專利名稱：pp3774基因在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤相關(guān)新基因，尤其涉及pp3774基因的功能應(yīng)用。pp3774基因可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、并與已知基因JAB1結(jié)合，因而pp3774基因具有作為藥物篩選靶點(diǎn)用于篩選藥物(促進(jìn)或抑制pp3774和JAB1結(jié)合的物質(zhì))等潛在用途。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)劃的完成和科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，以對(duì)基因(尤其是致病基因)功能研究為主要內(nèi)容的“后基因組時(shí)代”已經(jīng)來(lái)臨。盡管國(guó)內(nèi)外相繼克隆了與各種功能相關(guān)的基因、并對(duì)其初步生物學(xué)功能和作用機(jī)制進(jìn)行了研究，本發(fā)明人進(jìn)行的以細(xì)胞生長(zhǎng)為基礎(chǔ)的大規(guī)模功能篩選發(fā)現(xiàn)并克隆了372個(gè)新基因[Wan等，PNAS(2004)101(44)15724-15729]。
pp3774基因就是利用此功能篩選技術(shù)平臺(tái)從人胎盤cDNA文庫(kù)中克隆到的新基因，該基因全長(zhǎng)約1747bp，定位于染色體10q24，含10個(gè)外顯子，編碼361個(gè)氨基酸。該基因的cDNA序列本室已于2000年4月18日在GeneBank登錄(登錄號(hào)為AF258563)。
pp3774基因與Li等從小鼠肝cDNA文庫(kù)克隆到的并于1999年8月10日在GeneBank登錄(登錄號(hào)為AF176814)Aph2基因[Li等，J Biol Chem 277(2002)28870-28876]具有96％的同源性，Aph2基因全長(zhǎng)約1817bp。
目前，雖然有眾多基因序列是已知的，然而人們并不知道或了解其功能。pp3774基因就是功能未知的基因之一。
基于許多生理反應(yīng)和疾病與基因或蛋白的功能有關(guān)，因此，為了全面了解各種基因，本領(lǐng)域迫切需要確定各種功能未知基因的確切功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供了一種功能未知基因pp3774基因的確切功能。本發(fā)明的研究表明，pp3774基因可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、影響細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡并與pp3774-JAB1的相互作用。
本發(fā)明的另一目的是基于上述功能，提供pp3774基因的應(yīng)用。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種篩選pp3774促進(jìn)劑的方法，它包括步驟(a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待選的候選物和pp3774，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中細(xì)胞的增殖情況與對(duì)照組中細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，其中，所述的對(duì)照組包括(i)組未添加待選的候選物，也未添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；(ii)組添加待選的候選物但不添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；和(iii)組未添加待選的候選物但添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；其中，如果測(cè)試組中的細(xì)胞的增殖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組(iii)并且對(duì)照組(i)和對(duì)照組(ii)的細(xì)胞增殖情況無(wú)顯著差異，那么就表明該候選物是pp3774促進(jìn)劑。
其中所述的pp3774基因的序列如SEQ ID NO1所示。
在一優(yōu)選例中，所述的細(xì)胞是癌細(xì)胞，更優(yōu)選的是肝癌細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選pp3774和JAB1結(jié)合的促進(jìn)劑的方法，它包括步驟(a)在測(cè)試組中，向使pp3774和JAB1結(jié)合的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)pp3774和JAB1的結(jié)合情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況與未添加候選物的對(duì)照組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選明顯高于)對(duì)照組，就表明該候選物是促進(jìn)pp3774和JAB1結(jié)合的化合物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種篩選pp3774和JAB1結(jié)合的抑制劑的方法，它包括步驟(a)在測(cè)試組中，向使pp3774和JAB1結(jié)合的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)pp3774和JAB1的結(jié)合情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況與未添加候選物的對(duì)照組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制pp3774和JAB1結(jié)合的化合物。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種pp3774基因或蛋白的用途，包括用于(a)制備抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的組合物；或(b)制備調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡的組合物。
在一優(yōu)選例中所述的組合物是藥物組合物，其中所述的組合物含有0.001-99.9wt％pp3774蛋白，按組合物的總重量計(jì)。
在另一優(yōu)選例中所述的組合物還含有pp3774蛋白的促進(jìn)劑。
本發(fā)明提供了pp3774基因明確的功能可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、并與已知基因JAB1結(jié)合，并且將pp3774基因作為靶點(diǎn)用于篩選藥物(促進(jìn)或抑制pp3774和JAB1結(jié)合的物質(zhì))等，提供了它豐富的使用前景。


圖1顯示了pp3774-GFP融合蛋白在細(xì)胞中的定位。
圖2顯示了pp3774 mRNA在各種腫瘤細(xì)胞系中的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果。
圖3顯示了人肝癌及癌旁組織的免疫組化檢測(cè)結(jié)果。
