專利名稱：一種茶葉活性單體組合物及其在防治腫瘤中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說涉及一種防治腫瘤的純天然藥物組合物。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危及人類生命的最嚴(yán)重的疾病之一，是僅次于心血管病的第二高死亡率的疾病。利用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的靶分子為靶點(diǎn)進(jìn)行抗癌藥物篩選，尤其是天然產(chǎn)物中提取的抗癌藥物的作用機(jī)制研究，正在成為一個(gè)人們密切關(guān)注的新領(lǐng)域，在中國，一片片的茶園，使茶葉成為了資源最豐富的植物之一，茶葉活性成分的開發(fā)與利用已成為一個(gè)熱門的課題，其藥用價(jià)值的研究具有廣泛的前景。
茶葉中茶多酚類化合物含量高，諸多研究表明茶葉具有抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、抗畸變、降血壓、降血脂、降血糖、防輻射等多種保健功能。茶葉成分中，具有較高活性的兒茶素在癌癥的啟動(dòng)、發(fā)生、發(fā)展等各個(gè)階段均有作用，目前兒茶素抗癌的主要機(jī)制是通過抗氧化途徑，直接清除自由基或增強(qiáng)抗氧化酶的活性而間接產(chǎn)生作用。用兒茶素單體進(jìn)行抗癌的實(shí)驗(yàn)已有不少的報(bào)道，證實(shí)了兒茶素具有較好的抗癌作用。中國專利申請(qǐng)?zhí)枮?2111627.X，名稱為表沒食子兒茶素沒食子酸酯在抗腫瘤藥物中應(yīng)用，公開了表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。但其單體純化合物不但價(jià)格昂貴，且來源并不豐富，大大限制了這些單體化合物在醫(yī)藥上的應(yīng)用。如果用茶多酚混合物，其抗腫瘤活性又大大不如單體，因此如何從兒茶素單體化合物中通過合理的、科學(xué)的組合，得到活性較高、成本較低的組合物的研究則未見報(bào)道，這方面的研究是對(duì)茶葉在醫(yī)藥上的應(yīng)用所迫切的課題。
細(xì)胞凋亡是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，尤其是在腫瘤藥物的篩選及機(jī)制研究方面為人們提供了新思路。茶多酚是茶葉中最具抗腫瘤的酚性化合物，盡管流行病學(xué)、體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了茶多酚的抗腫瘤活性，但仍有待深入研究，而幾種兒茶素單體組合在一起組成藥物組合物的實(shí)驗(yàn)則未見報(bào)道。
EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是皰疹病毒家族的一員。已證明EB病毒是一種DNA致癌病毒。EB病毒感染與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。在鼻咽癌患者的血清中VCA-IgA多為陽性，且其滴度改變與病情呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)鼻咽癌標(biāo)本中存在EB病毒基因。EB病毒的基因也高頻出現(xiàn)在Burkitt’s淋巴瘤RAJI細(xì)胞增生性疾病中。EB病毒基因組為雙鏈DNA，它包含17.2萬堿基對(duì)，包括其內(nèi)部重復(fù)序列(IR)和位于基因組兩端的末端重復(fù)序列(TR)以及獨(dú)特序列(U)。其中BNLF-1編碼的潛伏性膜蛋白(Latent Membrance Proteinl，LMP1)作為首先被證實(shí)具有瘤基因功能的基因，涉及到細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、凋亡及分化反應(yīng)，因而一直是病毒致癌機(jī)制甚為關(guān)注的領(lǐng)域。
目前研究表明LMP1以不同的作用機(jī)制參與了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，產(chǎn)生抗凋亡作用LMP1通過NFKB調(diào)控其下游靶基因的表達(dá)，在細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化與凋亡中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，因而在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制的研究中備受矚目。它可通過NFKB調(diào)節(jié)Survivin——NFKB介導(dǎo)信號(hào)通路中的效應(yīng)分子。Survivin是用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體EPR1(effector cell protease receptor 1，EPR1)cDNA在人類基因組文庫中篩選克隆出的細(xì)胞凋亡抑制基因。Caspases(半胱氨酸蛋白酶)是近年來發(fā)現(xiàn)的與細(xì)胞凋亡關(guān)系極為密切的一組蛋白酶。目前認(rèn)為Caspases是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者。正常情況下它是以無活性的酶原形式存在。在某些凋亡啟動(dòng)誘導(dǎo)因素的作用下，凋亡信號(hào)傳遞至Caspases并使其發(fā)生層層激活，即“瀑布式”激活，導(dǎo)致終末效應(yīng)——細(xì)胞凋亡。
