專利名稱：緩釋型γ－干擾素納米膠囊及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及緩釋型γ-干擾素納米膠囊及其制備方法，還涉及其在預防或治療纖維囊增生攣縮方面的應用。
背景技術(shù)：
整復外科手術(shù)操作中經(jīng)常有置入人工材料的需要，例如隆胸、隆鼻、局部組織凹陷充填或皮膚擴張術(shù)中置入的硅膠假體、Medpor、PTFE高分子材料或擴張器等。盡管目前人工材料制備工藝已經(jīng)很先進，但是硅膠之類人工材料對于人體仍然是異物，在置入人體后其表面會產(chǎn)生一層纖維包膜，如果這層纖維包膜過度增生并攣縮，則可對術(shù)后效果產(chǎn)生很大影響。以隆乳為例，隆乳術(shù)后出現(xiàn)的一些常見并發(fā)癥如乳房變形、硬化、攣縮等都與之有關。據(jù)國外資料統(tǒng)計，隆乳術(shù)后發(fā)生纖維囊攣縮的發(fā)生率最低在5％-10％，有些甚至高達80％(silverman BG，Brown SL，Bright RA，et al.Reported complications of silicone gel breast implantsanepidemiologic review[J].Ann Intern Med，1996，124744～756；BurkhardtBR.Comparing contracture ratesprobability theory and unilateral contracture(Editorial)[J].Plast Reconstr Surg，1984，74527；Kjoller K，Holmich LR，Jacobsen PH，et al.Capsular constracture after cosmetic breast implant srugery in Denmark[J].AnnPlast Surg，2001，47359～366)。即使術(shù)后采用傷口引流滲液，包膜周圍藥物注射，纖維囊攣縮仍不能完全避免，而且包膜一旦發(fā)生攣縮，處理起來也比較困難，且復發(fā)率較高。
γ-干擾素是抗原或有絲分裂原等刺激Th1細胞產(chǎn)生的糖蛋白，稱為II型干擾素，具有抑制細胞增殖，誘導細胞分化，增強NK和巨噬細胞活性等作用，達到抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)的功能(陸德源.現(xiàn)代免疫學進展[M].上海上海科學技術(shù)出版社，1995，60～69)。纖維包膜形成和攣縮的機制主要是成纖維細胞行為異常，造成細胞外基質(zhì)的過量沉積而造成的，目前對于γ-干擾素在抗纖維化方面作用的研究也著力于對成纖維細胞的調(diào)控機制，研究表明γ-干擾素具有以下作用(1)抑制成纖維細胞增殖；(2)抑制膠原合成；(3)促進膠原降解；(4)抑制α-SMA的合成。γ-干擾素在抗纖維化方面的作用可以被用來嘗試預防纖維包膜的產(chǎn)生和攣縮。但是單純應用γ-干擾素也存在著幾個問題(1)γ-干擾素半衰期過短，皮下注射時其半衰期僅為9.35個小時；(2)大量使用γ-干擾素會產(chǎn)生發(fā)熱及肌肉酸痛等類似流感癥狀的副反應。所以靠單純增加用藥量及縮短用藥間隔時間以提高療效是行不通的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種緩釋型γ-干擾素納米膠囊，使γ-干擾素的理化特性更穩(wěn)定，延長半衰期，另一目的是提供一種緩釋型γ-干擾素納米膠囊的制備方法，還有一個目的是為整復外科預防纖維囊增生攣縮提供一種新的給藥方式和治療手段。
