專利名稱：水蕨提取物及其在制備抗腫瘤制劑中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中醫(yī)藥領域，具體的說是一種抗腫瘤中藥有效制劑及其在制藥中的應用，更具體地說，它涉及水蕨提取物及其在制備抗腫瘤制劑中的應用。
背景技術：
動物體內細胞分裂調節(jié)失控而無限增殖的細胞稱為腫瘤細胞，即癌細胞。正常的細胞增生是有限度的。由于自我控制機制被破壞，癌細胞可以無止境地增生。在一個統(tǒng)一體中，是需要各成員協(xié)調合作的，任何成員的異常都可能造成系統(tǒng)機能的降低。癌癥是細胞生長、繁殖失去控制，使組織和器官異常增生、弱化或喪失應有功能所致。癌是機體在各種致癌因素的作用下，局部組織異常增生而形成的新生物。癌癥往往是基因突變的結果。基因突變是生物進化的途徑和必然方式。在環(huán)境變化時，為了適應環(huán)境，生物必然要對自身做出相應的修整。在矯枉過正的時候，就形成癌癥。
據(jù)有關資料統(tǒng)計，全世界因癌癥死亡人數(shù)在1975年約380萬，1980年為400萬，1985年為500萬，1997年為624萬，2000年約900萬，據(jù)估計2020年可能超過1000萬。全世界前5位癌癥分別為肺癌(98.7萬)、胃癌(77.6萬)、結直腸癌(49.5萬)、肝癌(38.6萬)和乳腺癌(37.6萬)。近年由于室內裝修造成的污染，導致血液病患者人數(shù)劇增。目前對上述各種腫瘤的治療只能采取姑息療法，或是放療、化療和手術治療。在前兩種治療方法中，的確能殺死一定量的癌細胞，但在殺傷腫瘤細胞的同時，大量的正常細胞也受到嚴重的損傷，導致免疫功能和造血功能破壞，給治療帶來諸多副作用。
細胞凋亡(apoptosis)是正常細胞對抗病毒感染和清除損傷細胞的有效辦法，該研究對人類癌癥、神經(jīng)病變、自身免疫病、艾滋病等的治療具有很高價值。凋亡指的是人體細胞的一個自毀裝置，這個裝置在生命過程中起著很重要的作用；自毀裝置出問題，就會導致很多人類疾病。很多癌癥就是因為細胞自毀過程無法正常啟動，細胞數(shù)目越來越多造成的細胞凋亡。因而細胞凋亡有重要的生物學和醫(yī)學的意義，已經(jīng)受到廣泛的重視，從2002年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎的頒發(fā)就可見一斑。細胞凋亡不同于細胞壞死，它是機體由于特定的需要而由基因控制的細胞正常性死亡。當細胞接受到凋亡信息時，細胞從完整的細胞形態(tài)皺縮成許多凋亡小體，常伴隨著細胞核的濃縮，DNA的降解，但細胞內的細胞器不會發(fā)生裂解，細胞內容物不會外漏，故凋亡細胞不會引起炎癥。凋亡小體能被鄰近的細胞或巨噬細胞吞噬，所含的內容物被消化、吸收再進入循環(huán)，凋亡不僅為機體組織細胞不斷更新提供一條安全的途徑而且是機體在自身發(fā)育過程中清除特異細胞的一種手段。所以細胞凋亡稱是為程序化細胞死亡，即是細胞的一種生理性、主動性的“自覺自殺行為”，這些細胞死得有規(guī)律，似乎是按編好了的“程序”進行的，猶如秋天片片樹葉的凋落，所以這種細胞死亡才稱為“細胞凋亡”。新生兒、嬰兒、兒童到青少年，在這一系列人體發(fā)育成熟之前的階段，總體來說細胞誕生的多，死亡的少，所以身體才能發(fā)育。發(fā)育成熟后，人體內細胞的誕生和死亡處于一個動態(tài)平衡階段，一個成年人體內每天都有上萬億細胞誕生，同時又有上萬億細胞“程序性死亡”。在健康的機體中，細胞的生生死死總是處于一個良性的動態(tài)平衡中，如果這種平衡被破壞，人就會患病。如果該死亡的細胞沒有死亡，就可能導致細胞惡性增長，形成癌癥。如果不該死亡的細胞過多地死亡，比如受艾滋病病毒的攻擊，不該死亡的淋巴細胞大批死亡，就會破壞人體的免疫能力，導致類似艾滋病發(fā)作。細胞凋亡的概念，由Kerr于1972年首先提出，目前一些國家的科學家已經(jīng)開始利用“程序性細胞死亡”的機理，研究可以治療多種疾病的新方法，而另一些科學家繼續(xù)用生物和化學辦法探討細胞凋亡有關的問題。