專利名稱：具有抗癌、抗菌作用的余甘子提取物及其中藥制劑的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥制劑，特別是以從余甘子的根、葉、皮、果中提取的黃酮類化合物制備的、具有抗癌和抗菌作用的中藥制劑。
背景技術(shù)：
余甘子(phyllanthus emblica L)是大戟科(Euphorbiaceae)葉下珠屬(phyllanthus)落葉小喬木或灌木，我國廣西、廣東、云南山上野生很多，過去為我國少數(shù)民族常用藥材，已被《中國藥典》收載。該植物的果實(shí)、根、樹皮、葉均可供藥用。余甘子性味甘、酸、澀、涼，歸肺、胃經(jīng)。其功能與主治為清熱涼血，消食健胃，生津止咳；用于血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛及口干。余甘子的主要化學(xué)成分有維生素C、多種氨基酸和鞣質(zhì)，其中包括葡萄糖投食子鞣質(zhì)(glucogallin)、投食子酸(gallic acid)、并投食子酸(ellagic acid)、鞣料云實(shí)精(carilagin)、原訶子酸(terchebin)、訶子酸(chebulinicacid)、粘酸(mucic acid)、油柑酸(phyllemblic acid)等。近年來，人們對(duì)余甘子進(jìn)行了多方面研究，并用有機(jī)溶劑對(duì)其有效成分進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)提取物中有一些抗菌活性成分，對(duì)葡萄球菌、傷寒桿菌、副傷寒桿菌、人腸桿菌及痢疾桿菌均有抑制作用，在民族藥學(xué)研究中，亞洲的一些國家如斯里蘭卡、緬甸、巴基斯坦、尼泊爾等國均有采用余甘子治療眼部疾病、痢疾、腸胃炎，有的用于治療淋病等。我國民間則有利用余甘果抗菌、生津止咳及治療急慢性咽喉炎的歷史，經(jīng)現(xiàn)代檢測技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，余甘子果實(shí)中含多種抗氧化成分維生素C，鞣質(zhì)，維生素E，還含超氧化物歧化酶(SOD)。因此很多醫(yī)學(xué)工作者對(duì)余甘子進(jìn)行了多方面的研究。我們經(jīng)過檢索，還查到以下的有關(guān)余甘子的公開文獻(xiàn)1.題名藏藥余甘子化學(xué)成分研究作者張?zhí)m珍[1]趙文華[1]郭亞健[1]涂光忠[2]林樹[1]辛林廣[1]機(jī)構(gòu)[1]北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，[2]北京微量化學(xué)研究所，北京10009刊名中國中藥雜志.2003，28(10).-940-9文摘目的研究藏藥余甘子的化學(xué)成分。方法各種色譜法分離純化，理化和現(xiàn)代波譜法鑒定結(jié)構(gòu)。結(jié)果分離鑒定出11個(gè)化合物，分別為沒食子酸(I)，鞣花酸(II)，I-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(III)，3，6-二-O--沒食子酰基-D-葡萄糖(IV)，訶子酸(V)，槲皮素(VI)，訶黎勒酸(VII)，鞣云實(shí)精(VIII)，3-乙基沒食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-bellzcic acid，IX)，isoscrtiniin(X)，1，6-二-O-沒食子?；?D-葡萄糖(XI)。結(jié)論3-乙基沒食子酸(3-ethoxy-4，5-dihydroxy-benzoic acid)為一新化合物，isostrietiniin為首次從余甘子中得到的化合物。
2.題名民族藥余甘子對(duì)D-半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的影響作者李萍 謝金鮮 林啟云機(jī)構(gòu)廣西中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，刊名中國民族民間醫(yī)藥雜志.2003(3).-161-1文摘方法本實(shí)驗(yàn)利用D-半乳糖胺(D-Gal-N)一次性腹腔注射(ip)誘發(fā)小白鼠急性肝損傷模型，通過測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及肝糖元、肝臟系數(shù)，觀察余甘子水提醇沉物對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果余甘子水提醇沉物各劑量組成均降低血清ALT、AST、ALP、MDA含量和肝臟系數(shù)，提高血清SOD活性及促進(jìn)肝糖元合成，并可改善肝臟組織病理損傷，其作用呈劑量依賴性。結(jié)論余甘子水提醇沉物有一定程度抗自由基與抗脂質(zhì)過氧化作用，對(duì)D-Gal-N所致的急性損傷具有明顯的保護(hù)作用。