本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是這樣的目前采用納米技術(shù)研制出的納米緩釋、控釋系統(tǒng)包括納米粒子和納米膠囊，它們作為藥物載體，具有許多優(yōu)越性①可緩釋藥物，從而延長藥物作用時間；②可達到靶向輸送作用；③可在保證藥物作用的前提下，減少給藥劑量，從而減輕或避免毒副反應；④可提高藥物穩(wěn)定性，有利于儲存；⑤也可以建立一些新的給藥途徑。發(fā)明人認為，如果將γ-干擾素通過藥劑學與納米材料技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建緩釋型γ-干擾素納米膠囊，通過核殼型控釋納米膠囊良好的藥物傳遞性能和緩釋功能，使γ-干擾素的理化特性更穩(wěn)定，延長半衰期，在不增加用藥量的前提下盡可能延長作用時間，獲得對纖維包膜囊形成及攣縮理想的治療效果。
本發(fā)明的緩釋型γ-干擾素納米膠囊，是將溶液狀γ-干擾素包封于核殼型控釋納米膠囊中，所述的核殼型控釋納米膠囊由聚電解質(zhì)組成。
所述的核殼型控釋納米膠囊的直徑為200nm左右。所述的聚電解質(zhì)含胺基、羧基、羥基或磺酸基等極性基團。
所述的核殼型控釋納米膠囊以納米明膠粒子為模板。
所述的的緩釋型γ-干擾素納米膠囊制備方法，包括核殼型控釋納米膠囊的制備和γ-干擾素藥物的包封；其中，核殼型控釋納米膠囊的制備以納米明膠粒子作為固相模板，采用的是華東理工大學超細材料制備與應用教育部重點實驗室首創(chuàng)的膠粒模板逐層靜電自組裝技術(shù)；制備方法在《納米明膠粒子的制備及表面改性》(丁素麗，朱以華，楊曉玲，華東理工大學學報(自然科學版)，2004，30，5523-526)中有詳細介紹，在此不再詳述；制得核殼型控釋納米膠囊后，用常用的酸融法或熱熔法去除中心納米明膠粒子；γ-干擾素藥物的包封包括如下步驟1)注射用人重組干擾素γ凍干粉劑溶于生理鹽水，配制γ-干擾素溶液；2)溫下，將步驟1)得到的干擾素γ溶液與核殼型控釋納米膠囊混合，使用超聲波震蕩器震蕩，使其完全混勻，沒有絮狀或沉淀物；3)室溫下，將步驟2)得到的γ-干擾素與核殼型控釋納米膠囊的混合物置于電動搖床上震蕩23～25hr，得到緩釋型γ-干擾素納米膠囊。
所述的緩釋型γ-干擾素納米膠囊制備方法根據(jù)需要，還可包括過濾滅菌步驟或制備過程為無菌操作。
用上述方法制備的緩釋型γ-干擾素納米膠囊，藥物膠囊中的γ-干擾素包封率為67.78％，載藥量為338.9ug(PH＝5～6，γ-干擾素濃度為20萬IU/ml，膠囊溶液2ml)，藥物膠囊中的γ-干擾素釋出率達到50％時需要168小時(一周)，而原注射用干擾素針劑的半衰期約為9.35個小時。將制得的緩釋型γ-干擾素納米膠囊用于動物學試驗，能夠有效地抑制包膜增生并降低其攣縮，為預防纖維囊增生攣縮提供了一種新的給藥方式和治療手段。


附圖1為緩釋型γ-干擾素納米膠囊的釋藥曲線。
附圖2為兔背部淺筋膜下埋置圓形橡膠塊術(shù)后照片。
附圖3為埋置于背部的橡膠塊照片。
附圖4為將橡膠塊連帶外周包膜組織一同完整取下的照片。
