專利名稱：人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑是一種Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑，存在于哺乳動(dòng)物的消化系統(tǒng)。胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑是一種由胰腺腺泡細(xì)胞合成，并和各種淀粉酶，脂肪酶，蛋白水解酶等一起分泌到膽汁。
胰腺分泌的蛋白水解酶有很大一部分是內(nèi)源性蛋白水解酶，包括胰蛋白酶，糜蛋白酶，彈性蛋白酶等。這些蛋白水解酶可以水解蛋白之間的肽鍵，也會(huì)導(dǎo)致胰腺自身的損傷。體內(nèi)有幾種方式確保蛋白水解酶在一定的情況下以失活的狀態(tài)存在以免造成自體損傷以蛋白酶原形式存在于胰腺的導(dǎo)管當(dāng)中；以酶原顆粒的方式包裝起來；分泌蛋白酶抑制劑抑制小部分被激活的蛋白酶原。
胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑是一多功能抑制劑，能夠有效抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶、溶血纖維蛋白酶及各種組織或血漿激肽釋放酶等多種蛋白水解酶的活性，減少溶酶體酶釋放，改善循環(huán)狀況和組織灌注，抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生和釋放。
人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑在治療急性胰腺炎，燒傷后的休克及產(chǎn)后大出血等疾病，有獨(dú)特的療效；是治療上述疾病最適合的胰蛋白酶抑制劑藥物人源性蛋白，不會(huì)產(chǎn)生免疫原反應(yīng)被機(jī)體的免疫系統(tǒng)清除，可延長藥物的效應(yīng)；作為一種小分子蛋白(分子量只有6.2KD)，能通過腎小球?yàn)V過膜，因此可高效抑制釋放到外周體液的蛋白水解酶。
天然的人源性胰蛋白酶抑制劑需要從人的膽汁中分離提取，純化步驟繁瑣，材料來源極少，難以大量獲取?；蛑亟M技術(shù)可以提供一個(gè)大量獲得重組人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的方法。通過基因重組技術(shù)獲得的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，具有和天然人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑相同的氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)，相當(dāng)?shù)囊种埔鹊鞍酌傅幕钚?，可具同樣的治療效果?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用基因工程技術(shù)制備重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，以克服從人體組織中提取，成本高且來源少等缺點(diǎn)。
本發(fā)明采用真核分泌表達(dá)的方法來制備重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，包括(1)具有工程菌密碼子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因的合成以及表達(dá)載體的構(gòu)建；(2)工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵；(3)重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的制備與純化。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到(1)具有畢赤酵母工程菌密碼子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑全基因序列的合成以及表達(dá)載體的構(gòu)建的具體方法如下按畢赤酵母密碼子偏好性化學(xué)合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因，其核苷酸序列為5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAACGGTTGTACCAAAATTTATGATCCAGTTTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAGACCTCTATTCTGATTCAGAAATCTGGTCCATGT-3’(2)設(shè)計(jì)引物，以所合成的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將所獲得的編碼人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因克隆在質(zhì)粒中，進(jìn)行DNA序列測(cè)序分析與所設(shè)計(jì)的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因序列完全相符；(4)經(jīng)序列分析后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因克隆到商業(yè)化表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化甲醇酵母菌株KM71；(5)對(duì)甲醇酵母菌株KM71進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
上清中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過層析柱等分離純化，最終獲得具有人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑生物活性的重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑產(chǎn)物。該重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑具有生物活性，該重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑能夠有效抑制胰蛋白酶的活性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1.對(duì)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑在真核細(xì)胞甲醇酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)，簡化后繼的純化步驟。
2.采用離子交換層析和分子篩層析方法進(jìn)行純化人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，比其他所報(bào)道的親和層析更簡單，成本更低。
3.經(jīng)高密度發(fā)酵表達(dá)后可獲得高達(dá)0.9g/L的高表達(dá)量，比以往報(bào)道的重組表達(dá)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的表達(dá)量高18倍。


圖1為人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因的PCR電泳結(jié)果。
M100bp DNAmarker；1，2陰性對(duì)照；3，4PCR目的條帶。
圖2為含人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因的pPIC9K-rHuPSTI表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定圖。
1100bp DNA marker；2pPIC9K-rHuPSTI Xho I/Not I雙酶切。
圖3為pPIC9K-rHuPSTI表達(dá)質(zhì)粒酶切線性化電泳圖。
1wide range marker；2線性化后的pPIC9K-rHuPSTI表達(dá)質(zhì)粒；3環(huán)狀的pPIC9K-rHuPSTI質(zhì)粒。
圖4是重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑發(fā)酵上清表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析圖譜。
1發(fā)酵上清；2G25分子篩穿過峰；3QXL陰離子層析柱穿過峰；4QXL陰離子層析柱洗脫峰；5分子篩分離的目的蛋白。