3.題名民族藥余甘子的急性毒理與藥效學(xué)研究作者李萍 謝彬等機(jī)構(gòu)廣西中醫(yī)學(xué)院藥理教研室，刊名中醫(yī)藥學(xué)刊.2002，20(6).文摘目的觀察余甘子抗肝損傷的作用。并揭示其作用機(jī)理，方法一是觀察余甘子對(duì)小鼠的急性毒性作用。二是采用四氯化碳(CCl4)一次性腹腔注射(ip)造成小鼠急性肝損傷模型。檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，堿性磷酸酶(ALP)，肝糖元水平，計(jì)算肝臟系數(shù)，并作病理學(xué)觀察。結(jié)果(1)余甘子水提物的LD50為35.16±2.5g/kg。(2)余甘子水提物各劑量組均可降低CCl4所致的急性肝損傷小鼠血清ALT，AST，ALP的活性及肝臟系數(shù)，并能增加肝糖元含量，改善肝臟組織病理損傷，其作用呈劑量依賴性，結(jié)論余甘子水提物對(duì)CCl4所致的急性肝損傷具有預(yù)防作用；該藥口服安全，毒性極小。
4.題名余甘子的化學(xué)成分及在民族民間傳統(tǒng)醫(yī)藥中的應(yīng)用作者侯開衛(wèi)機(jī)構(gòu)中國林科院資源昆蟲所，刊名中國民族民間醫(yī)藥雜志.2002(6).-345-348文摘在進(jìn)行余甘子的化學(xué)成分、食療保健功能、藥理學(xué)等方面研究的同時(shí)，收集了國內(nèi)外的有關(guān)資料，從科甘子的化學(xué)成分、藥理學(xué)、臨床應(yīng)用以及在國內(nèi)外民族民間傳統(tǒng)醫(yī)藥中的應(yīng)用作了較為系統(tǒng)的綜述，為余甘子復(fù)方醫(yī)藥制劑的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
題名民族藥余甘子的本草學(xué)概況作者周濤[1]邱德文[2]機(jī)構(gòu)[1]貴陽中醫(yī)學(xué)院，刊名貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2002，24(3).-3-文摘對(duì)余甘子的名稱來源、植物形態(tài)、生態(tài)環(huán)境和民族用藥形式進(jìn)行概述。余甘子作為一個(gè)重要的傳統(tǒng)民族藥，本草學(xué)的研究將隨著其現(xiàn)代藥理學(xué)研究的開展，對(duì)開發(fā)和利用其資源奠定了中醫(yī)藥與民族藥深層的溝通與交流的理論基礎(chǔ)。
題名埃及藥用植物中抗人類免疫缺陷病毒藥物的研究作者孫曉芳[1]杜貴友[2]等機(jī)構(gòu)[1]中國中醫(yī)研究院西苑醫(yī)院，[2]中國中醫(yī)研究院中藥研究所，刊名中國中藥雜志.2002，27(9).文摘對(duì)來自埃及的97種藥用植物的天然植物及其甲醇提取物和水提取物的抑制逆轉(zhuǎn)錄(RT)酶和抑制HIV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞病理作用(CPE)進(jìn)行體外評(píng)價(jià)。余甘子Phyllanthus emblica L.果實(shí)的甲醇提取物顯示出很強(qiáng)的抑制HIV-1的RT作用，其50％抑制濃度(IC50)值為9μg·mL^-1。對(duì)甲醇提取物通過生物活性導(dǎo)向分級(jí)分離(bioactivity-guided fractionation)得到抑制性有效物質(zhì)PutranjivainA(PA)，其IC50值為3.9μm。巴豆Croton tiglium種子的水提物和甲醇提取物可以顯著的抑制傳染性和HIV-1誘導(dǎo)的MT-4細(xì)胞的CPE，它們的IC50值分別為0.025μg·mL^-1和2.0μg·mL^-1，且均低于產(chǎn)生細(xì)胞毒性的濃度(選擇性指數(shù)分別為34.4和50.0)。通過生物活性導(dǎo)向分級(jí)分離，從甲醇提取物中分離得到8種佛波醇酯，對(duì)它們抑制HIV-1誘導(dǎo)的MT-4細(xì)胞的CPE的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)12-O-從四(烷)酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)既是HIV-1誘導(dǎo)的CPE的抑制劑(IC100值為0.48ng·mL^-1)，又是PKC的活化劑。另證明，12-O-乙酰佛波醇-13-癸酸酯(APD)有抗HIV-1的作用(IC100值為7.6ng·mL^-1)，但沒有PKC的活化作用，另證明，12-O-乙酰佛波醇-13-癸酸酯(APD)有抗HIV-1的作用(IC100值為7.6ng·mL^-1)，但沒有PKC的活化作用。
題名民族藥余甘子的現(xiàn)代研究進(jìn)展作者周濤[1]廖波[2]機(jī)構(gòu)[1]貴陽中基學(xué)院，[2]興義市藥檢所，刊名貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2002，24(2).-50-文摘余甘子作為一味重要的傳統(tǒng)民族藥，隨著現(xiàn)代化學(xué)，藥理學(xué)研究的進(jìn)一步展開，不但闡釋了其民族用藥形式，而且使余甘子在補(bǔ)益，抗衰老，抗腫瘤等方面的功能得到認(rèn)識(shí)，為更合理地開發(fā)利用它創(chuàng)造了條件。