人Survivin基因與EPR1基因的編碼區(qū)序列高度互補(bǔ)，位于染色體(17q25)的同一基因族。Survivin在正常成人組織中是一個(gè)“關(guān)閉”的基因，在腫瘤組織中被激發(fā)表達(dá)，而且它的過度表達(dá)與腫瘤的預(yù)后不良、復(fù)發(fā)以及多藥耐藥的形成密切相關(guān)，有望成為一個(gè)應(yīng)該說的腫瘤診斷標(biāo)志物。新近確定Survivin是IAPs(Inhibitor of apoptosisi proteins)成員之一，它存在于大多數(shù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和癌細(xì)胞中，通過直接Caspases抑制或Caspases酶原活化以及通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NFKB等抑制細(xì)胞凋亡。
實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道茶多酚對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，EGCG能明顯抑制人前列腺癌細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。茶多酚可使轉(zhuǎn)染了LMP1的人鼻咽癌細(xì)胞CNE1-LMP1分裂相細(xì)胞減少，細(xì)胞存活率顯著降低，且呈明顯的量效關(guān)系。用綠茶提取物處理鼻咽癌株，發(fā)現(xiàn)其對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II有顯著的抑制作用，出現(xiàn)了DNA的降解，即癌細(xì)胞凋亡的典型特征。茶多酚能通過抑制細(xì)胞周期素的表達(dá)和促使CDK抑制的表達(dá)，最終導(dǎo)致CDK活性降低，從而通過細(xì)胞周期素激酶抑制子-細(xì)胞周期素-細(xì)胞周期素依賴的激酶機(jī)制阻滯細(xì)胞周期，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究機(jī)制表明茶多酚作為天然產(chǎn)物中提取的抗癌有效成分對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有干預(yù)作用。而LMP1是EB病毒這種環(huán)境致癌因素編碼的蛋白，它通過多種信號(hào)傳到通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抗凋亡。研究中發(fā)現(xiàn)茶多酚能抑制與EB病毒相聯(lián)系的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，表明這種途經(jīng)可能是茶多酚抑制與EB病毒相關(guān)的腫瘤分子機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)EB病毒的LMP1可通過Survivin促增殖和抗凋亡。對(duì)Survivin的抗凋亡機(jī)制的研究，表明Survivin通過抑制凋亡事件中的主要執(zhí)行者Caspases-3而產(chǎn)生抗凋亡作用。在干預(yù)作用中國內(nèi)學(xué)者提出茶多酚通過誘導(dǎo)Caspases-3的活性上調(diào)，達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖的抗癌作用。
目前關(guān)于在細(xì)胞周期信息通路中，茶多酚或兒茶素干預(yù)Survivin與Caspases-3相互調(diào)控作用尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有兒茶素單體化合物在防治腫瘤上存在的問題，提供一種防治腫瘤效果好、活性高、成本低的茶葉活性單體藥物組合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述茶葉活性單體藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用具體技術(shù)方案是一種茶葉活性單體藥物組合物，由如下五種單體和重量份組成EGCG250～350ECG 250～350EGC 150～250EC 50～150TFG 0.5～1.0。
EGCG(英文名為(-)-epigallocatechin-3-gallaet；中文名為表沒食子兒茶素沒食子酸酯)、ECG(英文名為(-)-Epicatechin-3-gallate；中文名為表兒茶素沒食子酸酯)、EGC(英文名為(-)-Epigallocatechin；中文名為表沒食子ER兒茶素)、EC(英文名為(-)-Epicatechin；中文名為表兒茶素)、TFG(英文名為theaflavin gallate；中文名為茶黃素沒食子酸酯)。
