專利名稱：抗腫瘤復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及復(fù)方中草藥制劑，特別涉及一種抗腫瘤復(fù)方中草藥制劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
復(fù)方三根組方中主要包括虎杖根、藤梨根和水楊梅根，來源于經(jīng)驗組方，其配比為等量配比(郁仁存，腫瘤常用方劑選，中醫(yī)腫瘤學(xué)，199721)。在治療消化道腫瘤時提示它具有顯著的抗腫瘤作用(包素珍、孫在典等，中藥復(fù)方三根湯結(jié)合化療治療中晚期大腸癌120例，遼寧中醫(yī)雜志，1992(7)33～34)，但是其中的有效成分并不明確，并未得到進一步研究。
虎杖為蓼科多年生草本植物虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)的根，具有清熱解毒，祛風(fēng)利濕，活血通經(jīng)之功效，含羥基蒽醌類化合物，主要有大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、芪三酚甙、芪三酚以及多種多聚糖等?；⒄雀鶎π∈笕饬?80和人類子宮頸癌細胞的抑制率較好，50％煎劑對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌及福氏痢疾桿菌等有抑制作用；虎杖中的有效成分為蒽醌類化合物，其藥理作用研究得較多(張喜云，虎杖的化學(xué)成分、藥理作用與提取分離，天津藥學(xué)，1999，11(3)13)，但其有效部位的分離方法研究得較少，有人采用滲漉、浸泡、回流、索氏提取和超聲提取方法對虎杖蒽醌的提取率進行研究(曾里，袁佩，虎杖蒽醌提取分離方法的優(yōu)化研究，中國藥業(yè)，2003，12(9)45～48)，最終以70％乙醇抽提較好，提取率最高為1.58％；白黎蘆醇是近年來發(fā)現(xiàn)的虎杖中的又一抗癌活性成分，但在虎杖中的含量較低，僅為0.1％。公開號為CN1277954A的中國發(fā)明專利中報道了采用有機溶劑提取、萃取、濃縮、硅膠柱層析、結(jié)晶、重結(jié)晶獲得較高純度白黎蘆醇；公開號為CN1341587A的中國發(fā)明專利公開了利用乙酸乙酯直接萃取技術(shù)；公開號為CN1513822A的中國發(fā)明專利公開了微波萃取技術(shù)，公開號為CN1513823A的中國發(fā)明專利公開了超臨界CO2萃取技術(shù)，公開號為CN1546503A的中國發(fā)明專利公開了用聚酰胺層析分離技術(shù)。以上技術(shù)均未提及簡便易行、成本低廉的大孔樹脂提取法，也未將提取的有效部位直接用于復(fù)方藥物。
藤梨根為獼猴桃科落葉大藤本獼猴桃(Actinidia chinensis Planch.)的根，具有解毒活血，清熱利濕的作用，含維生素C、糖類、色素及氨基酸。有人發(fā)現(xiàn)了它具有抗癌作用(陳德軒，潘立群，抗腫瘤植物藥藤梨根，中藥材，2004，27(2)86～87)，其乙醇提取物腹腔給藥對試驗S180的抑制劑為30～40％。有人對其成分進行研究，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯的提取物對白血病細胞和結(jié)腸癌低分化腺癌細胞的抑制率分別達到54％和60％(鄒益友，譚桂山，謝兆霞，獼猴桃根抑制腫瘤細胞的實驗研究，湖南中醫(yī)藥導(dǎo)報，1999，5(4)37～38)，但未對其有效部位和成分分離方法作進一步研究，也無相關(guān)專利。
水楊梅根為茜草科落葉灌木植物水楊梅(Adina rubella(Sieb.etZucc.)Hance)的根，具有清熱解毒，散淤止痛之功效。根醇浸膏每日以5g/kg連續(xù)灌胃或腹腔注射6d，對小鼠白血病L615有抑制作用，抑制率為21.4％，對宮頸癌細胞及小白鼠肉瘤AK，及大白鼠肉瘤均有抑制作用(郁仁存，腫瘤常用中草藥，中醫(yī)腫瘤學(xué)，199772)，這提示它有廣譜抗腫瘤作用。目前對水楊梅根研究停留在對藥材的粗淺認識上，沒有從中找到主要的抗癌活性成分，因此揭示其活性成分及作用機理，對于其作為抗腫瘤藥物的研究與開發(fā)具有指導(dǎo)意義。