題名余甘子的藥理研究作者李昌玲機(jī)構(gòu)福建安摩樂制藥實(shí)業(yè)有限公司，刊名藥學(xué)進(jìn)展.2001，25(4).-210-21文摘中草藥余甘子在新藥和保健食品開發(fā)方面極具應(yīng)用價(jià)值。余甘子的藥理研究表明，其具抗微生物感染、抗氧化、抗腫瘤、降血脂和血糖、降壓、補(bǔ)益等多種生物學(xué)活性，且無明顯毒副作用。
題名中藏藥中訶子、毛訶子和余甘子的本草考證作者周寧[1]彭富全[2]機(jī)構(gòu)[1]廣州市醫(yī)藥中等專業(yè)學(xué)校[2]廣州陳李濟(jì)藥廠，刊名中草藥.2001，32(4).-355-35文摘目的初步探討訶子，毛訶子和余甘子在中藥和藏藥中的關(guān)系。方法本草考證和應(yīng)用歷史追溯，結(jié)果訶子，毛訶子和余甘子都是中藥中的外來藥，是伴隨佛經(jīng)傳入我國，在應(yīng)用上與藏藥比較有取舍和偏重，結(jié)論應(yīng)運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)研究成果對(duì)中醫(yī)藥與民族藥進(jìn)行相互之間的深層溝通和交流以豐富中醫(yī)藥學(xué)。
題名余甘子的生藥鑒定作者羅干明[1]徐紀(jì)文[2]機(jī)構(gòu)[1]廣東省佛山藥品檢驗(yàn)所[2]廣東省佛山市藥商業(yè)總公司刊名中草藥.2000，31(6).-461-4文摘對(duì)余甘子的組織與粉末顯微特征進(jìn)行了鑒定，糾正和補(bǔ)充了原文獻(xiàn)的研究，為余甘子的藥材鑒別提供了依據(jù)。
題名傳統(tǒng)藥物余甘子的民族藥學(xué)研究作者夏泉[1]孔杰[2]機(jī)構(gòu)[1]中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥用植物研究所[2]西北師范大學(xué)植物研究所植化研究室刊名中國中藥雜志.1997，22(9).-515-518，52文摘系統(tǒng)研究了余甘子的民族藥學(xué)，介紹了余甘子的生物學(xué)特性，地理分布格局，化學(xué)組成以及近年來所開展的藥理研究成果，并介紹了17個(gè)國家及民族在其醫(yī)療實(shí)踐中對(duì)余甘子的傳統(tǒng)使用。通過跨文化比較研究指出，作為一種重要的傳統(tǒng)藥物，余甘子與保肝，抗癌，健胃，抗誘變，抗衰老等35種功能有關(guān)，是一種具有廣闊開發(fā)前景的藥用植物。
從上述專利文獻(xiàn)了解到，目前對(duì)余甘子的研究除了其抗菌活性成分以外，藥物研究人員還發(fā)現(xiàn)余甘子具有保肝，抗癌，健胃，抗誘變，抗衰老、抗免疫缺陷等作用，而且余甘子口服安全，毒性小。但目前的公開文獻(xiàn)對(duì)余甘子提取物的化學(xué)成分以及抗菌和抗癌機(jī)理未見有詳細(xì)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從余甘子及其根、葉、皮或果實(shí)中分離出活性成分，并用這些活性成分作為制備抗菌和抗癌藥物的原材料，從而更好地利用我國的中草藥資源，豐富中草藥治療疾病的領(lǐng)域。
本發(fā)明人通過對(duì)余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)的提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)具有抗菌和抗癌作用的成分為黃酮類化合物。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，用從余甘子及其根、葉、皮中提取的黃酮類化合物制成的中藥制劑，在體外試驗(yàn)及細(xì)菌感染病人身上應(yīng)用，結(jié)果顯示有良好的抗菌效果；在體內(nèi)外的抗癌試驗(yàn)研究表明，其黃酮類化合物有良好的抗癌效果。
本發(fā)明提取的抗菌和抗癌有效成分，其化學(xué)鑒別反應(yīng)和光譜特性如下(1)金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)①鹽酸--鎂粉反應(yīng)在樣品乙醇溶液中加入少量鎂粉，再滴加1～2滴濃鹽酸，在水浴中加熱3min，溶液顏色變?yōu)榧t色。
②AlCl3顯色反應(yīng)將樣品的乙醇溶液滴于濾紙上形成斑點(diǎn)，再往斑點(diǎn)上噴1％AlCl3乙醇溶液，置紫外燈下檢示，斑點(diǎn)顯黃色。
(2)堿性試劑顯色反應(yīng)常溫下往樣品液中滴加NaOH水溶液，搖勻，溶液顏色變?yōu)槌燃t色。
(3)紫外吸收光譜特征樣品液用甲醇或乙醇溶解，在紫外段波長測定吸收峰。結(jié)果表明，在265nm和336nm出現(xiàn)最大吸收峰。
以上結(jié)果說明，本發(fā)明人從余甘子及其根、葉、皮中提取的有效成分的化學(xué)鑒別反應(yīng)結(jié)果和紫外吸收測定特性符合黃酮類化合物的特征。
以下是制備余甘子黃酮類化合物的例子。這些例子只是用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例說明，而不是對(duì)本發(fā)明的提取方法的限制原料包括余甘子的根、樹皮、葉、果實(shí)或以上植株部位的混合物，以下簡稱藥材；可采用干品或鮮品，但推薦使用干品，以便于貯存，保證原料品質(zhì)的一致性。
提取前的處理先將余甘子原料粉碎，制成60目以上的粗粉。
