專利名稱：抗蝰蛇毒血清及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗蛇毒血清及其制備方法，尤其涉及抗蝰蛇毒血清及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗蛇毒血清的研究已有100多年的歷史。首先應(yīng)用于臨床的是在印度制備的抗眼鏡蛇毒血清。以后，世界上就有許多科學(xué)工作者從事這一研究工作，均因免疫效價(jià)低，純化技術(shù)等問題而未能被廣泛應(yīng)用于臨床。高效價(jià)、高純度并廣泛用于臨床的抗蛇毒血清也才數(shù)十年的歷史。目前，世界上有20多個(gè)國(guó)家30多個(gè)機(jī)構(gòu)利用60多種毒蛇的蛇毒生產(chǎn)抗蛇毒血清，現(xiàn)有近百種單價(jià)和多價(jià)抗蛇毒血清。
我國(guó)早在1923年，首先在臺(tái)灣研制抗蛇毒血清。1969年，上海生物制品研究所開展抗蛇毒血清的研制工作。首先對(duì)分布廣、危害大、占蛇傷大多數(shù)的蝮蛇進(jìn)行研究，對(duì)抗原(蛇毒)進(jìn)行減毒處理，然后對(duì)馬匹進(jìn)行免疫，獲得滿意的效價(jià)。在1970年，由浙江醫(yī)科大學(xué)和浙江省中醫(yī)研究所承擔(dān)了臨床驗(yàn)證，結(jié)果證明精制抗蝮蛇毒血清反應(yīng)小、療效顯著，深受病者和醫(yī)務(wù)工作者的歡迎。以后又相繼研制成抗五步蛇、抗銀環(huán)蛇、抗眼鏡蛇血清?？股叨狙宓难兄瞥晒?，為我國(guó)填補(bǔ)了空白，克服了中草藥治療蛇傷的嚴(yán)重缺點(diǎn)，極大地保護(hù)了蛇傷病人的生命，取得了巨大的社會(huì)效益。
蝰蛇屬蝰科，主要分布于我國(guó)華南地區(qū)、國(guó)外馬來(lái)半島及印支諸國(guó)，它是我國(guó)主要毒蛇之一。對(duì)野外、山林及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)工作者危害極大。近幾年來(lái)，食蛇人數(shù)不斷擴(kuò)大，食蛇飼養(yǎng)咬傷者亦日益增多，特別是我國(guó)廣東、福建一帶蝰蛇咬傷病人的大大增加。
國(guó)外已有抗蝰蛇毒血清產(chǎn)品上市，主要針對(duì)分布于歐洲的蝰蛇種類制備，已生產(chǎn)使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、極北蝰、草原蝰抗血清等。英國(guó)藥典1993年版第二卷記載的河蝰、毒蝰、極北蝰、草原蝰抗血清的效價(jià)為抗Vipera ammodytes Venom(河蝰)血清每毫升中和效價(jià)不低于100LD50；抗Vipera aspis Venom(毒蝰)血清每毫升中和效價(jià)不低于100LD50；抗Vipera berus Venom(極北蝰)血清每毫升中和效價(jià)不低于50LD50；
抗Vipera ursinsi Venom(草原蝰)血清每毫升中和效價(jià)不低于50LD50；國(guó)外現(xiàn)有的產(chǎn)品主要是基于歐洲分布的蝰蛇種類制備的，由于不同種類的蝰蛇蛇毒抗原特異性具有種屬差異，國(guó)外現(xiàn)有的抗血清用于治療我國(guó)蝰蛇咬傷患者，針對(duì)性差；另外蝰蛇排毒量多，毒性強(qiáng)，咬傷后發(fā)病迅速，死亡率高，國(guó)外現(xiàn)有的抗血清效價(jià)偏低。因此，本領(lǐng)域迫切需要高效價(jià)、針對(duì)國(guó)內(nèi)分布的蝰蛇蛇毒的抗血清。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效價(jià)抗蝰蛇毒血清，以克服現(xiàn)有抗血清效價(jià)低、針對(duì)性不強(qiáng)的問題。
本發(fā)明的另一目的是提供上述抗蝰蛇毒血清的制備方法。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種以園斑蝰蛇(Vipera russelli SiamensisSmith)蛇毒為抗原，免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的抗蝰蛇毒血清，蛋白含量≤170g/l、pH 6.0-7.0、氯化鈉含量7.5-9.5g/l、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)2≥60％、中和效價(jià)≥500LD50/ml、類A型物質(zhì)≤4μg。