水楊梅的花果序中含兒茶素類化合物，另有熊果酸、齊墩果酸、β-谷甾醇、水楊梅甲素及生物堿等，但水楊梅根的有效成分報道較少，只有何直升等(何直升等，水楊梅化學(xué)成分的研究，中草藥，1996，26(6)285～288)曾報道了采用硅膠柱層析自水楊梅根中分離的數(shù)種新的Quinovic acid糖苷化合物，但是未能進行抗腫瘤活性研究。Quinovic acid糖苷在其它抗腫瘤植物中也被發(fā)現(xiàn)，早在1978年Raffauf RF等自金雞納樹皮中發(fā)現(xiàn)了此種化合物，具有抗腫瘤活性，以后在其它植物中也發(fā)現(xiàn)(Raffauf RF，etal.Antitumor Plants.V Constituents of Cinchona pubescens，Lloydia，1978，41(5)432～434)，表明它也有可能是水楊梅根中主要抗腫瘤活性物質(zhì)。但未對其有效部位和成分分離方法作進一步研究。
虎杖根、藤梨根、水楊梅根及其組方有效成分或部位的大孔樹脂分離方法及制劑技術(shù)未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷和不足，提供一種抗腫瘤復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供一種上述制劑的制備方法。
本發(fā)明的再一目的是提供一種上述制劑在制備治療或預(yù)防大腸癌、胃癌等腫瘤疾病的藥中的應(yīng)用。
本發(fā)明目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)本抗腫瘤復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑是由下述按重量份計的原料制成虎杖根2～5；藤梨根1～3；水楊梅根1～3。
將上述各組分制成本發(fā)明制劑的制備方法包括以下步驟(1)將虎杖根、藤梨根、水楊梅根中藥材或其粉碎物混合，用熱水浸提，水溫80～100℃，提取時間1～2小時，過濾或離心分離去藥渣，保留提取液；熱水浸提重復(fù)提取2～3次，合并提取液；(2)向提取液中加入絮凝劑，靜置沉淀，過濾或離心分離去沉淀；(3)調(diào)節(jié)pH值，靜置沉淀，過濾或離心分離去沉淀，得到上清液；(4)將上清液經(jīng)大孔樹脂吸附后，用有機溶劑洗脫；(5)將洗脫液減壓濃縮、干燥后，粉碎成細粉；(6)將所得細粉添加輔型劑后，制成片劑或膠囊劑。
所述步驟(1)中的熱水浸提中，藥水比分別是第一次藥水比1∶8～12，第二次藥水比1∶4～6，第三次藥水比1∶4～6，其中藥水比為質(zhì)量百分比；所述提取液可以經(jīng)濃縮或未經(jīng)濃縮。
所述步驟(2)中的絮凝劑加入量可優(yōu)選按重量百分比計為藥材量的0.1～1％。絮凝劑可以是甲殼素、ZTC絮凝劑(天津正天成澄清技術(shù)有限公司產(chǎn)品)或明膠等中任一種。
所述步驟(3)中的提取液pH值調(diào)節(jié)為2～5，調(diào)節(jié)pH值所用試劑為鹽酸或醋酸等酸性試劑。
所述步驟(4)中的大孔樹脂為含各種非極性或弱極性的大孔樹脂；洗脫所用有機溶劑可以是乙醇水溶液、丙酮水溶液等有機溶劑。
所述步驟(5)所述干燥工藝可為真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥等方法。
以本發(fā)明制備的抗腫瘤復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑，可以用于制備治療或預(yù)防大腸癌、胃癌、直腸癌等腫瘤的藥劑；所述的藥劑可以是任何一種藥劑學(xué)上包括的劑型。
本發(fā)明相對現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果(1)采用80～100℃浸提2～3次，每次1～2小時，可以盡可能提高藥材中有效成分的轉(zhuǎn)移率；(2)采用絮凝劑沉淀，避免了乙醇沉淀法因沉淀不完全造成的損失和乙醇回收多增加的步驟；(3)采用調(diào)酸法，除去酸不溶物，提高大孔樹脂的吸附效果；(4)采用大孔樹脂對提取液中活性成分的精制，可以有效地純化中藥虎杖根、藤梨根、水楊梅根的有效部位(有效成分含量達80％以上)，便于工業(yè)化生產(chǎn)；(5)將虎杖根、藤梨根、水楊梅根的有效部位按一定比例混合制成制劑，可有效提高生物利用率，提高藥效；(6)填補了現(xiàn)有虎杖根、藤梨根、水楊梅根有效部位分離提取及制劑的缺乏，開發(fā)出一種新型的抗腫瘤有效部位或有效成分制劑。