提取方法一藥材粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液，過濾，濾液用大孔樹脂吸附。水洗柱后用30-95％或95％以上的乙醇水溶液洗脫，洗脫液回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
提取方法二藥材粗粉，95％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，過濾，濃縮成干膏，上硅膠柱，以乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，收集含黃酮類化合物的流份?；厥杖軇?，即得余甘子總黃酮。
提取方法三藥材粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液，微濾(濾孔0.2μm-0.45μm)，濾液上大孔吸附樹脂柱吸附，用95％乙醇，或者比乙醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、混合溶劑如乙酸乙酯和石油醚的混合物，洗脫。洗脫液回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
提取方法四藥材粗粉，95％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，過濾，濃縮成稠膏或干膏，用正丁醇，或者比正丁醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、石油醚、混合溶劑如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，溶解，過濾，濾液回收溶劑，提取物中主要含有黃酮類化合物。
提取方法五提取方法一所得的水提取液，濃縮到1∶1(藥材重量∶溶液體積)，用正丁醇，或者比正丁醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、石油醚、混合溶劑如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，萃取。收集有機(jī)相，回收溶劑，提取物中主要含有黃酮類化合物。
本發(fā)明所述方法提取得到的余甘子黃酮類化合物，在生產(chǎn)上，可根據(jù)需要，制備不同的制劑(或劑型)口服給藥制劑，如口服液、片劑、膠囊、含片；經(jīng)皮給藥制劑，如酊劑、搽劑、貼膏；注射給藥制劑，如注射劑；噴霧給藥制劑，如噴鼻劑、噴喉劑。
提取方法采用通常的制藥工藝和方法，不管以什么方法制備，均以提取物中含有抗菌有效物質(zhì)為原則，即提取物中得到黃酮類化合物，其它可能含有少量的生物堿、皂苷類，但在層析過程剩余已經(jīng)不多。
以下是抗癌、抗菌中藥制劑的制備實(shí)例在本發(fā)明的抗癌、抗菌中藥制劑中，含余甘子及根、葉、皮或果實(shí)提取物干物質(zhì)0.00001-100％，輔料0-99.99999％?？筛鶕?jù)需要，制備不同的劑型口服給藥制劑，如口服液、片劑、膠囊、含片；經(jīng)皮給藥制劑，如酊劑、搽劑、貼膏；注射給藥制劑，如注射劑；噴霧給藥制劑，如噴鼻劑、噴喉劑。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明實(shí)施的例子。這些例子只用于舉例說明本發(fā)明的實(shí)施，并不是對(duì)本發(fā)明的限定。
提取方法實(shí)施例一藥材粗粉，加5倍水煎煮3-4次，合并水煮液，過濾，濾液用大孔樹脂吸附。水洗柱后用75％的乙醇水溶液洗脫，洗脫液回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
提取方法實(shí)施例二藥材粗粉，85％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，過濾，濃縮成干膏，上硅膠柱，以乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，收集含黃酮類化合物的流份?；厥杖軇?，即得余甘子總黃酮。
提取方法實(shí)施例三藥材粗粉，加3倍水煎煮3-4次，合并水煮液，微濾(濾孔0.2μm-0.45μm)，濾液上大孔吸附樹脂柱吸附，用95％乙醇，或者比乙醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、混合溶劑如乙酸乙酯和石油醚的混合物，洗脫。洗脫液回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
提取方法實(shí)施例四藥材粗粉，55％乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，過濾，濃縮成稠膏或干膏，用正丁醇，或者比正丁醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、石油醚、混合溶劑如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，溶解，過濾，濾液回收溶劑，提取物中主要含有黃酮類化合物。