圖4顯示了SMMC-7721和COS-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡分析結(jié)果。
圖5顯示了pp3774基因和JAB1缺失突變體的構(gòu)建及體外蛋白結(jié)合試驗(yàn)(Pull down)的結(jié)果。
圖6顯示了pp3774基因缺失子pp3774-Δ4和JAB1蛋白及體內(nèi)免疫共沉淀試驗(yàn)的結(jié)果。圖中，vector是空載體。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，pp3774基因可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、并與已知基因JAB1結(jié)合，因而pp3774基因具有作為藥物篩選靶點(diǎn)用于篩選藥物(促進(jìn)或抑制pp3774和JAB1結(jié)合的物質(zhì))等潛在用途。在此基礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
具體地，本發(fā)明的試驗(yàn)表明，pp3774蛋白主要定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該基因與小鼠Aph2基因在氨基酸水平具有96％的同源性；本發(fā)明人以前的研究結(jié)果也顯示該基因在正常人組織中均有不同程度的表達(dá)，具體表現(xiàn)為骨骼肌和心肌最高，胎盤、胰腺和肝其次，腎和腦中等，而在肺組織中呈現(xiàn)低表達(dá)，預(yù)示該蛋白是一個(gè)進(jìn)化上保守的基因。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“pp3774蛋白”、“pp3774多肽”或“腫瘤相關(guān)蛋白pp3774”可互換使用，都指具有人pp3774氨基酸序列(SEQ ID NO2或AAG23766(gi10834672)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的pp3774多肽。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“pp3774基因”、“pp3774多核苷酸”或“腫瘤相關(guān)基因pp3774”可互換使用，都指具有人pp3774核苷酸序列(SEQ ID NO1或AF258563(gi10834671)的核酸序列。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的pp3774蛋白或多肽”是指pp3774多肽基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)純化pp3774蛋白?；旧霞兊亩嚯脑诜沁€原聚丙烯酰胺凝膠上能產(chǎn)生單一的主帶。pp3774多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括人pp3774蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然人pp3774蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人pp3774多肽”指具有人pp3774蛋白活性的SEQ ID NO2序列[AAG23766(gi10834672)]的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人pp3774蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列[AAG23766(gi10834672)]的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個(gè)或多個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括人pp3774蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人pp3774 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人pp3774多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人pp3774多肽或其片段的融合蛋白(如SEQ ID NO3所示的融合蛋白)。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了人pp3774多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人pp3774多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
本發(fā)明還提供人pp3774蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人pp3774多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人pp3774蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID N02[AAG23766(gi10834672)]的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1

本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID N01所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。
編碼SEQ ID NO2[AAG23766(gi10834672)]的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術(shù)語(yǔ)“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”，的長(zhǎng)度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼pp3774蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明的人pp3774核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通過(guò)先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
目前，已經(jīng)可以完全通過(guò)化學(xué)合成來(lái)得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al. Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的基因。用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎贸Ｒ?guī)方法如通過(guò)凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或pp3774蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的pp3774多肽。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼人pp3774多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；(3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