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1虎杖根2Kg、藤梨根1Kg、水楊梅根1Kg，粉碎成粗粉，加入100℃沸水40L，計時浸提90分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。過濾，濾渣再加入100℃沸水20L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。過濾，棄濾渣，合并兩次的濾液，濾液經(jīng)常壓濃縮至熱比重1.05，加入絮凝劑甲殼素4g，攪拌后離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，保留上清液，用10％HCl調(diào)pH至2，靜置，離心去沉淀(同上條件)，上清液經(jīng)過大孔樹脂HPD100，以70％乙醇水溶液洗脫被吸附的藥材有效成分，洗脫液減壓回收乙醇，真空度大于0.04Mpa，殘留物真空干燥，真空度大于0.01Mpa，干燥時間3小時。共制得干燥品105g，此干燥品中蒽醌類化合物含量89％。
實施例2虎杖根5Kg、藤梨根1Kg、水楊梅根1Kg，粉碎成粗粉，加入100℃沸水84L，計時浸提120分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，濾渣再加入100℃沸水41L，計時浸提120分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，棄濾渣，合并兩次的離心液，加入絮凝劑明膠70g，攪拌后過濾，濾液用5％HCl調(diào)pH至5，靜置，過濾去沉淀，上清液經(jīng)過大孔樹脂HPD300，以80％丙酮水溶液洗脫被吸附的藥材有效成分，洗脫液減壓回收乙醇，真空度大于0.04Mpa，殘留物冷凍干燥，溫度-50℃，干燥時間24小時，共制得干燥品95g，此干燥品中蒽醌類化合物含量96％。
實施例3虎杖根3Kg、藤梨根2Kg、水楊梅根1Kg，經(jīng)粉碎成粗粉，加入100℃沸水48L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。過濾，濾渣再加入100℃沸水24L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。過濾，濾渣再加入100℃沸水24L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持微沸狀態(tài)。過濾，棄濾渣，合并三次的濾液，濾液經(jīng)減壓濃縮至熱比重1.05(真空度大于0.04Mpa)，加入天津正天成澄清技術(shù)有限公司生產(chǎn)的ZTC絮凝劑30g，攪拌后離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，保留上清液，用20％醋酸1調(diào)pH至3，靜置，離心去沉淀(同上條件)，上清液經(jīng)過大孔樹脂HPD600，以60％乙醇水溶液洗脫被吸附的藥材有效成分，洗脫液減壓回收乙醇，真空度大于0.04Mpa，殘留物噴霧干燥，進風(fēng)溫度180℃，出口溫度90℃。共制得干燥品112g。此干燥品中蒽醌類化合物含量92％。
實施例4虎杖根2Kg、藤梨根3Kg、水楊梅根3Kg，粉碎成粗粉，加入80℃水80L，計時浸提90分鐘，期間保持加熱，維持80℃。過濾，濾渣再加入80℃水40L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持80℃。過濾，棄濾渣，合并兩次的濾液，濾液經(jīng)常壓濃縮至熱比重1.05，加入絮凝劑甲殼素10g，攪拌后離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，保留上清液，用10％HCl調(diào)pH至2，靜置，離心去沉淀(同上條件)，上清液經(jīng)過大孔樹脂D101，以80％乙醇水溶液洗脫被吸附的藥材有效成分，洗脫液減壓回收乙醇，真空度大于0.04Mpa，殘留物真空干燥，真空度大于0.01Mpa，干燥時間4小時。共制得干燥品135g。此干燥品中蒽醌類化合物含量86％。