提取方法實(shí)施例五提取方法一所得的水提取液，濃縮到1∶1(藥材重量∶溶液體積)，用正丁醇，或者比正丁醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、石油醚、混合溶劑如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，萃取。收集有機(jī)相，回收溶劑，提取物中主要含有黃酮類化合物。
制備實(shí)施例一取以上提取方法一所得余甘子黃酮類化合物10克，加適量的水溶解，加入60克白糖粉，溶解，滅菌，分裝，制得口服液100ml。每100ml口服液相當(dāng)于100g余甘子生藥材。
制備實(shí)施例二取以上提取方法二所得余甘子黃酮類化合物，用適量30％乙醇溶解，制成每ml含生藥10g的酊劑溶液，供外傷傷口殺菌。
制備實(shí)施例三取以上提取方法三所得余甘子黃酮類化合物10克，加純水溶解，微孔過濾，分裝入凍干瓶，冷凍干燥，供注射用。每瓶相當(dāng)于10g余甘子生藥材。
制備實(shí)施例四取以上提取方法四所得余甘子黃酮類化合物，用適量30％乙醇溶解，加入1％氮酮作滲透劑，制成每ml含生藥5g的皮膚搽劑溶液。
制備實(shí)施例五取以上提取方法五所得余甘子黃酮類化合物，加適量淀粉制粒，壓成片劑，基片重0.3g，或包衣，每片相當(dāng)于4g余甘子生藥材。
制備實(shí)施例六制備實(shí)施例五所得顆粒，裝入零號(hào)膠囊，每囊裝0.6克，每粒膠囊相當(dāng)于8g余甘子生藥材。
制備實(shí)施例七提取方法一所得余甘子黃酮類化合物100克，加1400克白糖粉，制成顆粒，分裝成每袋重15克的沖劑。每袋相當(dāng)于10g余甘子生藥材。
制備實(shí)施例八提取方法一所得余甘子黃酮類化合物1克，研成200目以上的細(xì)粉，裝入噴瓶中，可制備噴鼻劑或噴喉劑。
本發(fā)明的余甘子黃酮類化合物具體藥理和藥效學(xué)臨床試驗(yàn)。
一、抗癌作用試驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)材料1.1余甘子總黃酮 鐘振國提供，臨用前用二甲基亞砜溶解后無菌過濾備用。
1.2腫瘤細(xì)胞株 白血病細(xì)胞株L1210和P388D1、宮頸癌細(xì)胞株Hela、人胃癌細(xì)胞株SGC7901、黑色素瘤細(xì)胞株B16、神經(jīng)腫瘤細(xì)胞株NG108-15等均購自上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫，人肝癌細(xì)胞株Hele7404由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。
1.3試劑MTT(四甲基噻唑藍(lán))為德國Sigma公司產(chǎn)品，批號(hào)020609；FBS(胚胎牛血清)為美國Hyclone公司產(chǎn)品，批號(hào)0405；RPMI1640和DMEM培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品，批號(hào)1120708和0311；Trypsin(胰蛋白酶)由天津市灝洋生物制品有限責(zé)任公司提供，批號(hào)200503；DMSO(二甲基亞砜)由天津匯英化學(xué)試劑有限公司提供，批號(hào)20030526。
1.4實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱(ThermO Forma)，美國產(chǎn)。倒置顯微鏡(Olympus)，日本產(chǎn)。酶標(biāo)儀(Biocell)，澳地利產(chǎn)。
2實(shí)驗(yàn)方法2.1MTT法參考文獻(xiàn)報(bào)道[3]，在96孔培養(yǎng)板(NUNC)中每孔加入200μl(含有5000個(gè)/ml腫瘤細(xì)胞)含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基的細(xì)胞懸液(除NG108-15細(xì)胞用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基外)，置37℃10％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實(shí)驗(yàn)組分別加入最終濃度0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子總黃酮的培養(yǎng)液，對(duì)照組則加入等濃度等體積溶劑的培養(yǎng)液，每組4孔，重復(fù)4次。置37℃，10％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天后，棄去上清液，加入200μl/孔新鮮配制的含0.2mg/ml MTT的無血清培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，加入200μlDMSO，振蕩混勻后，在酶標(biāo)儀上以波長為550nm，參比波長為450nm測定OD值。計(jì)算結(jié)果。
按下式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長的抑制率。