本發(fā)明中，人pp3774多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含人pp3774編碼DNA序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Clo1ing，a LaboratoryManual，cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
重組的人pp3774蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)用于篩選促進(jìn)pp3774蛋白功能的促進(jìn)劑、配體或其他小分子化合物。例如，用表達(dá)的重組人pp3774蛋白篩選多肽庫(kù)可用于尋找有治療價(jià)值的能刺激人pp3774蛋白功能的多肽分子。
在一個(gè)優(yōu)選例中，提供了一種篩選pp3774蛋白促進(jìn)劑的方法，它包括步驟
(a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待選的候選物和pp3774，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中細(xì)胞的增殖情況與對(duì)照組中細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，其中，所述的對(duì)照組包括(i)組未添加待選的候選物，也未添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；(ii)組添加待選的候選物但不添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；(iii)未添加待選的候選物但添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；其中，如果測(cè)試組中的細(xì)胞的增殖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組(iii)并且對(duì)照組(i)和對(duì)照組(ii)的細(xì)胞增殖情況無(wú)顯著差異，那么就表明該候選物是pp3774促進(jìn)劑。
另一方面，本發(fā)明還包括對(duì)人pp3774 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人pp3774基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人pp3774基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識(shí)別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人pp3774蛋白的分子，也包括那些并不影響人pp3774蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人pp3774基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國(guó)專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來(lái)自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人pp3774基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動(dòng)物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人pp3774蛋白或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來(lái)免疫動(dòng)物來(lái)生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來(lái)制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人pp3774蛋白功能的抗體以及不影響人pp3774蛋白功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人pp3774基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過(guò)常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人pp3774基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而獲得。
抗人pp3774蛋白的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測(cè)活檢標(biāo)本中的人pp3774蛋白。
本發(fā)明中的抗體可用于治療或預(yù)防與人pp3774蛋白相關(guān)的疾病。給予適當(dāng)劑量的抗體可以刺激或阻斷人pp3774蛋白的產(chǎn)生或活性。
抗體也可用于設(shè)計(jì)成針對(duì)體內(nèi)某一特殊部位的免疫毒素。如人pp3774蛋白高親和性的單克隆抗體可與細(xì)菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價(jià)結(jié)合。一種通常的方法是用巰基交聯(lián)劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過(guò)二硫鍵的交換，將毒素結(jié)合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅人pp3774蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞。
多克隆抗體的生產(chǎn)可用人pp3774蛋白或多肽免疫動(dòng)物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發(fā)明蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與pp3774蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如受體、激動(dòng)劑或促進(jìn)劑等。
本發(fā)明蛋白及其抗體、激動(dòng)劑或促進(jìn)劑等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供所需的效果(如抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng))。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明pp3774多肽或其激動(dòng)劑或促進(jìn)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。
此外，本發(fā)明的pp3374多肽還可與其他治療劑(如順鉑，5-FU等)一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的pp3774蛋白或其激動(dòng)劑或促進(jìn)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