實施例5虎杖根3Kg、藤梨根3Kg、水楊梅根2Kg，粉碎成粗粉，加入90℃水96L，計時浸提120分鐘，期間保持加熱，維持90℃。離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，濾渣再加入90℃水41L，計時浸提120分鐘，期間保持加熱，維持90℃。離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，棄濾渣，合并兩次的離心液，加入絮凝劑明膠40g，攪拌后過濾，濾液用5％HCl調(diào)pH至5，靜置，過濾去沉淀，上清液經(jīng)過大孔樹脂HPD300，以70％丙酮水溶液洗脫被吸附的藥材有效成分，洗脫液減壓回收乙醇，真空度大于0.04Mpa，殘留物冷凍干燥，溫度-50℃，干燥時間24小時。共制得干燥品103g。此干燥品中蒽醌類化合物含量98％。
實施例6虎杖根3Kg、藤梨根1Kg、水楊梅根2Kg，經(jīng)粉碎成粗粉，加入90℃水54L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持90℃。過濾，濾渣再加入90℃水27L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持90℃。過濾，濾渣再加入90℃水24L，計時浸提60分鐘，期間保持加熱，維持90℃。過濾，棄濾渣，合并三次的濾液，濾液經(jīng)減壓濃縮至熱比重1.05(真空度大于0.04Mpa)，加入ZTC絮凝劑50g，攪拌后離心(3000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)，保留上清液，用20％醋酸1調(diào)pH至3，靜置，離心去沉淀(同上條件)，上清液經(jīng)過大孔樹脂HPD600，以70％乙醇水溶液洗脫被吸附的藥材有效成分，洗脫液減壓回收乙醇，真空度大于0.04Mpa，殘留物噴霧干燥，進風(fēng)溫度180℃，出口溫度90℃，共制得干燥品98g，此干燥品中蒽醌類化合物含量95％。
實施例7稱取實施例2制得的有效部位干燥品1Kg，加入藥用淀粉、糖粉和糊精質(zhì)量比7∶2∶1混合物2Kg，混合均勻，濕法制粒，用水調(diào)節(jié)，制得顆粒松散，便于壓片狀態(tài)，過20目篩，晾干，加15g硬脂酸鎂，壓片，即得復(fù)方三根有效部位的片劑。
實施例8稱取實施例1制得的有效部位干燥品1Kg，加入藥用微晶纖維素2Kg，混合均勻，濕法制粒，用水調(diào)節(jié)，制得顆粒松散過20目篩，晾干，干燥后填充膠囊，即得復(fù)方三根有效部位膠囊劑。
實施例9稱取實施例3制得的有效部位干燥品1Kg，加入6Kg PEG6000(聚乙二醇6000)，加熱至60℃熔化后混合均勻，置于滴丸機內(nèi)，用液體石蠟致冷，滴丸。冷卻即得復(fù)方三根有效部位的滴丸劑。
實施例10稱取實施例4制得的有效部位干燥品1Kg，加入2Kg甘露醇，用滅菌水溶解后，過0.3μm微孔濾膜，罐裝入安培瓶中，-50℃冷凍干燥24小時，即得復(fù)方三根有效部位的凍干粉針。
實施例11將腫瘤細胞(2×106/ml)，放入無菌的96孔培養(yǎng)平板，每孔加腫瘤細胞懸液50μl，加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)液50μl，加實施例1提取物水溶液10μl，每組3孔，孔內(nèi)加等量的生理鹽水振蕩混勻，然后放入5％的CO2培養(yǎng)箱(37℃)培養(yǎng)24h，加入四唑鹽(MTT)磷酸緩沖液，每孔10μl(每ml含MTT5mg)繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后加二甲砜100ml，終止反應(yīng)，用酶膠免疫檢測儀，分別于波長570nm，630nm處測定光密度OD值，計算結(jié)果。
計算公式

在胃癌RF細胞株和直腸癌LS174T細胞株腫瘤細胞培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方三根有效部位對二種腫瘤的抑制率顯著高于復(fù)方三根水提液(直接加重量比10倍沸水提取2小時后濾液的濃縮液)，其抑瘤效果隨劑量遞增而提高。結(jié)果見表一。