本發(fā)明考察了活性單體經(jīng)組合后形成的藥物組合物體外抑制CNE2、RAJI、SUNE1細(xì)胞增殖的作用，觀察了藥物組合物對(duì)RAJI癌細(xì)胞形態(tài)上的改變、癌細(xì)胞凋亡反應(yīng)、癌細(xì)胞中Survivin和Caspase-3蛋白表達(dá)水平以及細(xì)胞周期阻滯作用，結(jié)果表明單體藥物組合物具有體外抗腫瘤作用，其作用能力比最強(qiáng)的單體要高得多，能抑制CNE2、RAJI、SUNE1細(xì)胞的生長(zhǎng)，致使癌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)上的改變，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，抑制癌細(xì)胞中Survivin蛋白水平的表達(dá)，使Caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)，從而使癌細(xì)胞RAJI出現(xiàn)周期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。表明藥物組合物具有預(yù)防、治療腫瘤的作用。
藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)表明，藥物組合物能抑制CNE2、Raji、SUNE1等癌細(xì)胞的增殖，并隨其濃度升高而逐漸增強(qiáng)，其IC50(mg/L)分別是4.17、4.45、4.79，比最強(qiáng)的單體EGCG的抑制能力強(qiáng)得多(EGCG對(duì)三種癌細(xì)胞的IC50(mg/L)分別是11.34、13.02、18.01)。
藥物組合物誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，藥物組合物可誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞胞核內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒熒光，產(chǎn)生新月型改變，固縮或片段化的核以及凋亡小體，其誘導(dǎo)凋亡的程度比EGCG強(qiáng)。TUNEL實(shí)驗(yàn)表明RAJI細(xì)胞凋亡的陽性反應(yīng)主要在凋亡細(xì)胞核，部分在細(xì)胞質(zhì)。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明組合物與EGCG一樣可誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞中Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)表明，藥物組合物能抑制細(xì)胞內(nèi)Survivin的陽性反應(yīng)，表達(dá)減少，其表達(dá)水平比EGCG的表達(dá)更低。而對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3顯強(qiáng)陽性反應(yīng)，表達(dá)增加，其表達(dá)水平比EGCG的表達(dá)更高。
上述的結(jié)果表明，由五種茶葉活性單體組合后的組合物能抑制CNE2、RAJI、SUNE1細(xì)胞增殖，改變RAJI癌細(xì)胞形態(tài)，使癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，癌細(xì)胞中Survivin表達(dá)下降，而Caspase-3表達(dá)升高，從而使癌細(xì)胞RAJI出現(xiàn)周期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。所以，本發(fā)明的藥物組合物可用于制備防治腫瘤的藥物。
本發(fā)明的茶葉活性單體藥物組合物在抗腫瘤中療效顯著。本發(fā)明的茶葉活性單體藥物組合物可以采用藥劑學(xué)上允許的任何劑型，包括口服劑型如片劑、膠囊、口服液等，也可以采用注射劑如輸液、粉針等，還可以采用外用劑型如軟膏等。當(dāng)采用口服劑型及外用劑型時(shí)，組合物可采用茶葉的水提物或醇提物的未經(jīng)純化的混合提取物的方式，但其組合的份量是在上述范圍內(nèi)。本發(fā)明的藥物組合物可以與其他防治腫瘤的藥物制成復(fù)方制劑。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1、五種兒茶素單體的組合，使得抗腫瘤活性大大增強(qiáng)。
2、由于具有抗腫瘤活性的兒茶素單體的成本昂貴，五種單體的組合降低了藥物的成本。
3、該藥物組合物來自于植物，副作用小。
4、制備工藝簡(jiǎn)單。