能與人pp3774蛋白結(jié)合的多肽分子可通過(guò)篩選由各種可能組合的氨基酸結(jié)合于固相物組成的隨機(jī)多肽庫(kù)而獲得。篩選時(shí)，必須對(duì)人pp3774蛋白分子進(jìn)行標(biāo)記。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測(cè)人pp3774蛋白水平的診斷試驗(yàn)方法。這些試驗(yàn)是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測(cè)定和放射免疫測(cè)定。試驗(yàn)中所檢測(cè)的人pp3774蛋白水平，可以用作解釋人pp3774蛋白在各種疾病中的重要性和用于診斷pp3774蛋白起作用的疾病。
一種檢測(cè)檢測(cè)樣品中是否存在pp3774蛋白的方法是利用pp3774蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，它包括將樣品與pp3774蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在pp3774蛋白。
pp3774蛋白的多聚核苷酸可用于pp3774蛋白相關(guān)疾病的診斷和治療。在診斷方面，pp3774蛋白的多聚核苷酸可用于檢測(cè)pp3774蛋白的表達(dá)與否或在疾病狀態(tài)下pp3774蛋白的異常表達(dá)。如pp3774 DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷pp3774蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因診斷。用pp3774蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)pp3774蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
檢測(cè)pp3774基因的突變也可用于診斷pp3774蛋白相關(guān)的疾病。pp3774蛋白突變的形式包括與正常野生型pp3774 DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于pp3774基因具有明確的功能可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、并與已知基因JAB1結(jié)合，因而pp3774基因具有作為靶點(diǎn)用于篩選藥物(促進(jìn)或抑制pp3774和JAB1結(jié)合的物質(zhì))等潛在用途。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1pp3774蛋白細(xì)胞定位利用含有限制性酶切位點(diǎn)的特異性引物，用PCR的方法擴(kuò)增pp3774基因的編碼區(qū)，以EcoRI/BamHI酶切位點(diǎn)裝入真核表達(dá)載體EGFP-N1(購(gòu)自Clontech公司)，使其能夠表達(dá)C末端帶有GFP標(biāo)簽的pp3774融合蛋白，經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤，即構(gòu)建成pp3774-EGFP-N1融合表達(dá)載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，熒光觀察PP3774-GFP融合蛋白的細(xì)胞定位。
亞細(xì)胞定位是利用pp3774基因轉(zhuǎn)染COS-7活細(xì)胞加入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光示蹤劑ER-Tracker Blue-White DPX孵育后在熒光顯微鏡和ISIS圖像分析系統(tǒng)完成的。
結(jié)果顯示空載體標(biāo)簽蛋白GFP在細(xì)胞核、質(zhì)均勻分布，而pp3774-EGFP-N1融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，熒光觀察發(fā)現(xiàn)PP3774-GFP融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1a、b)，進(jìn)一步用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)特異性熒光示蹤劑ER-TrackerBlue-White DPX共定位顯示PP3774蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(圖1c-e)。
實(shí)施例2半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Semi-Q RT-PCR)a)用Trizol試劑抽提生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，BEL-7402，MHCC-LM3，MHCC-97L，Huh-7，Hep3B，HepG2和人永生化肝細(xì)胞L-02，其他腫瘤細(xì)胞系如膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD，黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375，宮頸癌細(xì)胞HeLa，白血病細(xì)胞系K562，HL60以及人肝癌組織、癌旁組織總RNA，紫外分光光度計(jì)法定量及檢測(cè)純度，并取少量總RNA進(jìn)行變性膠電泳，檢查RNA是否降解；
b)將經(jīng)DNase I處理過(guò)的細(xì)胞總RNA 9μl(5μg)與Oligo dT 1μl混合，72℃加熱5min后，立刻置于冰上10min；c)加入8μl反轉(zhuǎn)錄混合液(10×RT Buffer 2μl，25mM MgCl22μl，10mMdNTP混合物1μl，0.1mM DTT 2μl，RNase抑制劑1μl)；d)在PCR儀上42℃加熱5min后，加入1μl(50U)SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃反應(yīng)50min；e)70℃加熱15min，終止反應(yīng)，置冰??；f)加入1μl RNase H，37℃ 20min，PCR混合物取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物各1μl，10mM dNTP 0.5μl，25mM MgCl22μl，5U/μl Taq聚合酶0.1μl，10×反應(yīng)緩沖液2.5μl，10pmol引物RTF，RTR，反應(yīng)體積為25μl，反應(yīng)條件為94℃ 5min；94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s，25個(gè)循環(huán)；72℃ 10min終止反應(yīng)；g)PCR擴(kuò)增看家基因β-actin作為檢驗(yàn)反轉(zhuǎn)錄是否成功的標(biāo)準(zhǔn)；h分別取5μl PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定其每條擴(kuò)增帶的光密度值，將每一種目的DNA擴(kuò)增片段光密度與內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增片段光密度的比值(e/c)作為其mRNA表達(dá)水平的半定量指標(biāo)，并作統(tǒng)計(jì)分析。