近階段科學家們開始利用已經(jīng)了解的細胞凋亡的機理來治療與細胞凋亡的許多疾病，如自身免疫疾病、AIDS、T cell衰竭、神經(jīng)衰竭、控制細胞增殖和分化、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程。尤其在腫瘤的治療方面產(chǎn)生了一種與傳統(tǒng)方法完全不同的全新的方法——細胞凋亡療法。例如子宮內膜細胞凋亡、增殖失衡可能是子宮腺肌病的發(fā)病機理之一。通過誘導腫瘤細胞凋亡達到腫瘤縮小、消退的目的，已成為當今腫瘤治療的研究熱點。目前自殺基因療法的臨床研究腫瘤類型主要有腦膠質瘤、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、頭頸部扁平細胞癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、結腸癌、非小細胞肺癌、眼癌、陰莖癌等，結果均表明利用自殺基因進行腫瘤治療的有效性和安全性。又如在細胞數(shù)量的精細調控，潛在危險細胞的清除及生物體的胚胎發(fā)育等三個方面，細胞凋亡發(fā)揮重要作用。在具體個案中，如發(fā)現(xiàn)胃癌中不僅存在細胞增生，同時也存在細胞凋亡，胃癌的發(fā)生是細胞凋亡與增生比例失調的結果。
腫瘤的手術、放療、化療及介入治療給眾多腫瘤患者帶來了生存的希望，但迄今為止，腫瘤仍是對人類危害最大的疾病之一。經(jīng)過近半個世紀的研究，人們發(fā)現(xiàn)，植物中的抗癌活性成分，如多糖類物質，能殺傷腫瘤細胞，且對正常細胞具有一定的保護作用。新近研究表明，中藥可有效誘導腫瘤細胞凋亡，為腫瘤患者帶來了福音。
細胞凋亡是普遍存在于多細胞生物體內的一種自發(fā)、主動的細胞死亡過程，是生物體維持細胞數(shù)量相對穩(wěn)定的固有機制，這一機制若有障礙或發(fā)生異常，就有可能引發(fā)腫瘤或其他病變。而腫瘤是一種細胞凋亡過少而增殖過多的疾病，若能抑制腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡，腫瘤細胞就有可能停止生長，因而中藥誘導腫瘤細胞凋亡已成為一條很有希望的治療腫瘤的新途徑。目前常用的誘導腫瘤細胞凋亡的中藥有中藥單方制劑全蝎水浸液提取物可誘導HL-60細胞凋亡，凋亡比例隨藥物濃度增高而上升。蛇六谷能有效誘導小鼠腫瘤細胞凋亡。土貝母對體外培養(yǎng)的人腎顆粒細胞癌和褐鼠移植性人腎顆粒細胞癌的生長均具有明顯的抑制作用。中藥復方制劑國內外醫(yī)學界先后報道十全大補湯、六君子湯、人參養(yǎng)顏湯、小柴胡湯、當歸補血湯等均具有誘導不同腫瘤細胞凋亡的作用。日本學者對小柴胡湯的研究最為細致，他們采用小柴胡湯的柴胡皂甙、人參皂甙、甘草甜素、黃芩皂甙及其水溶性全部成分，分別處理體外培養(yǎng)的肝癌細胞株、膽管癌細胞株、正常大鼠肝細胞和正常人外周淋巴細胞。結果發(fā)現(xiàn)，各藥效成分單獨使用對癌細胞株的凋亡誘導率很低，而小柴胡湯全成分作用最為明顯，并有濃度依賴性，且所有試藥對正常細胞都沒有影響。
該實驗表明，中藥復方在誘導腫瘤細胞凋亡方面較中藥提取成分更有效。
中藥有效提取成分紫杉醇是從天然植物紅豆杉中提取的抗癌藥，可誘導人急性早幼粒細胞白血病、人乳腺癌細胞、人食管癌細胞的凋亡。欖香烯是從中藥莪術中提取的有效成分，具有廣譜抗腫瘤活性，可誘導人白血病細胞和人肝癌腹水瘤細胞凋亡，并明顯影響腫瘤細胞的分裂周期。喜樹堿是從中藥喜樹中提取的有效成分，可誘導白血病細胞、人胰腺癌細胞凋亡。蟾酥是從蟾蜍分泌物中經(jīng)干燥后形成的固狀物，除具有強心作用外，還對人白血病細胞系、大腸癌細胞系有誘導凋亡作用。蟾酥對人癌細胞具有特異性，對大鼠和小鼠的癌細胞幾乎沒有影響。槲皮素、淫羊藿甙、葉秋堿、姜黃素、地榆鞣質、芹菜素、天花粉蛋白、漢防己堿、熊果酸等都對腫瘤細胞有誘導凋亡作用。