本發(fā)明的第二方面，提供了抗蝰蛇毒血清的制備方法，包括如下步驟1.制備免疫血漿園斑蝰蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理10~20分鐘左右，取上清凍干，用福爾馬林處理減毒，作為免疫用抗原；選擇健康馬匹，用常規(guī)方法進(jìn)行基礎(chǔ)免疫、超免疫待血漿效價(jià)超過100U/ml后采血，分離血漿；2.精制提純消化將制得的免疫血漿2-4倍稀釋，調(diào)溫至29-31℃，調(diào)節(jié)pH至3.0-3.3之間，加入溶化胃酶，消化1-1.5小時(shí)；第一次沉淀及加熱處理上述消化液加18~22％(g/ml)硫酸銨，調(diào)pH至4.8-5.2，加溫至56~60℃并保溫20~40分鐘，降溫過濾分離，取清液，棄沉淀；鹽析上述清液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4之間，每100ml加硫酸銨15~25g，取沉淀，棄清液；明礬沉淀上述沉淀稀釋至蛋白含量約1~3％(g/ml)，使沉淀完全溶解，在溫度不高于10~30℃下加入明礬溶液使最終含量為0.8-1.2％(g/ml)，調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，吸附05~1.5小時(shí)，過濾分離，取清液，棄沉淀；濃縮將上述清液用原體積1~4倍的注射用水多次稀釋，用3~5萬(wàn)分子量的濾膜超濾濃縮至原體積的5~20％使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下；原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入氯仿使最終含量為0.4~0.6％(ml/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0，得抗蝰蛇毒血清原液。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在本發(fā)明以國(guó)內(nèi)園斑蝰蛇(Vipera russelli Siamensis Smith)蛇毒為抗原，其抗原性較好；獲得的抗蝰蛇毒血清免疫效價(jià)高，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD50以上，相當(dāng)于4mg干毒，高于英國(guó)藥典之規(guī)定；在臨床試驗(yàn)中有效率為98.5％，治愈率達(dá)91％，沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，說明本發(fā)明的抗蝰蛇毒血清療效好，安全性高。
具體實(shí)施例方式
基礎(chǔ)免疫、超免疫馬匹免疫從馬體初次接受免疫原刺激，到產(chǎn)生少量抗毒素即第一次免疫應(yīng)答的出現(xiàn)，需要一定的時(shí)間。這一階段在制造抗血清的工作中被稱作“基礎(chǔ)免疫”。基礎(chǔ)免疫對(duì)于以后的強(qiáng)化免疫即所謂“超免疫”影響很大。有了第一次免疫應(yīng)答后，再次接觸同一免疫原就會(huì)迅速出現(xiàn)第二次免疫應(yīng)答，抗毒素效價(jià)將會(huì)急劇上升。由第一次應(yīng)答到第二次應(yīng)答之間的有效間隔期，將視馬體狀態(tài)與免疫原的種類、性狀及劑量等而異，一般需要1-2個(gè)月以上，也可至半年以上。即使超過一年，對(duì)首次刺激的記憶也不會(huì)完全消失，對(duì)再次刺激仍會(huì)出現(xiàn)水平相當(dāng)高的第二次應(yīng)答。對(duì)超免疫成功的馬匹予以采血并開始再次免疫注射，如此反復(fù)的每一循環(huán)通稱“1程”、“2程”……超免疫。
基礎(chǔ)免疫水平、免疫原的強(qiáng)度、注射次數(shù)及注射間隔時(shí)間、前后程間的間隔時(shí)間等都是對(duì)超免疫的成敗、免疫應(yīng)答水平的持久性以及馬體健康狀態(tài)有影響的因素，須根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)與具體條件適當(dāng)調(diào)節(jié)，制訂最佳免疫實(shí)施方案。