表一 復(fù)方三根有效部位對胃癌和直腸癌細胞的抑制實驗


實施例12方法取小鼠S180瘤塊，勻漿后稀釋并調(diào)整細胞數(shù)至1×107/ml，以0.2ml注入小鼠右腋皮下，24h后隨機分組給藥，環(huán)磷酰胺(CTX)組腹腔給藥，生理鹽水(對照組)，三根水煎液組(直接加重量比10倍沸水提取2小時后濾液的濃縮液)和實施例1的復(fù)方三根有效部位提取物組灌胃，于第11天稱重處死小鼠取瘤塊，稱瘤重和測瘤體積，計算抑瘤率。
結(jié)果三根水煎液對S180抑瘤率為36.8％，而等劑量的復(fù)方三根有效部位的抑瘤率為65.5％，與對照組有顯著差異，而與CTX的差異不顯著，提示它具有良好的抗腫瘤作用。結(jié)果見表二。
表二 復(fù)方三根有效部位對S180肉瘤的抑制動物實驗

權(quán)利要求
1.一種復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑，其特征在于由下述按重量份計的原料制成虎杖根2～5；藤梨根1～3；水楊梅根1～3。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的方法，其特征在于包括以下步驟(1)將虎杖根、藤梨根、水楊梅根中藥材或其粉碎物混合，用熱水浸提，水溫80～100℃，提取時間1～2小時，過濾或離心分離去藥渣，保留提取液；熱水浸提重復(fù)提取2～3次，合并提取液；(2)向提取液中加入絮凝劑，靜置沉淀，過濾或離心分離去沉淀；(3)調(diào)節(jié)pH值，靜置沉淀，過濾或離心分離去沉淀，得到上清液；(4)將上清液經(jīng)大孔樹脂吸附后，用有機溶劑洗脫；(5)將洗脫液減壓濃縮、干燥后，粉碎成細粉；(6)將所得細粉添加輔型劑后，制成片劑或膠囊劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的熱水浸提中，藥水比分別是第一次藥水比1∶8～12，第二次藥水比1∶4～6，第三次藥水比1∶4～6，其中藥水比為質(zhì)量百分比；
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的絮凝劑加入量按重量百分比計為藥材量的0.1～1％。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中的提取液pH值調(diào)節(jié)為2～5，調(diào)節(jié)pH值所用試劑為鹽酸或醋酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中的大孔樹脂為含各種非極性或弱極性的大孔樹脂；洗脫所用有機溶劑是乙醇水溶液、丙酮水溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中的干燥為真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的應(yīng)用，其特征在于用于制備治療或預(yù)防大腸癌、胃癌、直腸癌等腫瘤的藥劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑的應(yīng)用，其特征在于所述藥劑可以是任何一種藥劑學(xué)上包括的劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗腫瘤復(fù)方虎杖根、藤梨根、水楊梅根制劑，它是由下述按重量份計的原料制成的藥劑虎杖根2～5；藤梨根1～3；水楊梅根1～3；本發(fā)明還提供一種上述制劑的制備方法，包括以下步驟將虎杖根、藤梨根、水楊梅根中藥材或粉碎物混合，用熱水浸提，得到提取液；向提取液中加入絮凝劑，靜置沉淀，過濾或離心分離去沉淀；調(diào)節(jié)pH值，得到上清液；將上清液經(jīng)大孔樹脂吸附后，用有機溶劑洗脫；將洗脫液減壓濃縮、干燥后，粉碎成細粉；將所得細粉添加輔型劑后，制成片劑或膠囊劑；本發(fā)明制劑可以用于制備治療或預(yù)防大腸癌、胃癌等腫瘤的藥劑，應(yīng)用于治療或預(yù)防大腸癌、胃癌等腫瘤疾病。
文檔編號A61P35/00GK1679796SQ20051003266
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月4日
發(fā)明者葉勇 申請人:華南理工大學(xué)