圖5a為3個月時未經(jīng)任何處理組的橡膠塊及包膜(A組)；圖5b為3個月時生理鹽水組的橡膠塊及外周包膜(B組)，情況與A組接近；圖5c為3個月時使用cγ-干擾素注射后的橡膠塊及外周包膜(C組)，外觀介于a、d組之間，能看到清楚完整地的纖維包膜，但較空白組質(zhì)地疏松，張力較小；圖5d為3個月時使用緩釋型γ-干擾素納米膠囊注射后的橡膠塊及外周包膜(D組)，取材時發(fā)現(xiàn)橡膠塊外周包膜與周圍組織粘連、分界不清，很難完整清楚地分離出纖維包膜。
圖6為纖維包膜結(jié)構(gòu)(HE染色，x100)照片，A細胞層B細胞纖維層C纖維板層。
圖7分別為A組(HE染色，x40)、B組(HE染色，x40)、C組(HE染色，x40)、D組(HE染色，x40)。
圖8分別為A組Masson染色，x100；B組Masson染色，x100；C組Masson染色，x100；D組Masson染色，x100。
圖9分別為A組(α-SMA，x40)；B組(α-SMA，x40)；C組(α-SMA，x40)；D組(α-SMA，x40)。
具體實施例方式
下面將結(jié)合實施例進一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實施例并不限制本發(fā)明的保護范圍。
實施例1將ω＝0.05的明膠水溶液在55℃的水浴中預熱，快速注入相應量的丙酮，丙酮的體積分數(shù)為0.375～0.474，靜置分層，去除上層白色濁液和固體，余下部分重新在水浴中溶解，調(diào)節(jié)PH值至2～4，滴加丙酮至液體呈乳白色為止，用磁力攪拌器在冰浴中攪拌，加入戊二醛固化，膠凝時間10～20分鐘。然后將濃度為0.8～1.2g/l的聚對苯乙烯黃酸鈉(PSS，Mr＝1400)雙蒸水溶液加入到明膠粒子的懸濁液中，吸附30min，離心分離，得到核殼型控釋納米膠囊，膠囊直徑為200nm左右。然后將核殼型控釋納米膠囊浸沒在10ml/mol的HCl溶液中去除納米明膠粒子，得到核殼型控釋空腔納米膠囊。
實施例2以2ml生理鹽水溶解1小瓶人重組干擾γ(商品名克隆伽瑪)凍干粉劑(上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司產(chǎn)品)，規(guī)格為100萬國際單位(IU)/瓶克，使其完全溶解，再將其稀釋至5ml，濃度為20萬IU/ml。室溫下，將配置的克隆伽瑪溶液與實施例1得到的核殼型控釋空腔納米膠囊混合，使用超聲波震蕩器震蕩30秒，使其完全混勻，沒有絮狀或沉淀物。然后，在室溫下，將克隆伽瑪及核殼型控釋空腔納米膠囊的混合物至于電動搖床上震蕩24小時。
通過以上方法制備而成的緩釋型γ-干擾素納米膠囊，γ-干擾素的藥物濃度為100萬IU/5ml，經(jīng)瑞金醫(yī)院核醫(yī)學科采用同位素I125示蹤方法測定，藥物膠囊中的γ-干擾素包封率為67.78％，載藥量為338.9ug(PH＝5～6，膠囊溶液2ml)，藥物膠囊中的γ-干擾素釋出率達到50％時需要168小時(一周)，而原注射用干擾素針劑的半衰期約為9.35個小時。
緩釋型γ-干擾素納米膠囊對于纖維包膜形成及攣縮影響的動物學試驗此部分研究通過建立纖維包膜增生攣縮的動物模型，應用納米包裹的γ-干擾素局部注射治療，觀察使用緩釋型γ-干擾素納米膠囊后，埋入物纖維包膜的形成和攣縮同單純使用γ-干擾素達到的治療結(jié)果的差異，以此來了解緩釋型γ-干擾素納米膠囊局部應用對于纖維包膜的形成和攣縮的影響。
一、驗材料(一)主要試劑10％中性福爾馬林蘇木精、伊紅等常用染色試劑Masson復合染色液等特殊染色試劑兔抗人α-SMA單克隆抗體DAKO公司