抗蛇毒血清的制備首要條件是蛇毒(抗原)、動(dòng)物(免疫對(duì)象)和純化設(shè)備(抗體提純)。選擇健康蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理15分鐘左右，以除去雜質(zhì)，上清經(jīng)凍干成粉狀備用。干燥蛇毒需測(cè)定其毒力，應(yīng)選擇毒性強(qiáng)、抗原譜廣(免疫電泳檢驗(yàn))的蛇毒作為抗原。
在作免疫抗原時(shí)，必須除菌處理，因?yàn)樯叨局谐；煊惺箘?dòng)物致病的厭氧菌。由于蛇毒的毒性強(qiáng)，抗原性較差，加大劑量以增強(qiáng)免疫刺激性，在免疫過程中會(huì)造成動(dòng)物死亡，所以對(duì)免疫用的蛇毒需減毒處理。減毒處理方法較多，較好的也常用的方法是福爾馬林減毒法。
為加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物的免疫刺激性，通常在抗原中加進(jìn)非特異性刺激劑，稱佐劑。可采用不完全佐劑，其配比為羊毛脂1份、石蠟油2份，置玻璃瓶中搖勻(加溫)，經(jīng)高壓滅菌，然后將滅菌佐劑與等體積抗原混合便成免疫用抗原。
作為免疫用馬，必須經(jīng)檢疫合格之健康。免疫劑量根據(jù)抗原性質(zhì)(毒性及抗原性)而定，通常以小劑量開始漸次遞增。
在免疫馬匹時(shí)注意到如下幾點(diǎn)(1)免疫原注射時(shí)采取皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈、腹腔等途徑。注射部位為頸部?jī)蓚?cè)、脊背兩側(cè)、臀部?jī)蓚?cè)。采用“多點(diǎn)分散、每點(diǎn)少量”的注射方法。
(2)按一般規(guī)律，每注射一次免疫原后，抗血清效價(jià)會(huì)發(fā)生波動(dòng)，波峰逐次升高。達(dá)到最高水平后則可能趨于逐次漸降。掌握波動(dòng)規(guī)律，抓住最好時(shí)機(jī)進(jìn)行注射與采血，對(duì)于抗血清生產(chǎn)很有利。
(3)有的馬匹在長(zhǎng)期免疫、采血的過程中，抗血清效價(jià)達(dá)到一定水平后不僅不再上升，反而逐漸跌落，對(duì)免疫原的再刺激毫無(wú)應(yīng)答。此現(xiàn)象被稱為“免疫麻痹”，可能與免疫原的性質(zhì)及注射劑量、注射的頻率及間隔時(shí)間等有關(guān)；也可能是免疫原中混雜的免疫抑制性物質(zhì)引起的。對(duì)此，應(yīng)給該馬以足夠時(shí)間的休息，以解除抑制作用，然后調(diào)整免疫方案，重新開始超免疫。
中和抗體用蛇毒減毒抗原免疫馬匹制備的馬抗蛇毒血清，主要成分為中和抗體，分子結(jié)構(gòu)與人的IgG基本相同。經(jīng)胃酶處理，IgG分子在重鏈間的二硫鍵的Fc端被切斷。切下的Fc片段無(wú)抗毒活性，不耐熱，經(jīng)繼續(xù)消化與熱變性而去除。保留下來(lái)的F(ab)2片段具有抗毒活性，其作用機(jī)理為中和抗體與蛇毒蛋白分子結(jié)合，封閉蛇毒蛋白與細(xì)胞膜上受體的結(jié)合位點(diǎn)，阻止蛇毒與人體細(xì)胞結(jié)合，起到抗毒作用。
抗體效價(jià)測(cè)定抗血清的效價(jià)測(cè)定按國(guó)際通用的中和試驗(yàn)法進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，其方法是把抗原和特異性抗體作用一定時(shí)間后，再給動(dòng)物注射，借助動(dòng)物體的反應(yīng)情況來(lái)判定抗血清的效價(jià)。本發(fā)明所用的動(dòng)物試驗(yàn)方法是以動(dòng)物死亡為反應(yīng)指征，以小白鼠注射抗蛇毒血清與蛇毒混合液后，動(dòng)物的生存死亡情況，確定血清的效價(jià)。
免疫血漿效價(jià)的測(cè)定采用固定血清劑量、改變蛇毒劑量的方法，即取1毫升血清加入1毫升含不同濃度蛇毒溶液(蛇毒以LD50、MLD或mg為單位)，混合后置37℃1小時(shí)，注射小白鼠體內(nèi)(iv或im)作中和反應(yīng)測(cè)定之，以含蛇毒最高劑量動(dòng)物不死亡為中和終點(diǎn)，計(jì)算1毫升血清中和蛇毒數(shù)量。
成品檢定效價(jià)常用ED50，參照《免疫檢測(cè)技術(shù)》(第二版，徐宜為編著)文獻(xiàn)規(guī)定的方法測(cè)定。