引物序列為pp3774 RTF5′-CTGGCTGGTAGACAACGTGA-3′(20bp)(SEQ ID NO3)pp3774 RTR5′-GAAAGGAGAAGGTGGGTGGT-3′(20bp)(SEQ ID NO4)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物大小為521bp；β-肌動(dòng)蛋白上游5′GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′(20bp)(SEQ IDNO5)β-肌動(dòng)蛋白下游5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′(20bp)(SEQ ID NO6)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增產(chǎn)物大小為234bp。
結(jié)果表明，pp3774 mRNA在7個(gè)肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)為BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L及HepG2中高表達(dá)，SMMC-7721、MHCC-LM3及永生化人肝細(xì)胞系L-02中度表達(dá)，而在Hep3B中低表達(dá)(圖2)；而在18對(duì)肝癌和癌旁組織中的表達(dá)表現(xiàn)為13例癌旁高于癌，1例癌與癌旁基本相同，4例癌高于癌旁，配對(duì)t-test分析結(jié)果顯示總體為癌旁高于癌(P＜0.05)。
實(shí)施例3免疫細(xì)胞化學(xué)和肝癌組織芯片免疫組化檢測(cè)a)所有用于免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的單層細(xì)胞培養(yǎng)片和用于免疫組化檢測(cè)的組織標(biāo)本用10％中性緩沖福爾馬林固定；b)組織標(biāo)本采用石蠟包埋，5μm厚連續(xù)切片，HE染色進(jìn)行普通病理組織學(xué)觀察，肝癌組織的病理學(xué)分級(jí)和制備肝癌組織芯片前的定位，含有214對(duì)人肝癌及癌旁組織、18例肝硬化組織、10例正常肝組織的組織芯片制備方法完全按照本實(shí)驗(yàn)室業(yè)已建立的技術(shù)平臺(tái)；c)用兔抗pp3774多克隆抗血清分離IgG作為第一抗體，應(yīng)用EnvisionSystem-HRP(rabbit)，DAB顯色，Mayer氏蘇木素復(fù)染核，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組化檢測(cè)該基因在7株肝癌細(xì)胞系即SMMC-7721，BEL-7402，MHCC-LM3，MHCC-97L，Huh-7，Hep3B，HepG2，膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD，黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375，宮頸癌細(xì)胞HeLa，白血病細(xì)胞系K562，HL60和人正常肝組織、肝硬化、癌旁肝和肝癌組織中的表達(dá)差異。
結(jié)果顯示7株肝癌細(xì)胞系中野生型pp3774蛋白表達(dá)均很低。在10例正常肝組織和18例肝硬化組織中pp3774蛋白均為高表達(dá)。在214例肝癌-癌旁標(biāo)本中194例癌旁組織高于癌組織，占90.65％(194/214)；8例癌旁組織與肝癌組織表達(dá)無(wú)明顯差異，占3.74％(8/214)；12例則呈現(xiàn)癌高于癌旁組織，占5.61％(12/214)；總體上表現(xiàn)為正常肝、硬化肝和癌旁肝組織陽(yáng)性反應(yīng)明顯高于肝癌組織(圖3a-p)。肝癌旁組織陽(yáng)性細(xì)胞主要有肝細(xì)胞，膽管上皮細(xì)胞，部分血管內(nèi)皮也呈陽(yáng)性反應(yīng)；肝癌組織中呈陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞主要是肝癌細(xì)胞。該基因編碼的蛋白pp3774蛋白在肝癌和癌旁組織中的表達(dá)呈現(xiàn)癌旁組織明顯高于肝癌組織，這與抑癌候選基因的特點(diǎn)是相符的。
實(shí)施例4pp3774基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡檢測(cè)pp3774-HA融合基因和空載體pcDNA-HA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行的凋亡分析。
結(jié)果表明，盡管一般來(lái)說(shuō)pp3774-HA融合基因的轉(zhuǎn)染率略低于空載體pcDNA-HA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但pp3774基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率高于空載體組10％左右(10.5％)(圖4)，預(yù)示pp3774基因抑制細(xì)胞生長(zhǎng)其誘發(fā)凋亡是原因之一。
實(shí)施例5pp3774與JAB1體內(nèi)外的相互作用本發(fā)明人用酵母雙雜交的方法以pp3774為誘餌蛋白從人的胎盤文庫(kù)和胎腦cDNA文庫(kù)中尋找可以與PP3774相互作用的蛋白，得到6個(gè)陽(yáng)性克隆，經(jīng)測(cè)序后發(fā)現(xiàn)6個(gè)陽(yáng)性克隆均編碼同一蛋白JAB1。JAB1全長(zhǎng)1510bp，編碼334個(gè)氨基酸。
為了確定pp3774與JAB1相互作用的關(guān)鍵性區(qū)域，分別構(gòu)建了pp3774和JAB1的不同缺失子，利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)pp3774和JAB1的不同缺失子之間的相互作用。發(fā)現(xiàn)pp3774的zf-DHHC功能域是pp3774與JAB1相互作用的關(guān)鍵性區(qū)域，而JAB1的羧基端對(duì)于JAB1與pp3774的相互作用是不可豁缺的(圖5A)。
為了證實(shí)pp3774與JAB1的相互作用，還進(jìn)行了體外pull-down實(shí)驗(yàn)。
pp3774和JAB1的相互作用將不同PP3774缺失子以及PP3774全長(zhǎng)基因克隆入pGBKT7載體，并和pACT2-JAB1共轉(zhuǎn)染入Y187細(xì)胞，此外將不同的JAB1缺失子克隆入pACT2載體，并和pGBKT7-3774共轉(zhuǎn)染Y187細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因His3和LacZ的表達(dá)確定兩者之間的相互作用。
圖5B顯示含有zf-DHHC功能域的不同pp3774缺失子以及pp3774全長(zhǎng)基因均可以在體外誘導(dǎo)表達(dá)，JAB1能夠被上述pp3774缺失子以及pp3774全長(zhǎng)pull-down，從而在體外證實(shí)了pp3774與JAB1之間的相互作用(圖5C)。
圖5的結(jié)果顯示pp3774中與JAB1相互作用的關(guān)鍵性區(qū)域存在于100-150位氨基酸，這一區(qū)域正是zf-DHHC功能域所在區(qū)。而JAB1的羧基端284-334位氨基酸對(duì)于JAB1與pp3774的相互作用是不可缺少的。