腫瘤細(xì)胞生長抑制率％＝(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照平均OD值)×100％2.2集落形成法取對(duì)數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞(Hela、SGC7901、B16)用10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液和NG108-15用10％FBS的DMEM培養(yǎng)液配成500個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于35mm培養(yǎng)皿(NUNC)中，4個(gè)為一組，每個(gè)2ml；實(shí)驗(yàn)組加入終濃度為0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子總黃酮的細(xì)胞懸液200ul。對(duì)照組加入等濃度等體積溶劑的細(xì)胞懸液200ul。置5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中靜置7d；棄去培養(yǎng)液，用瑞氏-姬姆薩染色后計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落。對(duì)懸浮細(xì)胞(L1210和P388D1)用10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)液配成1000個(gè)/ml細(xì)胞懸液，置37℃預(yù)溫；取35mm培養(yǎng)皿(NUNC)，4個(gè)為一組，實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子總黃酮，對(duì)照組則加入等體積的溶劑；取已融化的5％瓊脂液1份，加入到9份37℃含15％FBS的新鮮RPMI1640培養(yǎng)液中，搖勻加入平皿中，每個(gè)1ml，置室溫使其凝固；取預(yù)溫的細(xì)胞懸液按每9.4ml加5％瓊脂0.6ml的比例混勻，加到已鋪底層瓊脂的平皿中，每個(gè)1ml，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d；在顯微鏡下計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落。
按下列公式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞集落形成抑制百分率腫瘤細(xì)胞集落形成抑制百分率％＝(1-實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞集落數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞集落數(shù))×100％2.3生長曲線法將L1210、P388D1、Hela、SGC7901、B16、Hele7404細(xì)胞接種于含10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，NG108-15則用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，分別配成10×103個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，然后加入96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，實(shí)驗(yàn)組加入最終濃度為0.5ug/ml、1.0ug/ml、5.0ug/ml的余甘子總黃酮，對(duì)照組加入等濃度等體積溶劑。每種細(xì)胞每濃度設(shè)三孔，重復(fù)4次，置10％CO237℃溫箱中培養(yǎng)，然后按0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d各取樣40μl，加入0.4％臺(tái)盼藍(lán)液10μl，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。每孔計(jì)數(shù)4次，取均值，再累計(jì)3孔均值，根據(jù)細(xì)胞濃度值的對(duì)數(shù)值與時(shí)間作用繪成圖，即為細(xì)胞生長曲線。
2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，兩組間的均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。
3實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1MTT法測定不同濃度余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞株生長的抑制。結(jié)果見表1。
表1 不同濃度余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制的影響(％)