ENVISION反應抗原試劑 DAKO公司其余試劑均為國產(chǎn)分析純(二)主要儀器自動脫水機(TP1050) SHANDON公司石蠟切片機(JUNG BIOCUT 2035) SHANDON公司顯微鏡 NIKON公司蒸鍋 松下公司Adobe Photoshop CS 8.01 Adobe公司濕盒 上海中達科技有限公司二，實驗方法(一)動物的選擇、分組及處理選取檢疫合格的雄性新西蘭大白兔16只，體重2.0～2.5kg，隨機分為A(空白對照組)、B(生理鹽水組)、C(γ-干擾素組)、D(緩釋型γ-干擾素納米膠囊組)四組，每組各四只，采用氯胺酮+速眠新肌肉注射麻醉，分別于每只兔子背部淺筋膜下埋置入6塊橡膠塊(經(jīng)消毒后的圓形安瓿橡膠塞)模擬置入的假體，傷口連續(xù)縫合。B、C、D三組分別于術(shù)后即刻、2周、1月和2月進行藥物注射處理，按不同組別分別在各兔子背部置入物周圍注入生理鹽水、γ-干擾素或緩釋型γ-干擾素納米膠囊各5ml，C、D組每點包含的γ-干擾素含量為100萬IU；A組不作任何處理，用以觀察纖維包膜形成和攣縮的過程。
于埋置物埋入后的1個月、2個月各組均處死一只兔子取材觀察；3個月時將剩余的4組共8只兔子處死，取得標本共48個，進行大體及鏡下觀察。
使用耳緣靜脈空氣注射法處死實驗動物，將其背部皮膚及淺筋膜切開翻起，完整地取出埋置物及其表面形成的纖維包膜，將其完全浸入10％中性福爾馬林液中固定一周，去處橡膠塊后將包膜組織常規(guī)脫水和石蠟包埋，切制成4um厚的組織片。
(二)組織標本的處理及觀察
1，大體觀察將橡膠塊及外周包膜完整取出后肉眼觀察其外觀、色澤及質(zhì)地2，HE染色光鏡下觀察纖維包膜組織學結(jié)構(gòu)并測量包膜厚度步驟1，中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水2，切片標本先經(jīng)蘇木精溶液染色3，分色、水洗4，伊紅染色5，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固3，Masson三色染色光鏡下觀察纖維包膜中膠原纖維的分布情況步驟1，中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水2，Masson復合染色液5分鐘3，0.2％醋酸水溶液稍洗4，5％磷鎢酸5～10分鐘5，0.2％醋酸水溶液浸洗2次6，亮綠染色液5分鐘，0.5％醋酸水洗2次7，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固4，免疫組織化學染色測定α-SMA觀察纖維包膜中α-SMA的表達量，進行半定量分析步驟1，常規(guī)切片4um2，二甲苯脫蠟20分鐘×3次3，梯度酒精水化100％--95％--80％--70％--50％--ddH2O各5分鐘4，原修復切片置于盛有250ml 10mmol的檸檬酸緩沖液(PH6.0)的專用塑料染色缸中，將缸放入100攝氏度的蒸鍋中煮10分鐘，然后保溫10分鐘，放入冷水中冷卻。
5，切片，TBS沖洗2～3次。(將標本周圍的緩沖液擦干)6，一抗孵育將切片置于濕盒中，滴入一抗(Dako Cytomation生產(chǎn)的兔抗人α-SMA單克隆抗體，1∶150)，4攝氏度過夜。
7，抗孵育TBS緩沖液沖洗切片2～3次，滴加ENVISION抗原試劑，50ul/片滴加切片，4攝氏度放置30分鐘8，BS緩沖液沖洗切片2～3次9，DAB顯色室溫下孵育2～10分鐘，顯微鏡觀察顯色情況，顯色好即用流水沖洗終止反應。
10，后處理蘇木素襯染細胞核，鹽酸酒精分化脫水，二甲苯透明，干燥后用中性樹膠封片.