圖1為RAJI細(xì)胞對(duì)照組48小時(shí)后，DAPI熒光染色，在400倍熒光顯微鏡下的照片；圖2為4.0mg/L藥物組合物處理RAJI細(xì)胞48小時(shí)后，DAPI熒光染色，在400倍熒光顯微鏡下的照片；圖3為4.0mg/L EGCG處理48小時(shí)RAJI細(xì)胞后，DAPI熒光染色，在400倍熒光顯微鏡下的照片；圖4為RAJI對(duì)照組48小時(shí)TUNEL，在400倍熒光顯微鏡下的照片；圖5為4.0mg/L藥物組合物處理48小時(shí)后誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡(TUNEL)，在400倍熒光顯微鏡下的照片；圖6為4.0mg/LEGCG處理48小時(shí)后誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡(TUNEL)，在400倍熒光顯微鏡下的照片；圖7為EGCG和藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞株周期的影響圖(FCM)；圖8為RAJI48小時(shí)對(duì)照組，免疫組化法檢測(cè)組細(xì)胞核和核周胞質(zhì)，在400倍顯微鏡下的照片；圖9為RAJI經(jīng)4.0mg/L藥物組合物處理48小時(shí)后，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞核和核周胞質(zhì)，在400倍顯微鏡下的照片；圖10為RAJI經(jīng)4.0mg/L EGCG處理48小時(shí)后，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞核和核周胞質(zhì)，在400倍顯微鏡下的照片；圖11為RAJI對(duì)照組48小時(shí)，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)，在400倍顯微鏡下的照片；圖12為RAJI經(jīng)4.0mg/L藥物組合物處理48小時(shí)后，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)，在400倍顯微鏡下的照片；圖13為RAJI經(jīng)4.0mg/L EGCG處理48小時(shí)后，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)，在400倍顯微鏡下的照片；其中，在圖7中，A、B、C分別為未經(jīng)處理、經(jīng)EGCG、藥物組合物處理RAJI24小時(shí)后的細(xì)胞周期；D、E、F分別為未經(jīng)處理、經(jīng)EGCG、藥物組合物處理RAJI72小時(shí)后的細(xì)胞周期；COMPLEX為藥物組合物。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 藥物組合物的制備取EGCG 260克，ECG 280克，EGC 150克，EC 60克，TFG 0.5克，混合均勻，磨碎即可得到藥物組合物。
實(shí)施例2 藥物組合物的制備取EGCG 350克，ECG 320克，EGC 150克，EC 100克，TFG 1.0克，混合均勻，磨碎即可得到藥物組合物。
實(shí)施例3 藥物組合物的制備取EGCG 300克，ECG 350克，EGC 250克，EC 150克，TFG 0.8克，混合均勻，磨碎即可得到藥物組合物。
實(shí)施例4 藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制作用細(xì)胞株與培養(yǎng)細(xì)胞株人Burkitt’s淋巴瘤RAJI、人低分化鼻咽癌SUNE1和人鼻咽癌CNE2細(xì)胞株由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供，RAJI可表達(dá)EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1。
細(xì)胞培養(yǎng)各細(xì)胞株接種于含10％小牛血清(Gibco，經(jīng)56℃，30min滅活)，100U·ml-1青霉素及100μg·ml-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37℃含5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代。實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞均是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。
MTT法測(cè)定腫瘤細(xì)胞存活率將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞稀釋成1×105cells·ml-1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.2ml，同時(shí)分別加入2.0mg/L，4.0mg/L，8.0mg/L，16.0mg/L，32.0mg/L濃度梯度的試驗(yàn)樣品處理，每濃度平行6孔，同時(shí)設(shè)0.1％DMSO溶劑對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組置37℃，5％CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。實(shí)驗(yàn)終止前4h每孔加入MTT磷酸緩沖液(MTT濃度為5mg·ml-1)10μl。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入100μl DMSO(二甲基亞砜)，振蕩10min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解。