一、制備免疫血漿按《中國(guó)生物制品規(guī)程》中《生物制品生產(chǎn)用馬匹檢疫及管理規(guī)程》的規(guī)定，選用健壯、無(wú)傳染病(包括馬傳染性貧血、馬鼻疽、布氏桿菌病、馬副傷寒性流產(chǎn)及其他傳染病)和無(wú)惡性腫瘤等疾病的馬匹制造馬抗蝰蛇毒血清，最好是4-12歲的馬匹，過幼者免疫器官發(fā)育不健全，過老者免疫機(jī)能忌退。
抗原及其制備抗原為園斑蝰蛇(Vipera russelli Siamensis Smith)蛇毒，選擇健康蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理15分鐘左右，按《除菌過濾崗位標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進(jìn)行除菌處理以除去雜質(zhì)，上清經(jīng)凍干成粉狀備用。使用前將蛇毒干粉用注射用水稀釋5~10倍，加入0.3～1.0％福爾馬林，處理3～10天減毒；得到的減毒蛇毒作為免疫抗原。
基礎(chǔ)免疫采用二針次免疫。
佐劑比例抗原∶羊毛脂∶液體石蠟3∶1∶2注射劑量及時(shí)間第1天1ml，第8天2ml超免疫采用五針次免疫抗原蝰蛇毒素。
注射劑量及時(shí)間第一程 第1針第1天 2-10ml第2針第8天 2-20ml第3針第15天 2-20ml第4針第22天 4-25ml第5針第29天 10-25ml7天后測(cè)定血液中抗體水平采血免疫成功馬匹可采血，按馬匹體重進(jìn)行采血，通常采二次血，間隔一天。采血后休息一星期，然后繼續(xù)免疫，采血、再免疫。達(dá)到預(yù)定效價(jià)即免疫成功，達(dá)不到者繼續(xù)免疫。
采血量每千克體重16-20ml。
休息7天后進(jìn)行下程免疫。
第二程第二程及以后各程采用二針次或三針次免疫二針次 第1針第1天10ml第2針第8天 20ml三針次 第1針第1天5ml第2針第8天 8ml第3針第15天10ml采血時(shí)間在末次注射后第8天起。
休息7天后進(jìn)行下程免疫。
二、精制提純用于精制的血漿應(yīng)符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》中附錄《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》的規(guī)定，不得有嚴(yán)重溶血或嚴(yán)重黃疸，投產(chǎn)前混合血漿的效力檢定應(yīng)合格。
對(duì)血漿的要求制造抗蝰蛇毒血清的血漿，應(yīng)符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》(2000年版)《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》的規(guī)定。
投產(chǎn)精制用的血漿應(yīng)無(wú)染菌、無(wú)溶血、無(wú)黃疸、應(yīng)不混入血球。
裝盛血漿的立瓶，應(yīng)無(wú)裂縫、無(wú)破損、包扎嚴(yán)緊。
血漿效價(jià)抗蝰蛇毒免疫馬血漿每瓶血漿效價(jià)要求在100U/ml，低于100U/ml不能使用。
血漿的準(zhǔn)備每批血漿投產(chǎn)量，按大罐容積，計(jì)算投入血漿量(按照規(guī)程2-4倍稀釋)。
在冷庫(kù)內(nèi)查對(duì)血漿種類、瓶號(hào)、馬號(hào)、分漿日期、裝量、效價(jià)，選好后，搬運(yùn)至緩沖間。
收集血漿瓶簽，去除瓶口外包裝，清潔血漿瓶外壁，作好血漿混合記錄。
制造程序消化將注射用水注入大罐內(nèi)，查對(duì)大罐所盛注射用水量，測(cè)量水溫(要求不高于48℃)。揭開血漿瓶塞，按照2-4倍稀釋量將血漿倒入大罐中，啟動(dòng)攪拌馬達(dá)，慢速攪拌均勻；取血漿稀釋液50ml，留樣送檢定，并測(cè)pH值，調(diào)溫至29-31℃，用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0-3.3之間，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速攪拌，消化1-1.5小時(shí)。
第一次沉淀及加熱處理取上述消化液20ml，測(cè)pH值。快速攪拌，加15％(W/V)硫酸銨。用2mol/L NaOH調(diào)至pH4.8-5.2，并測(cè)量消化液溫度，用流通蒸汽通過消化罐夾層加溫至58℃并保溫30分鐘；通過大罐夾層迅速降溫過濾分離，取清液，棄沉淀。