大量的臨床實踐和研究證明，采用中醫(yī)藥結合化療治療腫瘤，可取得較單純一采用化療更好的治療效果。這樣做，一是能增強化療藥物對癌細胞的殺傷能力，減輕化療的毒副反應，使化療順利完成，并有效提高腫瘤患者的生存質量和生存率。二是能保護和增強免疫功能，抑制腫瘤生長。全球第一個靈芝抗癌藥物雙靈固本散(原中華靈芝寶)是我國唯一批準的“國藥準字”靈芝抗癌藥品，已經(jīng)被美國成為進入美國市場的第一個中國的抗癌中藥。這是目前中藥抗癌的最大成果。
化療會導致機體免疫功能低下。免疫功能低下是腫瘤進展、復發(fā)和轉移的根源之一。中醫(yī)扶正培本的中藥(如黃芪、太子參、白術、茯苓、薏苡仁、女貞子、枸杞子等)，既可以減輕化療毒性和不良反應癥狀，促進骨髓造血功能，又可以拮抗化療的免疫抑制作用。近年來，誘導緩解—扶正治療—鞏固治療—扶正治療的治療模式或程序，已廣泛用于實體瘤的治療。中藥治療癌癥、誘導腫瘤細胞凋亡具有毒副作用小和不易復發(fā)等優(yōu)點，在腫瘤手術、放療、化療及介入治療的同時，按照中醫(yī)辨證施治的原則，選擇有關中藥配入煎劑或復方中，可提高臨床療效，延長腫瘤患者生存時間，提高腫瘤患者生活質量。
另一方面腫瘤細胞的耐藥性限制了化學藥物的治療效果，是化療失敗的主要原因。腫瘤的耐藥性是指腫瘤對化學藥物的不敏感性。據(jù)統(tǒng)計，90％以上接受化療的腫瘤患者的死亡與耐藥有關。根據(jù)腫瘤細胞的耐藥特點，耐藥可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥(MDR)兩大類，多藥耐藥是指腫瘤細胞接觸一種抗癌藥物后產(chǎn)生對多種抗癌藥物的耐受性。因此，人們開始從中草藥中尋求有效成分或復方以逆轉MDR，并已初見成果。
鈣通道阻滯一些中藥具有鈣通道阻滯作用，我國學者受到鈣通道阻滯劑異搏定抗多藥耐藥作用的啟發(fā)，做了大量中藥逆轉MDR的研究。證實中藥鈣離子通道阻滯劑人參皂苷單體(Rb1)可以逆轉白血病多藥耐藥細胞系(K-562/HHT)的多藥耐藥性，并呈劑量依賴性；雙芐基異喹啉類生物堿是具有鈣通道阻滯作用的中藥單體，在體外實驗中有MDR逆轉活性，其作用機理與異搏定相似，均有膜調節(jié)作用。該研究還在國內外率先開展了用中藥逆轉腫瘤細胞多藥耐藥性的研究，這些中藥主要有丹參、川芎嗪、蝙蝠葛堿、丹皮酚、人參皂甙Rg3、欖香烯及其衍生物、紫杉醇、赤芍、大黃、桃仁、補骨脂、雄黃、三氧化二砷、蝎毒等。研究表明，上述中藥有明顯的逆轉腫瘤多藥耐藥性的作用，其中丹參、川芎嗪、丹皮酚等臨床毒副作用小，在臨床可大劑量應用；欖香烯、紫杉醇、雄黃等本身就是抗腫瘤藥，在臨床上與其他抗腫瘤藥聯(lián)合應用，既可發(fā)揮其身自的殺瘤作用，又兼有逆轉腫瘤多藥耐藥作用。
由此可見，在抗癌藥品的研發(fā)過程中，中藥是很有潛力的研究方向。中醫(yī)中藥治癌對于減輕癌癥病人的癥狀和痛苦，提高生存質量，延長生命，降低癌癥的死亡率，都有其重要的意義。
眾所周知，蕨類植物和人類的關系非常密切，我國勞動人民很早就用蕨類植物來治病。到目前為止，作為藥用的蕨類，至少有一百多種，如杉蔓石松能祛風濕，舒筋活血；節(jié)節(jié)草能治化膿性骨髓炎；烏蕨可治菌痢、急性腸炎、瘡毒；長柄石韋可治急、慢性腎炎、腎盂腎炎等；綿馬鱗毛蕨和其許多近親種可治牛羊的肝蛭?。缓＝鹕持文虻栏腥?、尿道結石；卷柏外敷，治刀傷出血；江南卷柏治濕熱黃疸、水腫、吐血等癥；陰地蕨治小兒驚風；骨碎補能堅骨補腎、活血止痛；金毛狗的鱗片能止刀傷出血；槲蕨能補骨鎮(zhèn)痛，治風濕麻木；貫眾的根狀莖可治蟲積腹痛、流感等癥，亦用作除蟲農(nóng)藥，及毒蛇咬傷藥等等。傣族傳統(tǒng)野生植物的用途及引種記載水蕨可以治扁桃體炎。
