶劑對(duì)照組(0.9％氯化鈉注射液)，皮下注射量為1mg.kg-1。每周連續(xù)給藥7天，共給藥4周。
3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果給藥后各組動(dòng)物的一般行為活動(dòng)和食量正常。體重、心電圖及食物消耗量與溶劑對(duì)照組比較無顯著差別。給藥第14天100mg.kg-1組血清中抗體與溶劑對(duì)照組相比有明顯增高(p＜0.01)。第28天時(shí)各劑量組與溶劑對(duì)照組相比較，血清中抗體含量均顯著增高(P＜0.01、P＜0.05)。與溶劑對(duì)照組相比較有非常顯著性差異(p＜0.01)。恢復(fù)期結(jié)束時(shí)，各劑量組家兔血清中抗體水平有下降趨勢(shì)。13項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)、4項(xiàng)凝血指標(biāo)、18項(xiàng)血液生化指標(biāo)、10項(xiàng)尿液指標(biāo)中的個(gè)別項(xiàng)目與溶劑對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但無特殊的毒理學(xué)意義。組織病理學(xué)檢查未見與給藥有關(guān)的毒性病理改變。
4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論綜上所述，在本次試驗(yàn)條件下，外用重組溶葡萄球菌酶給藥劑量為241936、48387和9677U·m-2劑量組時(shí)，對(duì)新西蘭兔無給藥有關(guān)的毒性表現(xiàn)。在相當(dāng)于人擬用劑量4～100倍時(shí)對(duì)新西蘭兔無毒性作用。安全劑量大于241936U·m-2。外用重組溶葡萄球菌酶未經(jīng)消毒濾菌等措施直接皮下注射會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)。
實(shí)施例3溶葡萄球菌酶凍干粉穩(wěn)定性試驗(yàn)1、試驗(yàn)器材試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌(ATCC6538)；中和劑0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS；磷酸鹽緩沖溶液(PBS0.03mol/l pH7.2)。
2、試驗(yàn)方法將試驗(yàn)菌24h斜面培養(yǎng)物用PBS洗下，制成菌懸液。
取被試樣片(2.0cm×3.0cm)和對(duì)照樣片(與試樣同質(zhì)材料，同等大小，但不含抗菌材料，且經(jīng)滅菌處理)各4片，分成4組置于4個(gè)滅菌平皿內(nèi)。
取上述菌懸液，分別在每個(gè)被試樣片和對(duì)照樣片上滴加100μL，均勻涂布，開始計(jì)時(shí)，作用2、5、10、20min，用無菌鑷分別將樣片投入含5mL相應(yīng)中和劑的試管內(nèi)，充分混勻，作適當(dāng)稀釋，然后取其中2～3個(gè)稀釋度，分別吸取0.5mL，置于兩個(gè)平皿，用涼至40～45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(細(xì)菌)或沙氏瓊脂培養(yǎng)基(酵母菌)15mL作傾注，轉(zhuǎn)動(dòng)平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平板，35±2℃培養(yǎng)48h(細(xì)菌)或72h(酵母菌)，作活菌菌落計(jì)數(shù)。
試驗(yàn)重復(fù)3次，按式(C1)計(jì)算殺菌率X3＝(A-B)/A×100％式中X3——?dú)⒕?，％?