用550Model酶標(biāo)儀，以570nm為實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)，450nm為參考波長(zhǎng)測(cè)定其吸收度，按下式計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率并計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50。腫瘤細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)孔測(cè)定值/對(duì)照孔測(cè)定值×100％；腫瘤細(xì)胞抑制率＝1-腫瘤細(xì)胞存活率。再按Bliss公式計(jì)算(BIO-RAD model 500所帶軟件)程序求出半數(shù)抑制濃度IC50。
藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制結(jié)果經(jīng)不同濃度的藥物組合物作用后，CNE2、RAJI、SUNE1細(xì)胞的抑制率見表1(表2為EGCG的作用結(jié)果)。表中的結(jié)果表明3種細(xì)胞抑制率隨組合物濃度升高而逐漸增強(qiáng)，并以濃度依賴性關(guān)系抑制癌細(xì)胞增殖。由這些結(jié)果可計(jì)算其半數(shù)抑制濃度IC50見表1。
藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用是CNE2＞RAJI＞SUNE1，表明它對(duì)不同的癌細(xì)胞的抑制效果是不相同的，但比較接近。而EGCG對(duì)3種癌細(xì)胞的抑制率則相差較大；藥物組合物對(duì)癌細(xì)胞的抑制能力比最強(qiáng)的單體EGCG大得多。
結(jié)論藥物組合物能抑制癌細(xì)胞的增殖，其抑制能力比EGCG強(qiáng)。
表1、藥物組合物對(duì)CNE2、RAJI、SUNE1細(xì)胞增殖的抑制率

注表中的數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值，±后標(biāo)出的數(shù)據(jù)均表示標(biāo)準(zhǔn)誤(S.E)表2、EGCG對(duì)CNE2、RAJI、SUNE1細(xì)胞增殖的抑制率


注表中的數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)的平均值，±后標(biāo)出的數(shù)據(jù)均表示標(biāo)準(zhǔn)誤(S.E)實(shí)施例5 藥物組合物誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變DAPI熒光染色實(shí)驗(yàn)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，稀釋成1×104個(gè)細(xì)胞·ml-1接種于6孔板上培養(yǎng)，設(shè)0.1％DMSO溶劑對(duì)照組和4.0mg/LEGCG及藥物組合物。處理組，48小時(shí)后，收集細(xì)胞，用DAPI-甲醇工作液(1μg·ml-1)洗滌1次，再用DAPI-甲醇工作液(1μg·ml-1)重懸并37℃孵育15分鐘，離心收集細(xì)胞，棄去染色液，甲醇洗滌，PBS重懸，置于熒光顯微鏡下觀察。
DAPI熒光染色結(jié)果DAPI熒光染料結(jié)果顯示，經(jīng)EGCG及藥物組合物處理的RAJI細(xì)胞胞核內(nèi)可見濃染致密的顆粒熒光，典型細(xì)胞可見新月型改變，固縮或片段化的核以及凋亡小體(圖2，3)。未經(jīng)處理的細(xì)胞胞核呈彌散均勻的、較弱的熒光(圖1)。EGCG及藥物組合物誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變是相似的，但誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡的程度藥物組合物(圖2)比EGCG(圖3)強(qiáng)。
結(jié)論藥物組合物可誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞胞核內(nèi)出現(xiàn)濃染致密的顆粒熒光，產(chǎn)生新月型改變，固縮或片段化的核以及凋亡小體，其誘導(dǎo)凋亡的程度比EGCG強(qiáng)。實(shí)施例6藥物組合物誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞凋亡的反應(yīng)原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞實(shí)驗(yàn)收集48小時(shí)經(jīng)0.1％DMSO溶劑對(duì)照組和4.0mg/LEGCG及藥物組合物處理組的RAJI細(xì)胞，采用Cytospin細(xì)胞甩片后，經(jīng)4％的多聚甲醛固定40分鐘，采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，按說明書操作。普通光鏡觀察、照相。