注與對(duì)照組比較1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.005，4)P＜0.001結(jié)果顯示，余甘子總黃酮對(duì)7類腫瘤細(xì)胞株有抑制作用，并與濃度有關(guān)。當(dāng)余甘子總黃酮濃度較低(0.5μg/ml)時(shí)，藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞作用不明顯。隨著藥物濃度升高，藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制殺傷越來越明顯。其中藥物對(duì)白血病細(xì)胞株P(guān)388D1較為敏感。
3.2集落形成法觀察不同濃度余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用。結(jié)果見表2。
表2 不同濃度余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制的影響(％)

注與對(duì)照組比較1)P＜0.05，2)P＜0.01，3)P＜0.005，4)P＜0.001集落形成法的結(jié)果顯示，余甘子總黃酮對(duì)7類腫瘤細(xì)胞株的集落形成有抑制作用。其結(jié)果與MTT法是較一致的。
3.3生長曲線法不同濃度余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞株生長的影響過程。結(jié)果見說明書附圖。


說明書附圖對(duì)生長曲線法不同濃度余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞株生長的影響過程。其中圖1展示了不同濃度余甘子總黃酮作用L1210細(xì)胞生長曲線情況。
圖2不同濃度余甘子總黃酮作用HELE740細(xì)胞生長曲線情況。
圖3不同濃度余甘子總黃酮作用Hela細(xì)胞生長曲線情況。
圖4不同濃度余甘子總黃酮作用P388D1細(xì)胞生長曲線情況。
圖5不同濃度余甘子總黃酮作用B16細(xì)胞生長曲線情況。
圖6不同濃度余甘子總黃酮作用NG108-15細(xì)胞生長曲線情況。
圖7不同濃度余甘子總黃酮作用SGC7901細(xì)胞生長曲線情況。
從圖1-圖7的結(jié)果顯示，余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞生長過程有抑制作用。7個(gè)附圖都可以看到，藥物濃度較低(0.5μg/ml)時(shí)，與對(duì)照組相比，藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用不明顯隨著藥物濃度升高，抑制腫瘤細(xì)胞的作用表現(xiàn)較為明顯。從圖中還可獲知，對(duì)照組DMSO伴隨濃度升高對(duì)腫瘤細(xì)胞也有一定抑制作用。余甘子總黃酮以對(duì)白血病細(xì)胞株P(guān)388D1較為敏感。結(jié)果與前兩種方法是一致的。
4結(jié)論在體外試驗(yàn)中，余甘子總黃酮對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長具有明顯的抑制作用。
圖中雖然只是給出了余甘子根提取物總黃酮的情況，但從余甘子根、葉、皮或果實(shí)提取的總黃酮的化學(xué)成分相差不大，試驗(yàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)省略。
二、抗菌作用試驗(yàn)1.提取物的制備余甘子及其根、葉、皮曬干，打成粗粉，分別用水、95％乙醇、石油醚、正丁醇、乙酸乙酯提取，回收溶劑，制成各自的提取物。此外，水提液濃縮到1∶1(藥材重量∶溶液體積)，用石油醚萃取，收集有機(jī)相，回收溶劑，得石油醚萃取物；95％乙醇提取物用乙酸乙酯溶解，過濾，收集濾液，同收溶劑，得乙酸乙酯抽提物。
2.方法固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法。
3.結(jié)果見下表。

4.結(jié)果各提取物在低濃度時(shí)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、傷寒沙門菌、肺炎克雷伯菌、甲型鏈球菌和乙型溶血性鏈球菌即表現(xiàn)出抑制作用。
對(duì)以上實(shí)例一所得口服液，委托廣西中醫(yī)學(xué)院藥理教研室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，受試小白鼠不出現(xiàn)急性毒性和長期毒性反應(yīng)，測不出LD50。
六、臨床效果因本發(fā)明尚未獲得新藥臨床批件，不能進(jìn)入臨床研究，因此只在2例志愿者身上進(jìn)行臨床應(yīng)用實(shí)驗(yàn)。
例一 黃××，女，廣西南寧市人，43歲，手部刀傷深及肌肉層，護(hù)理不當(dāng)而發(fā)炎、化膿。以上述制備實(shí)例二所得酊劑，每隔4小時(shí)搽一次，三日后炎癥和膿水消失，傷口逐漸愈合。
例二 莫××，男，廣西南寧市人，37歲，飲食不潔致菌痢性腹瀉。予上述制備實(shí)例一所得口服液口服，每日三次，每次50ml，服二次后腹瀉停止，續(xù)服一日，全部痊愈。
例三 黃××，男，廣西橫縣農(nóng)民，52歲，肺癌病人。因經(jīng)濟(jì)困難中斷醫(yī)院正常治療改為服用制備實(shí)例六所得膠囊30天，期間病情沒有惡性發(fā)展。