11，光鏡下觀察結(jié)果，并輔助以計算機圖像進行半定量分析。每個標本隨機選取5個視野，在400倍放大下攝制照片，使用Adobe Photoshop CS 8.01圖像處理軟件測定單位面積內(nèi)棕色顆粒(陽性顆粒)所占的比例，將測得的數(shù)據(jù)通過SAS6.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行分析，檢驗各實驗組的纖維包膜中α-SMA表達水平是否存在差異。
三、結(jié)果(一)大體觀察觀察埋置物表面纖維包膜的外觀，質(zhì)地及厚度。
由圖5可以看出，3個月時未經(jīng)任何處理組(A組)的橡膠塊及包膜，可見橡膠塊外周包裹一層完整的包膜，與周圍組織分界清楚，可以完整地與周圍組織分開，包膜較質(zhì)地緊密，張力較大；3個月時生理鹽水組(B組)的橡膠塊及外周包膜，情況與A組接近；3個月時使用γ-干擾素(C組)注射后的橡膠塊及外周包膜，外觀介于A、D組之間，能看到清楚完整地的纖維包膜，但較空白組質(zhì)地疏松，張力較小；3個月時使用緩釋型γ-干擾素納米膠囊(D組)注射后的橡膠塊及外周包膜，取材時發(fā)現(xiàn)橡膠塊外周包膜與周圍組織粘連、分界不清，很難完整清楚地分離出纖維包膜。
(二)纖維包膜組織學結(jié)構(gòu)的觀察將組織切片進行HE染色，鏡下觀察纖維包膜囊見到3層結(jié)構(gòu)(見圖6)(1)細胞層位于包膜囊內(nèi)側(cè)，與埋置物接觸的一側(cè)，一般較薄，主要含有炎性細胞、少量成纖維細胞并有少量膠原纖維；(2)細胞纖維層位于纖維包膜的中間部分，含大量成纖維細胞及大量膠原纖維，膠原纖維呈平行排列，其中可見毛細血管；(3)纖維板層位于纖維包膜的最外層，含有大量致密的膠原纖維，但其中的成纖維細胞少于細胞層。
(三)纖維包膜厚度測量將3個月時取材所得的48個標本切片做HE染色，在光鏡下觀察切片中纖維包膜厚度，將觀察到的圖像攝影存入計算機，使用Adobe Photoshop CS軟件處理圖像，在每張切片相近部位任取3點測量纖維包膜的厚度(細胞層、細胞纖維層、纖維板層三層厚度)取平均值，將軟件測得的數(shù)據(jù)直接使用SAS6.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行分析，檢驗發(fā)現(xiàn)各實驗組的纖維包膜厚度存在顯著性差異(見圖7)，各組纖維包膜厚度測量數(shù)據(jù)分析見表1。
表1 各組纖維包膜厚度測量數(shù)據(jù)分析

SNK檢驗A、B、C字母不同表示測得的厚度數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P＜0.01)(四)Masson三色染色通過masson染色觀察纖維組織包膜中膠原纖維的含量及分布，結(jié)果判讀膠原纖維呈綠色，肌纖維呈紅色，紅細胞呈橘紅色。
Masson染色發(fā)現(xiàn)空白組和生理鹽水組(A和B組)的纖維包膜三層結(jié)構(gòu)中含有大量深染成綠色的膠原纖維，排列致密；單純γ-干擾素組(C組)中也可見染成綠色的膠原纖維，但染色明顯較A、B組為淡，且膠原纖維排列疏松；緩釋型γ-干擾素納米膠囊組Masson染色可見纖維包膜三層結(jié)構(gòu)中膠原纖維量明顯少于前三組，且染色為各實驗組中最淡，在細胞纖維層膠原纖維量明顯減少，相反可以見較多中性粒細胞等炎性細胞，細胞板層膠原纖維排列疏松(見圖8)。
(五)免疫組織化學染色測定α-SMA光鏡下觀察結(jié)果，并輔助以計算機圖像進行半定量分析。每個標本隨機選取5個視野，在400倍放大下攝制照片(見圖9)，使用Adobe Photoshop CS 8.01圖像處理軟件測定單位面積內(nèi)棕褐色顆粒(陽性顆粒)所占的比例，將測得的數(shù)據(jù)通過SAS6.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)各實驗組的纖維包膜中α-SMA表達水平存在顯著性差異(見表2)。