為了在體內(nèi)證實(shí)pp3774與JAB1的相互作用，進(jìn)行了體內(nèi)pp3774與JAB1的共沉淀。用帶有GFP標(biāo)簽的pp3774質(zhì)粒和JAB1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后36小時(shí)裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，分別用抗GFP和抗JAB1抗體沉淀后，用western-blot檢測(cè)。
圖6的結(jié)果顯示pp3774和pp3774-Δ4可以分別被JAB1共沉淀，而JAB1也可以被pp3774和pp3774-Δ4共沉淀。為了檢測(cè)沉淀的特異性，還檢測(cè)了GFP蛋白與JAB1之間是否存在相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP不能被JAB1共沉淀，從而說(shuō)明了pp3774與JAB1相互作用的特異性。
實(shí)施例6篩選pp3774促進(jìn)劑在測(cè)試組中，向SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待選的候選物和pp3774，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；同時(shí)，設(shè)立以下3個(gè)對(duì)照組包括(a)未添加待選的候選物，也未添加pp3774的SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)物；(b)添加待選的候選物但不添加pp3774的SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)物；(c)未添加待選的候選物但添加pp3774的SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)物；將測(cè)試組中細(xì)胞的增殖情況與對(duì)照組中細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，同時(shí)比較各對(duì)照組之間的細(xì)胞的增殖情況。
結(jié)果(a)為細(xì)胞正常生長(zhǎng)的空白對(duì)照；(b)顯示待選的候選物對(duì)細(xì)胞的單獨(dú)促進(jìn)或抑制作用；(c)為pp3774蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的單獨(dú)抑制作用；對(duì)照組(b)細(xì)胞增殖如果高于(a)，則添加待選的候選物為細(xì)胞生長(zhǎng)促進(jìn)劑，如果低于(a)則為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑；步驟(1)測(cè)試組中細(xì)胞如果增殖比對(duì)照組(c)高，表明待選的候選物為pp3774蛋白的拮抗劑；如果步驟(1)測(cè)試組中細(xì)胞增殖比對(duì)照組(c)低，表明待選的候選物為pp3774蛋白的協(xié)同促進(jìn)劑。
篩選了數(shù)種候選物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)一種候選物可促進(jìn)pp3774蛋白對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市腫瘤研究所<120>pp3774基因在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)中的應(yīng)用<130>058127<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1747<212>DNA<213>智人(homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(158)..(1243)<223>
<400>1ccgggtccgc tgcctggcgc tgcgggcggc gggccatggt ggtttggatt gagccgggcc 60cggccggggc gccgagtcgg agggggtggc agtgagcggc ggcagaggct acggggctcg120gtttggctga ctggggagtc ggcaggcggc aggaacc atg cga ggc cag cgg agc 175Met Arg Gly Gln Arg Ser1 5ctg ctg ctg ggc ccg gcc cgc ctc tgc ctc cgc ctc ctt ctg ctg ctg 223Leu Leu Leu Gly Pro Ala Arg Leu Cys Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu10 15 20ggt tac agg cgc cgc tgt cca cct cta ctc cgg ggt cta gta cag cgc 271Gly Tyr Arg Arg Arg Cys Pro Pro Leu Leu Arg Gly Leu Val Gln Arg25 30 35tgg cgc tac ggc aag gtc tgc ctg cgc tcc ctg ctc tac aac tcc ttt 319Trp Arg Tyr Gly Lys Val Cys Leu Arg Ser Leu Leu Tyr Asn Ser Phe40 45 50ggg ggc agt gac acc gct gtt gat gct gcc ttt gag cct gtc tac tgg 367Gly Gly Ser Asp Thr Ala Val Asp Ala Ala Phe Glu Pro Val Tyr Trp55 60 65 70ctg gta gac aac gtg atc cgc tgg ttt gga gtg gtg ttc gtg gtc ctg 415Leu Val Asp Asn Val Ile Arg Trp Phe Gly Val Val Phe Val Val Leu75 80 85gtg atc gtg ctg aca ggc tcc att gta gct atc gcc tac ctg tgt gtc 463Val Ile Val Leu Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Ala Tyr Leu Cys Val90 95 100ctg cct ctc atc ctc cga acc tac tca gtg cca cga ctc tgc tgg cat 511Leu Pro Leu Ile Leu Arg Thr Tyr Ser Val Pro Arg Leu Cys Trp His105 110 115