凋亡細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果RAJI細(xì)胞經(jīng)4.0mg/L EGCG處理48小時(shí)，TUNEL陽性的棕褐色反應(yīng)主要在凋亡細(xì)胞核，部分在細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核內(nèi)可見有TUNEL陽性的棕褐色顆粒點(diǎn)狀不均勻染色質(zhì)濃聚，染色質(zhì)邊集以及固縮，可見凋亡小體(圖6)。RAJI細(xì)胞組合物處理48小時(shí)，TUNEL陽性的棕褐色反應(yīng)與EGCG一樣，也是主要在凋亡細(xì)胞核，部分在細(xì)胞質(zhì)。圖5顯示細(xì)胞核內(nèi)也可見有TUNEL陽性的棕褐色顆粒點(diǎn)狀不均勻染色質(zhì)濃聚，染色質(zhì)邊集以及固縮，可見凋亡小體，細(xì)胞凋亡比EGCG要多。RAJI對(duì)照組，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，可見少量散在的TUNEL陽性棕褐色顆粒(圖4)。
結(jié)論TUNEL實(shí)驗(yàn)表明RAJI細(xì)胞凋亡的陽性反應(yīng)主要在凋亡細(xì)胞核，部分在細(xì)胞質(zhì)。
實(shí)施例7 藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞周期阻滯的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)收集0.1％DMSO溶劑對(duì)照組和4.0mg/LEGCG及藥物組合物分別在24小時(shí)和72小時(shí)處理后的RAJI細(xì)胞，PBS洗滌兩次。加入0.5mlPBS制成單細(xì)胞懸液和體積分?jǐn)?shù)為70％冷乙醇3ml固定，4℃冰箱過夜后，取1×106已固定的細(xì)胞，用PBS洗兩遍，去上清后加入300μl DNA染液(內(nèi)含碘化丙啶(PD100μg·ml-1和RNA酶20U·ml-1)，室溫30分鐘。上機(jī)分析檢測(cè)其細(xì)胞周期。
流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)4.0mg/L的EGCG和藥物組合物處理RAJI 24和72小時(shí)后檢測(cè)其細(xì)胞周期，得圖7，將圖中的相關(guān)數(shù)據(jù)整理得表3。圖7和表3的結(jié)果表明EGCG處理RAJI后，與對(duì)照組細(xì)胞比較G0/G1期從34.7％增加到50.5％，S期從44.4％下降到37.9％，處理72小時(shí)后，G0/G1期從50.5％增加到56.5％。故流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期表明EGCG可誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，RAJI細(xì)胞周期阻滯24小時(shí)已較明顯。在4.0mg/L藥物組合物處理RAJI 24小時(shí)后，與對(duì)照組比較G0/G1期從34.7％增加到59.4％，S期從44.4％下降到27.3％，處理72小時(shí)后發(fā)生更明顯的變化，G0/G1期從59.4％增加到70.1％。經(jīng)藥物組合物處理后，RAJI細(xì)胞周期阻滯24小時(shí)比EGCG更明顯。因此，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期表明EGCG和藥物組合物均可誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。
表3、EGCG和藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞株周期影響的結(jié)果

結(jié)論流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)表明藥物組合物與EGCG一樣可誘導(dǎo)RAJI細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，但藥物組合物的效果更明顯。
實(shí)施例8 藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞中Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)觀察Survivin、Caspase-3蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)分別取經(jīng)4.0mg/LEOCG及藥物組合物處理48h和0.1％DMSO溶劑對(duì)照組48h的RAJI細(xì)胞，用Cytospin細(xì)胞甩片后中性福爾馬林固定15分鐘，PBS洗(3min×3)，3％H2O2室溫孵育3分鐘，PBS洗(5min×2)，滴加正常山羊血清封閉孵育10min(室溫)，滴加兔抗人Survivin/Caspase-3多克隆抗體(1∶100)孵育過夜(4℃)，PBS洗(3min×3)，滴加二抗山羊抗小鼠IgG抗體一生物素多聚體孵育30min(37℃)，PBS洗(3min×3)，滴加鏈霉卵白素-HRP多聚體孵育30min(37℃)，PBS洗(3min×3)，滴加新鮮配制的DAB 10min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染1min，自來水沖洗，樹脂封片，普通光鏡觀察、照相。