鹽析上述清液，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7.2-7.4，慢速攪拌，每100ml加硫酸銨20g。過濾分離，取沉淀，棄清液。
明礬沉淀將適量注射用水貯于大罐內(nèi)，備用。測(cè)量水溫不得高于30℃，將搗碎的沉淀稱量，置大罐內(nèi)稀釋至蛋白含量約2％(g/ml)，慢速攪拌，使沉淀完全溶解，并測(cè)量溫度不得高于30℃，加10％(g/ml)明礬溶液，最終含量為0.8-1.2％(g/ml)。取樣，測(cè)pH值，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.8，攪拌，吸附1小時(shí)，過濾分離，取清液，棄沉淀。
濃縮將上述清液混合通過超過濾裝置，用5萬(wàn)分子量的濾膜，進(jìn)行濃縮，至體積為十分之一時(shí)稀釋7倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下。
原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.9％(g/ml)；加入氯仿使最終含量為0.5％(ml/ml)；調(diào)pH至6.5。
澄清除菌過濾按《除菌過濾崗位標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進(jìn)行操作。制成的抗毒素原液，須在冷暗處保存至少1個(gè)月作為穩(wěn)定期。
原液檢定無(wú)菌試驗(yàn)按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》A項(xiàng)進(jìn)行。
熱原質(zhì)試驗(yàn)按《生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。
類A型物質(zhì)含量測(cè)定按《抗毒素制造及檢定規(guī)程》附錄6進(jìn)行。
半成品配制與除菌配制將檢定合格的原液，按出品規(guī)格以注射用水準(zhǔn)確稀釋，調(diào)整效價(jià)、蛋白質(zhì)濃度、pH值及氯化鈉含量。
除菌過濾按《除菌過濾崗位標(biāo)準(zhǔn)操作細(xì)則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進(jìn)行。
經(jīng)檢定，本發(fā)明方法制備的抗蝰蛇毒血清，符合《中國(guó)生物制品規(guī)程》(2000年版)對(duì)抗蛇毒血清的要求蛋白含量≤170g/L、pH 6.0-7.0、氯化鈉含量7.5-9.5g/L、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)2≥60％、中和效價(jià)≥500LD50/ml、類A型物質(zhì)≤4μg。
三、分包裝按《生物制品分裝規(guī)程》進(jìn)行，規(guī)格為5000U/瓶。本品有液體及凍干兩種類型，凍干制品分裝后應(yīng)立即在-30℃以下進(jìn)行冷凍，根據(jù)水含量調(diào)整干燥時(shí)間，干燥完畢后進(jìn)行真空封口。
四、效價(jià)測(cè)定1.試驗(yàn)動(dòng)物體重為18-20g的小白鼠。
2.抗蝰蛇毒血清血清參考標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所制備及提供。
3.待檢定血清樣品的稀釋稀釋液硼酸鹽緩沖液，滅菌后pH應(yīng)為7.1；將待檢抗蛇毒血清稀釋成數(shù)個(gè)稀釋度，使每ml抗蝰蛇毒血清約含5U或其上下；各稀釋度間隔7.5％。
具體的稀釋方法

4.抗蝰蛇毒血清參考標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋使每1ml含抗蝰蛇毒血清各5U，即與5個(gè)相應(yīng)蛇毒試驗(yàn)量混合后每0.4ml注射量中含1U或2U。
5.蛇毒稀釋蛇毒試驗(yàn)量指蛇毒稀釋后，與血清參考標(biāo)準(zhǔn)品混合，注射動(dòng)物后表現(xiàn)出的結(jié)果，為50％受保護(hù)。
使其5個(gè)試驗(yàn)量不超過0.8ml，在與抗蛇毒血清混合時(shí)補(bǔ)加稀釋液至2ml，即每0.4ml注射量中含1個(gè)試驗(yàn)量。