例四 董××，男，廣西恭城縣農(nóng)民，60歲，慢支肺氣腫肺部感染病人。因病況反復(fù)發(fā)作，加上經(jīng)濟(jì)困難而中斷醫(yī)院正常治療，改為服用制備實(shí)例五所得片劑10天，病情有所好轉(zhuǎn)，氣喘消失，繼續(xù)服用3周后肺氣腫明顯好轉(zhuǎn)。
權(quán)利要求
1.一種具有抗癌和抗菌作用的化合物，其特征在于它是從余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)中提取的黃酮類化合物，其化學(xué)鑒別反應(yīng)和光譜特性如下(1)金屬鹽類試劑的絡(luò)合反應(yīng)①鹽酸—鎂粉反應(yīng)在樣品乙醇溶液中加入少量鎂粉，再滴加1～2滴濃鹽酸，在水浴中加熱3min，溶液顏色變?yōu)榧t色；②AlCl3顯色反應(yīng)將樣品的乙醇溶液滴于濾紙上形成斑點(diǎn)，再往斑點(diǎn)上噴1％AlCl3乙醇溶液，置紫外燈下檢示，斑點(diǎn)顯黃色；(2)堿性試劑顯色反應(yīng)常溫下往樣品液中滴加NaOH水溶液，搖勻，溶液顏色變?yōu)槌燃t色；(3)紫外吸收光譜特征樣品液用甲醇或乙醇溶解，在紫外段波長測定吸收峰，結(jié)果表明，在265nm和336nm出現(xiàn)最大吸收峰。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)中具有抗癌和抗菌作用的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于將余甘子粗粉加水煎煮3-4次，加水煎煮3-4次，合并水煮液，過濾，濾液用大孔樹脂吸附，水洗柱后用30-95％或95％以上的乙醇水溶液洗脫，洗脫液回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)中具有抗癌和抗菌作用的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于余甘子粗粉，乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，過濾，濃縮成干膏，上硅膠柱，以乙酸乙酯-石油醚梯度洗脫，收集含黃酮類化合物的流份，回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)中具有抗癌和抗菌作用的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于余甘子粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液，0.2μm-0.45μm濾孔微濾，濾液上大孔吸附樹脂柱吸附，用乙醇，或者比乙醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、混合溶劑乙酸乙酯和石油醚的混合物，洗脫，洗脫液回收溶劑，即得余甘子總黃酮。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)中具有抗癌和抗菌作用的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于余甘子粗粉，乙醇回流提取2-3次，合并醇提液，過濾，濃縮成稠膏或干膏，用正丁醇，或者比正丁醇極性小的溶劑如乙酸乙酯、石油醚、混合溶劑如乙酸乙酯和正丁醇的混合物，溶解，過濾，濾液回收溶劑，提取物中主要含有黃酮類化個(gè)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的余甘子根、樹皮、葉或果實(shí)中具有抗癌和抗菌作用的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于將余甘子粗粉，加水煎煮3-4次，合并水煮液水提取液，濃縮到溶液體積的1∶1，用正丁醇，或者比正丁醇極性小的溶劑乙酸乙酯、石油醚或者混合溶劑乙酸乙酯和正丁醇的混合物，萃取，收集有機(jī)相，回收溶劑，得到黃酮類化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌中藥制劑，其特征在于將提取的抗癌、抗菌化合物化合物做成以下制劑或劑型口服給藥制劑口服液、片劑、膠囊、含片；經(jīng)皮給藥制劑酊劑、搽劑、貼膏；注射給藥制劑注射劑；噴霧給藥制劑，噴鼻劑、噴喉劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1和7所述的抗癌、抗菌中藥制劑，其特征在于從余甘子的取的黃酮類化合物在制劑中的中的成分和干物質(zhì)重量百分含量如下從余甘子提取的黃酮類化合物 0.00001-100％輔料 0-99.99999％所述的與該中藥制劑配合的輔料，從國際或我國規(guī)定的藥用輔料中選取。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從余甘子的根、樹皮、葉或果實(shí)中提取的具有抗癌、抗菌作用的黃酮類化合物，其提取方法可以采用水煮法、醇提法、大孔樹脂吸附法、萃取法；用該黃酮類化合物制成不同的中藥制劑，有較好的抗菌和抗癌作用。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1733752SQ20051003662
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月22日
發(fā)明者鐘振國, 董明姣 申請人:廣西中醫(yī)學(xué)院