ttc ttc tat agc cac tgg aat ctg atc ctg att gtc ttc cac tac tac 559Phe Phe Tyr Ser His Trp Asn Leu Ile Leu Ile Val Phe His Tyr Tyr120 125 130cag gcc atc acc act ccg cct ggg tac cca ccc cag ggc agg aat gat 607Gln Ala Ile Thr Thr Pro Pro Gly Tyr Pro Pro Gln Gly Arg Asn Asp135 140 145 150atc gcc acc gtc tcc atc tgt aag aag tgc att tac ccc aag cca gcc 655Ile Ala Thr Val Ser Ile Cys Lys Lys Cys Ile Tyr Pro Lys Pro Ala155 160 165cga aca cac cac tgc agc atc tgc aac agg tgt gtg ctg aag atg gat 703Arg Thr His His Cys Ser Ile Cys Asn Arg Cys Val Leu Lys Met Asp170 175 180cac cac tgc ccc tgg cta aac aat tgt gtg ggc cac tat aac cat cgg 751His His Cys Pro Trp Leu Asn Asn Cys Val Gly His Tyr Asn His Arg185 190 195tacttc ttc tct ttc tgc ttt ttc atg act ctg ggc tgt gtc tac tgc 799Tyr Phe Phe Ser Phe Cys Phe Phe Met Thr Leu Gly Cys Val Tyr Cys200 205 210agc tat gga agt tgg gac ctt ttc cgg gag gct tat gct gcc att gag 847Ser Tyr Gly Ser Trp Asp Leu Phe Arg Glu Ala Tyr Ala Ala Ile Glu215 220 225 230act tat cac cag acc cca cca ccc acc ttc tcc ttt cga gaa agg atg 895Thr Tyr His Gln Thr Pro Pro Pro Thr Phe Ser Phe Arg Glu Arg Met235 240 245act cac aag agt ctt gtc tac ctc tgg ttc ctg tgc agt tct gtg gca 943Thr His Lys Ser Leu Val Tyr Leu Trp Phe Leu Cys Ser Ser Val Ala250 255 260ctt gcc ctg ggt gcc cta act gta tgg cat gct gtt ctc atc agt cga 991Leu Ala Leu Gly Ala Leu Thr Val Trp His Ala Val Leu Ile Ser Arg265 270 275ggt gag act agc atc gaa agg cac atc aac aag aag gag aga cgt cgg1039Gly Glu Thr Ser lle Glu Arg His Ile Asn Lys Lys Glu Arg Arg Arg280 285 290cta cag gcc aag ggc aga gta ttt agg aat cct tac aac tac ggc tgc1087Leu Gln Ala Lys Gly Arg Val Phe Arg Asn Pro Tyr Asn Tyr Gly Cys295 300 305 310ttg gac aac tgg aag gta ttc ctg ggt gtg gat aca gga agg cac tgg1135Leu Asp Asn Trp Lys Val Phe Leu Gly Val Asp Thr Gly Arg His Trp315 320 325ctt act cgg gtg ctc tta cct tct agt cac ttg ccc cat ggg aat gga1183Leu Thr Arg Val Leu Leu Pro Ser Ser His Leu Pro His Gly Asn Gly330 335 340atg agc tgg gag ccc cct ccc tgg gtg act gct cac tca gcc tct gtg1231Met Ser Trp Glu Pro Pro Pro Trp Val Thr Ala His Ser Ala Ser Val345 350 355atg gca gtg tga gctggactgt gtcagccacg actcgagcac tcattctgct1283Met Ala Val360ccctatgtta tttcaagggc ctccaagggc agcttttctc agaatccttg atcaaaaaga 1343gccagtgggc ctgccttagg gtaccatgca ggacaattca aggaccagcc tttttaccac 1403
tgcagaagaa agacacaatg tggagaaatc ttaggactga catcccttta ctcaggcaaa 1463cagaagttcc aaccccagac taggggtcag gcagctagct acctaccttg cccagtgctg 1523acccggacct cctccaggat acagcactgg agttggccac cacctcttct acttgctgtc 1583tgaaaaaaca cctgactagt acagctgaga tcttggcttc tcaacagggc aaagatacca 1643ggcctgctgc tgaggtcact gccacttctc acatgctgct taagggagca caaataaagg 1703tattcgattt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa1747<210>2<211>361<212>PRT<213>智人(homo sapiens)<400>2Met Arg Gly Gln Arg Ser Leu Leu Leu Gly Pro Ala Arg Leu Cys Leu1 5 10 15Arg Leu Leu Leu Leu Leu Gly Tyr Arg Arg Arg Cys Pro Pro Leu Leu20 25 30Arg Gly Leu Val Gln Arg Trp Arg Tyr Gly Lys Val Cys Leu Arg Ser35 40 45Leu Leu Tyr Asn Ser Phe Gly Gly Ser Asp Thr Ala Val Asp Ala Ala50 55 60Phe Glu Pro Val Tyr Trp Leu Val Asp Asn Val Ile Arg Trp Phe Gly65 70 75 80Val Val Phe Val Val Leu Val Ile Val Leu Thr Gly Ser Ile Val Ala85 90 95Ile Ala Tyr Leu Cys Val Leu Pro Leu Ile Leu Arg Thr Tyr Ser Val100 105 110Pro Arg Leu Cys Trp His Phe Phe Tyr Ser His Trp Asn Leu Ile Leu115 120 125Ile Val Phe His Tyr Tyr Gln Ala Ile Thr Thr Pro Pro Gly Tyr Pro130 135 140Pro Gln Gly Arg Asn Asp Ile Ala Thr Val Ser Ile Cys Lys Lys Cys145 150 155 160Ile Tyr Pro Lys Pro Ala Arg Thr His His Cys Ser Ile Cys Asn Arg165 170 175Cys Val Leu Lys Met Asp His His Cys Pro Trp Leu Asn Asn Cys Val180 185 190Gly His Tyr Asn His Arg Tyr Phe Phe Ser Phe Cys Phe Phe Met Thr195 200 205Leu Gly Cys Val Tyr Cys Ser Tyr Gly Ser Trp Asp Leu Phe Arg Glu210 215 220Ala Tyr Ala Ala Ile Glu Thr Tyr His Gln Thr Pro Pro Pro Thr Phe225 230 235 240Ser Phe Arg Glu Arg Met Thr His Lys Ser Leu Val Tyr Leu Trp Phe245 250 255Leu Cys Ser Ser Val Ala Leu Ala Leu Gly Ala Leu Thr Val Trp His260 265 270Ala Val Leu Ile Ser Arg Gly Glu Thr Ser Ile Glu Arg His Ile Asn275 280 285