6.混合待檢組量取不同稀釋度之抗蛇毒血清各1ml，分別裝于小試管中，每管加入5個(gè)試驗(yàn)量與待檢抗蛇毒血清相應(yīng)的稀釋蛇毒液，補(bǔ)加稀釋液至2ml，混合均勻，封口。
對(duì)照組按下表量取已稀釋之標(biāo)準(zhǔn)抗蛇毒血清，分別裝入小試管中對(duì)照①②對(duì)照抗蝰蛇毒血清參考標(biāo)準(zhǔn)品(5U/ml) 1ml 1.2ml每管加入5個(gè)試驗(yàn)量之相應(yīng)稀釋蛇毒液，補(bǔ)加稀釋液至2ml，混合均勻，封口。
將以上兩組，置水浴箱中于37℃結(jié)合45分鐘后立即注射小鼠。
7.注射每個(gè)稀釋度的待檢抗蛇毒血清，對(duì)照①及對(duì)照②各注射小鼠4只，每只腹腔注射0.4ml。
8.觀察試驗(yàn)小鼠每日觀察一次，觀察48小時(shí)，并記錄發(fā)病及死亡情況。
9.結(jié)果判斷對(duì)照①小鼠死亡50％以上，對(duì)照②小鼠應(yīng)比對(duì)照①死亡晚或不死亡。
待檢血清之效價(jià)應(yīng)以與對(duì)照①小鼠同時(shí)死亡的最高稀釋度判定。
試驗(yàn)小鼠死亡情況發(fā)生倒置或?qū)φ詹怀闪?，?yīng)重試。
經(jīng)檢驗(yàn)，本產(chǎn)品效價(jià)為≥500U。
五、臨床試驗(yàn)本產(chǎn)品在廣州醫(yī)學(xué)院協(xié)作進(jìn)行了小量人體臨床療效考核，用于蝰蛇咬傷患者的治療。采用靜脈注射，也可做肌內(nèi)或皮下注射。
治療劑量注射量7500-U，1次注射，兒童與成人用量相同。以后視病情決定注射劑量與間隔時(shí)間。過敏試驗(yàn)為陽(yáng)性反應(yīng)者慎用。
使用中出現(xiàn)過敏反應(yīng)的處理
(1)過敏休克 可在注射中或注射后數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)突然發(fā)生者突然表現(xiàn)沉郁或煩躁、臉色蒼白或潮紅、胸悶或氣喘、出冷汗、惡心或腹痛、脈搏細(xì)速、血壓下降，重者神志昏迷或虛脫，如不及時(shí)搶救可以迅速死亡。輕者注射腎上腺素后即可緩解；重者需輸液輸氧，使用升壓藥物維持血壓，并使用抗過敏藥物及腎上皮質(zhì)激素等進(jìn)行搶救。
(2)血清病 主要癥狀為蕁麻疹、發(fā)熱淋巴結(jié)腫大、局部浮腫，偶有蛋白尿、嘔吐、關(guān)節(jié)痛，注射部位可出現(xiàn)紅斑、瘙癢及水腫。一般系在注射后7～14天發(fā)病，稱為延緩型。有在注射后2～4天發(fā)病，稱為加速型。對(duì)血清病應(yīng)進(jìn)行對(duì)癥療法，可使用鈣劑或抗組織胺藥物，一般數(shù)日至十?dāng)?shù)日即可痊愈。
使用本發(fā)明藥物的注意事項(xiàng)本品有液體及凍干兩種類型。制品混濁，有搖不散的沉淀、異物或安瓿有裂紋，標(biāo)簽不清，過期失效者均不可使用。安瓿打開后應(yīng)一次用完。凍干制品應(yīng)加標(biāo)簽規(guī)定量滅菌注射用水，輕搖使完全溶解。每次注射須保存詳細(xì)記錄，包括姓名、性別、年齡、住址、注射次數(shù)、上次注射后的反應(yīng)情況、本次過敏試驗(yàn)結(jié)果及注射后反應(yīng)情況、所用抗血清的生產(chǎn)單位名稱及批號(hào)等。使用抗血清須特別注意防止過敏反應(yīng)。注射前須詳細(xì)詢問既往過敏史，凡本人及其直系親屬曾有支氣管哮喘、枯草熱、濕疹或血管神經(jīng)性水腫等病史，或?qū)δ撤N物質(zhì)過敏，或本人過去曾注射過馬血清制劑者，均須特別提防過敏反應(yīng)的發(fā)生。注射前必須做過敏試驗(yàn)。
過敏試驗(yàn) 用氯化鈉注射液將抗血清稀釋20倍(0.1ml抗血清加1.9ml氯化鈉注射液)，在前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射0.1ml，觀察30分鐘。注射部位無(wú)明顯反應(yīng)者，即為陰性，可在嚴(yán)密觀察下直接注射抗血清。如注射局部出現(xiàn)皮丘增大、紅腫、浸潤(rùn)，特別是形似足或有癢感者，為陽(yáng)性反應(yīng)，必須用脫敏法進(jìn)行注射。如注射局部反應(yīng)特別嚴(yán)重或除局部反應(yīng)外并伴有全身癥狀，如蕁麻疹、鼻咽刺癢、噴嚏等，為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，則應(yīng)采用脫敏注射，并做好一切準(zhǔn)備，一旦發(fā)生過敏休克，立即搶救。無(wú)過敏史或過敏反應(yīng)陰性者，也并非沒有發(fā)生過敏休克的可能。為慎重起見，可先注射小量于皮下進(jìn)行試驗(yàn)，觀察30分鐘，無(wú)異常反應(yīng)，再將全量注射于皮下或肌內(nèi)。