水蕨，屬蕨類植物，系水蕨科(Parkeriaceae)，生于深山密林水溝兩旁或水中或陰濕之地，學名為Ceratopteris thalictroides(Linn.)Brongn，(《中國高等植物圖鑒》第1冊，科學出版社1972年版)。為一年水生草本，綠色多汁，葉肉質，根狀莖短，起立，葉簇生。葉片長約10-35公分，光滑無毛，二型，二到三回羽狀裂葉，營養(yǎng)葉柄與葉片約等長，網(wǎng)狀脈，網(wǎng)眼間無游離小脈，呈叢生狀，營養(yǎng)葉狹長橢圓形，葉片較短，裂片較寬、扁平，草綠色或黃綠色，小羽片凹入處常有不定芽。孢子葉則較長，分裂更細，葉狹長線形深裂，孢子囊則生于孢子葉的邊緣反卷處。其廣泛分布于我國江蘇、浙江、福建、臺灣、廣東、云南、四川、湖北和安徽等地。水蕨也產(chǎn)于東南亞及澳大利亞；但分布零散，已作為我國保護植物之一。我國民間有使用水蕨治病的實例。明代李時珍著《本草綱目》下冊第1669頁記載水蕨似蕨，生水中。氣味甘、苦、寒、無毒，有解毒、止血，治痞積、菌痢、胎毒、跌打損傷等功效?！度A南千種草藥》記載水蕨“解毒、止血、止痢、止咳”。
此外專利號為CN1176306A中國發(fā)明專利公開了一種以水蕨為原料制作的水蕨酒及其加工方法，該酒具有清熱解毒消炎功能，對咽喉炎、胃腸炎、肝炎具有意想不到的獨特療效。但至目前為止，尚未見到水蕨水提取物及其在制備抗腫瘤制劑中應用的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題一方面是提供一種水蕨提取物，另一方面是提供上述水蕨提取物在制備抗腫瘤制劑中的應用，以有效抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡。
本發(fā)明解決的技術問題可以通過以下技術方案來實現(xiàn)水蕨提取物，該水蕨水提取物可由下述方法制備獲得稱取水蕨干化植物，洗凈后放入提取灌，然后加入雙蒸水，加熱提取并收集第一次的提取液；再加入蒸餾水，加熱提取兩次并分別收集第二次和第三次的提取液；合并三次提取液，過濾并于室溫靜置，過濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮至浸膏狀，即得水蕨提取物。
上述制備過程中，第一次提取時，加入雙蒸水的量為水蕨干化植物的7倍體積量，提出時間為60分鐘；第二次提取時，加入蒸餾水的量為水蕨干化植物的2倍體積量，提取時間為30分鐘；第三次提取時，加入蒸餾水的量為水蕨干化植物的1/3倍體積量，提取時間為15分鐘。
所述過濾液于室溫靜置過夜。
所獲得的水蕨提取物，每1克浸膏等于2.857克生藥。
本發(fā)明所述的水蕨提取物用于制備抗腫瘤制劑時，可有效抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡。
具體實施例方式
以下通過實施例來進一步闡述本發(fā)明所述水蕨提取物以及該水蕨提取物制備的抗腫瘤制劑在有效抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡方面的有益效果。
需要注意的是下面的實施例僅用作舉例說明，本發(fā)明內容并不局限于此。
水蕨水提取物可由下述方法制備獲得稱取水蕨干化植物，用蒸餾水漂洗兩次，放入提取灌，然后加入水蕨干化植物的7倍體積雙蒸水，以文火煎煮60分鐘，收集第一次的提取液，再加入2倍體積的蒸餾水，以文火煎煮30分鐘，收集第二次的提取液，最后加入1/3體積的蒸餾水，煎煮15分鐘，收集第三次的提取液，合并三次的提取液，用8層紗布過濾，室溫靜置過夜，經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮至浸膏狀(1克浸膏＝2.857克生藥)，即得水蕨水提取物。
下面通過水蕨提取物對HL-60腫瘤細胞增殖抑制和凋亡實驗來說明該水蕨提取物在制備抗腫瘤制劑中的應用。
試驗材料1).水蕨提取物用浸膏(1克＝2.857克生藥)配成0.1g/ml的濃度后，滅菌，4℃冰箱保存。
2).HL-60細胞人體白血病細胞 上海生物所購進，待細胞處于對數(shù)生長期即可用于實驗。
3).新生小牛血清(Fcs)華美公司，56℃，30分鐘滅活。