Lys Lys Glu Arg Arg Arg Leu Gln Ala Lys Gly Arg Val Phe Arg Asn290 295 300Pro Tyr Asn Tyr Gly Cys Leu Asp Asn Trp Lys Val Phe Leu Gly Val305 310 315 320Asp Thr Gly Arg His Trp Leu Thr Arg Val Leu Leu Pro Ser Ser His325 330 335Leu Pro His Gly Asn Gly Met Ser Trp Glu Pro Pro Pro Trp Val Thr340 345 350Ala His Ser Ala Ser Val Met Ala Val355 360<210>3<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3ctggctggta gacaacgtga20<210>4<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4gaaaggagaa ggtgggtggt20<210>5<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>5ggacttcgag caagagatgg20<210>6<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6agcactgtgt tggcgtacag20
權(quán)利要求
1.一種篩選pp3774促進(jìn)劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加待選的候選物和pp3774，并檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中細(xì)胞的增殖情況與對(duì)照組中細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行比較，其中，所述的對(duì)照組包括(i)組未添加待選的候選物，也未添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；(ii)組添加待選的候選物但不添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；和(iii)組未添加待選的候選物但添加pp3774的細(xì)胞培養(yǎng)物；其中，如果測(cè)試組中的細(xì)胞的增殖在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組(iii)并且對(duì)照組(i)和對(duì)照組(ii)的細(xì)胞增殖情況無(wú)顯著差異，那么就表明該候選物是pp3774促進(jìn)劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的pp3774基因的序列如SEQID NO1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是癌細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞是肝癌細(xì)胞。
5.一種篩選pp3774和JAB1結(jié)合的促進(jìn)劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向使pp3774和JAB1結(jié)合的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)pp3774和JAB1的結(jié)合情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況與未添加候選物的對(duì)照組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(優(yōu)選明顯高于)對(duì)照組，就表明該候選物是促進(jìn)pp3774和JAB1結(jié)合的化合物。
6.一種篩選pp3774和JAB1結(jié)合的抑制劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)在測(cè)試組中，向使pp3774和JAB1結(jié)合的培養(yǎng)物中添加待篩選的候選物，并檢測(cè)pp3774和JAB1的結(jié)合情況；(b)將步驟(a)測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況與未添加候選物的對(duì)照組中pp3774和JAB1的結(jié)合情況進(jìn)行比較，如果測(cè)試組中pp3774和JAB1的結(jié)合在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)選明顯低于)對(duì)照組，就表明該候選物是抑制pp3774和JAB1結(jié)合的化合物。
7.一種pp3774基因或蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制備抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的組合物；或(b)制備調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)亡的組合物。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的組合物含有0.001-99.9wt％pp3774蛋白，按組合物的總重量計(jì)。
10.如權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的組合物還含有pp3774蛋白的促進(jìn)劑。
全文摘要
本發(fā)明基因pp3774(human Aph2，hAph2)的表達(dá)譜及抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的功能涉及腫瘤相關(guān)新基因，尤其涉及pp3774基因的功能應(yīng)用。pp3774基因可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘發(fā)細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期、并與已知基因JAB1結(jié)合，因而pp3774基因具有作為藥物篩選靶點(diǎn)用于篩選藥物(促進(jìn)或抑制pp3774和JAB1結(jié)合的物質(zhì))等潛在用途。
文檔編號(hào)A61K48/00GK1952165SQ200510030669
公開日2007年4月25日 申請(qǐng)日期2005年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月20日
發(fā)明者李錦軍, 張鋒銳, 顧建人 申請(qǐng)人:上海市腫瘤研究所