每份樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，同時(shí)用正常山羊血清取代第一抗體，作為陰性對(duì)照。光鏡下觀察結(jié)果，以鏡下所見胞膜或胞漿出現(xiàn)棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞，觀察指標(biāo)定位Survivin定位于細(xì)胞核、核周胞質(zhì)內(nèi)；Caspase-3定位于細(xì)胞漿內(nèi)；定性出現(xiàn)深棕褐色顆粒，為強(qiáng)陽性；出現(xiàn)棕褐色顆粒，為中等陽性；出現(xiàn)淡褐色顆粒，為弱陽性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖8-10分別是經(jīng)4.0mg/LEGCG及藥物組合物處理48h和0.1％DMSO溶劑對(duì)照組48h的RAJI細(xì)胞，用免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞核和核周胞質(zhì)內(nèi)Survivin所得到的圖片。圖中顯示，與對(duì)照組(圖8)比較，用藥物組合物處理過的RAJI實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)Survivin顯弱陽性反應(yīng)，表達(dá)減少(圖9)；對(duì)照組Survivin表達(dá)較高，細(xì)胞內(nèi)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)(圖8)；用EGCG處理過的RAJI實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)Survivin也顯弱陽性反應(yīng)，表達(dá)也減少(圖10)。這些結(jié)果表明EGCG和組合物對(duì)RAJI細(xì)胞中的Survivin表達(dá)水平減少，藥物組合物的表達(dá)水平比EGCG的表達(dá)更低。
圖11～13經(jīng)免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞漿內(nèi)Caspase-3所得到的圖片。圖中顯示，對(duì)照組細(xì)胞漿內(nèi)Caspase-3表達(dá)減少(圖11)，用組合物處理過的RAJI實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿內(nèi)Caspase-3顯強(qiáng)陽性反應(yīng)，表達(dá)增加(圖12)；用EGCG處理過的RAJI實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞漿內(nèi)Caspase-3則呈中等陽性反應(yīng)，表達(dá)有所增加(圖13)。這些結(jié)果表明EGCG和藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞漿內(nèi)Caspase-3表達(dá)水平上升，藥物組合物的表達(dá)水平高于EGCG。
結(jié)論藥物組合物對(duì)RAJI細(xì)胞中Survivin、Caspase-3表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)表明，藥物組合物能抑制細(xì)胞內(nèi)Survivin的陽性反應(yīng)，表達(dá)減少，其表達(dá)水平比EGCG的表達(dá)更低。而對(duì)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3顯強(qiáng)陽性反應(yīng)，表達(dá)增加，其表達(dá)水平比EGCG的表達(dá)更高。
權(quán)利要求
1.一種茶葉活性單體藥物組合物，其特征在于由如下組分和重量份組成EGCG250～350ECG 250～350EGC 150～250EC 50～150TFG 0.5～1.0。
2.權(quán)利要求1所述茶葉活性單體藥物組合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物組合物在制備抗淋巴瘤或鼻咽癌藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物組合物在制備抗淋巴瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種茶葉活性單體組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有兒茶素單體在抗腫瘤上療效顯著但價(jià)格昂貴的問題，提供一種茶葉活性單體組合物，其由如下單體和重量份組成EGCG 250～350，ECG250～350，EGC 150～250，EC 50～150，TFG 0.5～1.0。本發(fā)明藥物組合物的抗腫瘤活性比單體好，成本大大降低，副作用小，制備工藝簡(jiǎn)單，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61K36/185GK1732917SQ20051003686
公開日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者羅一帆, 許旋 申請(qǐng)人:華南師范大學(xué)