脫敏注射法 在一般情況下，可用氯化鈉注射液將抗血清稀釋10倍，分小量數(shù)次作皮下注射，每次注射后觀察20～30分鐘。第1次可注射1ml，觀察無(wú)紫紺、氣喘或顯著呼吸短促、脈搏加速時(shí)，即可注射第2次2ml，如注射量達(dá)到4ml仍無(wú)反應(yīng)，可緩慢地將全量注入。門診病人注射抗血清后，須觀察至少30分鐘方可離開。
結(jié)果共治療67例蝰蛇咬傷中毒患者，有效率為98.5％，治愈率達(dá)91％，在用血清治療過程中沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，證實(shí)抗蝰蛇毒血清用于治療蝰蛇咬傷是一種副作用小，而且安全的特效藥。
權(quán)利要求
1.一種抗蝰蛇毒血清，以園斑蝰蛇蛇毒為抗原，免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制備，其蛋白含量≤170g/l、pH 6.0-7.0、氯化鈉含量7.5-9.5g/l、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)2≥60％、中和效價(jià)≥500LD50/ml、類A型物質(zhì)≤4μg。
2.一種抗蝰蛇毒血清的制備方法，包括如下步驟(1)制備免疫血漿以園斑蝰蛇毒作為免疫用抗原，選擇健康馬匹，進(jìn)行基礎(chǔ)免疫、超免疫待血漿抗體效價(jià)超過100U/ml后采血，分離血漿；(2)精制提純消化將制得的免疫血漿2-4倍稀釋，調(diào)溫至29-31℃，調(diào)節(jié)pH至3.0-3.3之間，加入溶化胃酶，消化1-1.5小時(shí)；第一次沉淀及加熱處理上述消化液加濃度為18~22％(g/ml)硫酸銨，調(diào)pH至4.8-5.2，加溫至56~60℃，保溫20~40分鐘，降溫過濾分離，取清液，棄沉淀；鹽析上述清液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4之間，每100ml加硫酸銨15~25g，取沉淀，棄清液；明礬沉淀上述沉淀稀釋至蛋白含量為1~3％(g/ml)，使沉淀溶解，在溫度為10~30℃下加入明礬溶液使最終含量為0.8-1.2％(g/ml)，調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，吸附05~1.5小時(shí)，過濾分離，取清液，棄沉淀；濃縮將上述清液用4.5~5.5萬(wàn)分子量的濾膜超濾濃縮至原體積的5~15％時(shí)稀釋5-8倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下；原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入氯仿使最終含量為1.4~0.6％(ml/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0，得抗蝰蛇毒血清原液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以園斑蝰蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理10~20分鐘，取上清凍干，用福爾馬林處理減毒，獲得免疫用抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療蝰蛇咬傷的生物藥品及其制備方法，它是由園斑蝰蛇蛇毒免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑，具有特異性中和蝰蛇毒素的作用；本發(fā)明的抗蝰蛇毒血清效價(jià)高，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD
文檔編號(hào)A61K39/395GK1947727SQ20051003039
公開日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者蔣克賢, 范志和, 季沖, 李景玉, 張志平 申請(qǐng)人:上海賽倫生物技術(shù)有限公司