A——照樣品平均菌落數(shù)；B——被試樣品平均菌落數(shù)。
3、試驗(yàn)結(jié)果從表2可以看出溶葡萄球菌酶凍干粉在25℃存放6個(gè)月后對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅活性沒有發(fā)生變化。
表2 25℃存放6個(gè)月后對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅效果

注陰性對(duì)照組無細(xì)菌生長(zhǎng)。
實(shí)施例4溶葡萄球菌酶對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的作用效果1、慢性子宮內(nèi)膜炎病牛癥狀以陰道排出膿性分泌物為主要臨床癥狀，病牛從陰門排有灰白色或黃褐色稀薄膿液，故在尾根、陰門及飛結(jié)處粘有陰道排出物或干痂。陰道檢查可見陰道黏膜和子宮腹部充血，子宮頸腫脹、松弛張開，宮頸口附有膿性分泌物；直腸檢查發(fā)現(xiàn)子宮角增大，收縮反應(yīng)微弱，缺乏彈性，宮壁增厚變硬，子宮蓄積炎性分泌物時(shí)，則有輕微波動(dòng)感。
2、試驗(yàn)藥物溶葡萄球菌酶凍干粉(宮內(nèi)灌注劑)400U；土霉素堿；利凡諾。
3、試驗(yàn)方法在奶牛繁殖年度，選擇分娩后20～40天確診患有慢性子宮內(nèi)膜炎的奶牛供試驗(yàn)用，根據(jù)治療順序，將其隨機(jī)分為“溶菌酶”組和“利土劑”組。
溶葡萄球菌酶組每瓶藥物溶解于250mL無菌純化水或無菌純凈水中，每次子宮灌注100-250ml，每隔3天灌注1次。
利土劑組利土劑藥液100mL(利凡諾0.5g、土霉素堿2g溶于100mL生理鹽水中)直接注入子宮內(nèi)，隔日1次，連續(xù)3～4次為1個(gè)療程。
4、治療效果判定標(biāo)準(zhǔn)治愈陰道排出的黏液透明無異味，其他臨床癥狀消失，恢復(fù)正常發(fā)情周期，且配種后2～3個(gè)月直檢確定妊娠。
有效子宮明顯軟化，收縮性強(qiáng)，其他癥狀減輕，但發(fā)情配種后未妊娠。
無效與治療前比較無明顯變化。
5、試驗(yàn)結(jié)果表3 溶葡萄球菌酶組與利土劑組治療效果比較

。
從表可以看出，用溶葡萄球菌酶治療奶牛子宮內(nèi)膜炎(以慢性膿性和卡他性膿性為主)效果比傳統(tǒng)的利土劑治療法有明顯提高，治愈率前者比后者提高26.4個(gè)百分點(diǎn)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異顯著(P＜0.05)。
權(quán)利要求
1.一種溶葡萄球菌酶凍干粉劑，其特征在于，組成及重量百分含量為溶葡萄球菌酶0.1％～10％；牛血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20；磷酸鹽1％～50％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干粉劑，其特征在于，所述及的磷酸鹽為磷酸二氫鉀和/或磷酸氫二鈉。
3.一種溶葡萄球菌酶凍干粉劑，其特征在于，組成及重量百分含量為溶葡萄球菌酶0.1％～10％；牛血清白蛋白0.1％～20％；甘氨酸1％～50％；甘露醇0.1％～20％；磷酸二氫鉀1％～30％；磷酸氫二鈉1％～50％。
4.一種如權(quán)利要求1至3任一所述的溶葡萄球菌酶凍干粉劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)稱取固體磷酸鹽，配制磷酸鹽緩沖液A；(2)稱取甘氨酸、甘露醇，量取牛血清白蛋白，加入部分的溶液A中，溶解，得到溶液B；(3)量取溶葡萄球菌酶原液，加到溶液B中，補(bǔ)加溶液A至終體積，得到溶葡萄球菌酶的半成品溶液；(4)無菌操作，用微孔濾膜正壓過濾已經(jīng)配制好的溶葡萄球菌酶半成品溶液，貯存于2～8℃；(5)將微濾完的溶液分裝到容器中，同時(shí)加半塞，凍干。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種溶葡萄球菌酶凍干粉劑的配方和組成，該凍干粉劑由溶葡萄球菌酶、牛血清白蛋白、甘氨酸、甘露醇、磷酸鹽所組成。本發(fā)明還公開了這種溶葡萄球菌酶凍干粉的制備方法。本發(fā)明公開的溶葡萄球菌酶凍干粉劑可用于治療奶牛急，慢性子宮內(nèi)膜炎；奶牛產(chǎn)后凈化子宮，防止或減少炎癥的發(fā)生，能促進(jìn)子宮黏膜修復(fù)，加強(qiáng)子宮收縮，消除炎癥，增強(qiáng)自凈能力，改善子宮內(nèi)環(huán)境，加速產(chǎn)后子宮的修復(fù)，有利于內(nèi)分泌的協(xié)調(diào)，提高受胎率。本發(fā)明公開的溶葡萄球菌酶凍干粉劑還可以用于其他動(dòng)物如寵物的皮膚粘膜感染的防治。
文檔編號(hào)A61P29/00GK1911441SQ20051002861
公開日2007年2月14日 申請(qǐng)日期2005年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月9日
發(fā)明者黃青山, 陸婉英 申請(qǐng)人:上海高科聯(lián)合生物技術(shù)研發(fā)有限公司