試驗方法水蕨提取物的實驗用藥的制備用電子天平稱取水蕨提取物1克，用去離子雙蒸水充分溶解，其濃度為100mg/ml。高壓鍋消毒滅菌15分鐘后冷卻，放入4℃冰箱保存待用。
細胞培養(yǎng)用含10％小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37℃，5％CO2飽和濕度孵箱培養(yǎng)細胞。每48小時傳代一次以備用。藥物處理時取對數(shù)生長期細胞，細胞濃度調整為1*105個/ml，分別與10％的小牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液和不同濃度的水蕨藥物配成不同體系，分別接種于96孔板中，每孔0.1ml。每點設8個孔，置飽和濕度，攝氏37度，5％CO2濃度孵箱培養(yǎng)，靜置培養(yǎng)2～3天待檢測。
觀察結果見表1和表2。
表1水蕨水提物對HL-60腫瘤細胞增殖作用的影響組分groups n X±S水蕨水提物的濃度(mg/ml)對照組 3 7±11 3 13.33±2.0810 3 25.67±1.5320 3 35.67±2.52★30 3 44.33±2.08★注與對照組比較，經(jīng)t檢驗P＜0.01，★P＜0.001
表2水蕨水提物對HL-60腫瘤細胞凋亡率的影響組分groups n X±S水蕨水提物的濃度(mg/ml)對照組 3 10.67+1.531 3 16+210 3 30.33+2.52★20 3 38.33+1.52★30 3 48.33+4.52★注與對照組比較，經(jīng)t檢驗P＜0.05，★P＜0.01結果表明，水蕨水提物能夠增加HL-60腫瘤細胞的死亡率，加入不同濃度的水蕨藥物后，細胞的死亡率明顯增加，死亡率隨濃度線性增長(r＝0.996282)。同時水蕨水提物能夠誘導HL-60腫瘤細胞的凋亡，加入不同濃度的水蕨藥物后，細胞的凋亡率明顯增加，凋亡率隨濃度線性增長(r＝0.992973)。
權利要求
1.水蕨提取物，其特征在于由下述方法制備獲得稱取水蕨干化植物，洗凈后放入提取灌，然后加入雙蒸水，加熱提取并收集第一次的提取液；再加入蒸餾水，加熱提取兩次并分別收集第二次和第三次的提取液；合并三次提取液，過濾并于室溫靜置，過濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮至浸膏狀，即得水蕨提取物。
2.根據(jù)權利要求1所述的水蕨提取物，其特征在于第一次提取時，加入雙蒸水的量為水蕨干化植物的7倍體積量，提出時間為60分鐘；第二次提取時，加入蒸餾水的量為水蕨干化植物的2倍體積量，提取時間為30分鐘；第三次提取時，加入蒸餾水的量為水蕨干化植物的1/3倍體積量，提取時間為15分鐘。
3.根據(jù)權利要求1所述的水蕨提取物，其特征在于所述過濾液于室溫靜置過夜。
4.根據(jù)權利要求1所述的水蕨提取物，其特征在于所獲得的水蕨提取物，每1克浸膏等于2.857克生藥。
5.一種如權利要求1所述的水蕨提取物在制備抗腫瘤制劑中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水蕨提取物，該提取物由下述方法制備獲得稱取水蕨干化植物，洗凈后放入提取灌，然后加入雙蒸水，加熱提取并收集第一次的提取液；再加入蒸餾水，加熱提取兩次并分別收集第二次和第三次的提取液；合并三次提取液，過濾并于室溫靜置，過濾液經(jīng)旋轉蒸發(fā)器濃縮至浸膏狀，即得水蕨提取物。本發(fā)明更進一步提供了該水蕨提取物在制備抗腫瘤制劑中的應用，應用本發(fā)明所述的水蕨提取物制備的抗腫瘤制劑可有效抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡。
文檔編號A61P35/00GK1733000SQ20051002918
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月29日 優(yōu)先權日2005年8月29日
發(fā)明者吳世福, 李興玉, 王雅琴 申請人:上海師范大學