表2 各組纖維包膜中α-SMA陽性表達率數(shù)據(jù)分析

SNK檢驗A、B、C字母不同表示測得的厚度數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P＜0.01)通過上述對各個實驗組標本的觀察研究，測定各實驗組包膜的厚度、MASSON特殊染色觀測膠原含量及分布情況，免疫組化方法半定量測定纖維包膜組織中α-SMA的含量，發(fā)現(xiàn)緩釋型γ-干擾素納米膠囊能夠明顯地減少細胞纖維層和纖維板層中成纖維細胞和膠原纖維的含量，從而有效地抑制纖維包膜的增生，減少纖維包膜的厚度。同時緩釋型γ-干擾素納米膠囊還能夠有效地抑制成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，抑制α-SMA的表達，從而達到減少纖維包膜攣縮程度的目的。
權(quán)利要求
1.一種緩釋型γ-干擾素納米膠囊，其特征在于溶液狀的γ-干擾素包封于核殼型控釋納米膠囊中，所述核殼型控釋納米膠囊由聚電解質(zhì)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的緩釋型γ-干擾素納米膠囊，其特征在于所述的核殼型控釋納米膠囊直徑為200nm左右。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的緩釋型γ-干擾素納米膠囊，其特征在于所述的核殼型控釋納米膠囊以明膠納米粒子作為固相模板。
4.權(quán)利要求3所述的緩釋型γ-干擾素納米膠囊制備方法，包括核殼型控釋納米膠囊的制備和γ-干擾素藥物的包封；其中，核殼型控釋納米膠囊的制備以納米明膠粒子作為固相模板，采用的是華東理工大學超細材料制備與應用教育部重點實驗室首創(chuàng)的膠粒模板逐層靜電自組裝技術(shù)；然后用酸溶法或熱熔法去除核殼型控釋納米膠囊中的納米明膠粒子；γ-干擾素藥物的包封包括如下步驟1)將注射用人重組干擾素γ凍干粉劑溶于生理鹽水，配制γ-干擾素溶液；2)室溫下，將步驟1)得到的干擾素γ溶液與核殼型控釋空腔納米膠囊混合，使用超聲波震蕩器震蕩，使其完全混勻，沒有絮狀或沉淀物；3)室溫下，將步驟2)得到的γ-干擾素與核殼型控釋空腔納米膠囊的混合物置于電動搖床上震蕩23～25hr，得到緩釋型γ-干擾素納米膠囊。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的緩釋型γ-干擾素納米膠囊制備方法，還包括過濾滅菌步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的緩釋型γ-干擾素納米膠囊制備方法，其特征在于制備過程為無菌操作。
7.權(quán)利要求1～3任一種緩釋型γ-干擾素納米膠囊在制備預防纖維囊增生攣縮藥物的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種緩釋型γ－干擾素納米膠囊及其制備方法，還涉及其在整復外科領域中預防纖維囊增生攣縮的應用。所述的緩釋型γ－干擾素納米膠囊，包封于核殼型納米膠囊中。藥物膠囊中的γ－干擾素包封率為67.78％，載藥量為338.9ug(pH＝5～6，膠囊溶液2ml)，藥物膠囊中的γ－干擾素釋出率達到50％時需要168小時(一周)，而原注射用干擾素針劑的半衰期約為9.35個小時。將所述的緩釋型γ－干擾素納米膠囊用于動物學試驗，能夠有效地抑制包膜增生并降低其攣縮，為預防纖維囊增生攣縮提供了一種新的給藥方式和治療手段。
文檔編號A61P43/00GK1935255SQ20051002977
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月19日
發(fā)明者章一新, 王丹茹, 朱以華 申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬第九人民醫(yī)院