圖5為含基因rHuPSTI的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-rHuPSTI構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的制備作詳細(xì)描述實(shí)施例1重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-rHuPSTI的構(gòu)建1.試劑與材料載體質(zhì)粒pPICZαA和pPIC9K購自Invitrogen公司；表達(dá)菌株KM71購自Invitrogen公司，重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因由上海博亞生物技術(shù)公司合成；限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自New England公司，PCR引物由上海博亞生物技術(shù)公司合成，膠回收試劑盒購自O(shè)mega生物技術(shù)公司。
2.方法(1)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因的合成I.引物合成由于該基因核苷酸序列較長，直接合成目的基因較難，因此經(jīng)過從技術(shù)上以及經(jīng)濟(jì)上的考慮后，通過合成四段引物經(jīng)過PCR的方法擴(kuò)增出全長的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因。
1.5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAA-3’2.5’-TGTTACCATCGGTACCACAAACTGGATCATAAATTTTGGTACAACCGTTCAGTTCGTTATAACATTT-3’3.5’-TTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAG-3’4.5’-ACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAATAGAGGTCTGACGTTTACGGTTTTCAA-3’II.PCR擴(kuò)增取上述四段引物各50pmol混合于同一管PCR反應(yīng)體系中，再分別加入5ul 10×的PCR緩沖液，4ul 2.5mM dNTP以及0.25U Taq酶，并用H2O定容到50ul。通過PCR擴(kuò)增獲得改造后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因。PCR擴(kuò)增的條件為 PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在200bp附近出現(xiàn)預(yù)期的特異性擴(kuò)增帶(見圖1)，回收此帶，獲得改造所得的改造后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因全長。
(2)寡核苷酸引物上游引物5’-AAACTAGAGAAAGAGAGGCTGAAGCTGATTCTCTGGGTCGTGAAGC-3’下游引物5’-TTTGCGGCCGCTTAACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAA-3’上游引物內(nèi)含Xho I酶切位點(diǎn)(單下劃線)、pPICZαA載體上部分序列(雙下劃線)，下游引物內(nèi)含NotI(單下劃線)酶切位點(diǎn)和強(qiáng)終止子(雙下劃線)。
(3)PCR擴(kuò)增以(1)中所獲得的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因?yàn)槟０?，取上游引物和下游引物然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為94℃變性5分鐘，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸60秒，共30個(gè)循環(huán)，再在72℃延伸10分鐘。
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收。
(4)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因克隆質(zhì)粒(pPIC9K-rHuPSTI)的構(gòu)建回收的電泳產(chǎn)物經(jīng)過核酸內(nèi)切酶Xho I和Not I的酶切，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以Xho I/Not I的組合克隆到pPICZαA質(zhì)粒上構(gòu)建成pPICZαA-rHuPSTI克隆載體更換酶切窗口，然后以Sac I/Not I的組合克隆到表達(dá)載體克隆到載體pPIC9K上，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-rHuPSTI(其構(gòu)建過程如圖5所示)。pPIC9K-rHuPSTI經(jīng)Xho I/Not I進(jìn)行雙酶切鑒定(酶切結(jié)果見圖2)。克隆載體pPiCZαA-rHuPSTI和表達(dá)載體pPIC9K-rHuPSTI中的外源基因經(jīng)測(cè)序鑒定正確，與原來設(shè)計(jì)的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因完全相符。
(5)工程菌的建立用Sac I單酶切人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因克隆質(zhì)粒(pPIC9K-rHuPSTI)，使質(zhì)粒線性化(見圖3)，按照Invitrogen操作手冊(cè)，將上述線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化KM71畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞。在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基MD瓊脂糖平板上挑取單菌落，接種于100mlBMGY培養(yǎng)基，在30℃以280rpm轉(zhuǎn)速振搖24個(gè)小時(shí)，使酵母菌的菌密度OD600＝5左右。在室溫以5000g離心5分鐘，去上清，用20ml BMMY培養(yǎng)基稀釋菌體，每隔24小時(shí)加入甲醇至終濃度為1％以誘導(dǎo)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的分泌表達(dá)，比較個(gè)菌株的表達(dá)率。選取最高表達(dá)量的菌株作為后繼實(shí)驗(yàn)的種子工程菌KM71(pPIC9K-HuPSTI)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例2畢赤酵母工程菌KM71(pPIC9K-HuPSTI)的發(fā)酵1.工程菌工程菌KM71(pPIC9K-HuPSTI)；2.培養(yǎng)基一級(jí)種子菌活化用YPD培養(yǎng)基(g/L)蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g二級(jí)種子菌活化用MGY培養(yǎng)基(g/L)硫酸銨10g，YNB3.4g，甘油10g，生物素4×10-4g；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NH4)2SO420g/L，glycerol 40g/L，KH2PO4 12g/L，CaSO4·2H2O 1g/L，Histidine 0.4g/L。
微量元素PTM1CuSO4.5H2O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MgSO4·H2O 3.0g/L，ZnC12 20.0g/L，HBO4 0.02g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 65g/L，CoCl2 0.5g/L，Biotin0.2g/L，NaMnO4·2H2O 0.2g/L，H2SO4 4ml/L。
誘導(dǎo)碳源50％甲醇+25％甘油(每升含12ml PTM1)3.種子菌的活化取在-70℃、20％甘油中保藏的工程菌株劃板(YPD板)，30℃培養(yǎng)約2天，從YPD平板上挑取單菌落接種于20ml YPD培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)20小時(shí)；以1∶10的比例將菌液接種于400ml MGY培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)過夜至OD600達(dá)5.0左右，作為接種發(fā)酵罐的種子菌。
4.高密度發(fā)酵培養(yǎng)7L發(fā)酵罐中加入4L發(fā)酵用培養(yǎng)基，121℃滅菌20分鐘，調(diào)節(jié)溫度至30℃，用氨水調(diào)節(jié)pH至5.0，加入PTM113ml(4.35ml/L)和1ml消泡劑，接入種子菌(1∶10)。發(fā)酵過程中溫度控制在30℃，通氣量維持在2vvm以上，轉(zhuǎn)速控制在300-800rpm之間，維持溶氧在20％以上。
發(fā)酵分為三個(gè)階段生長期，從加入種子菌，培養(yǎng)約16-24小時(shí)，直到將培養(yǎng)基中的甘油耗盡，表現(xiàn)為溶氧長時(shí)間在低水平濃度，突然上升到80％或以上。之后進(jìn)入甘油促生長期，通過提高發(fā)酵罐內(nèi)菌密度來增加目的蛋白的表達(dá)量補(bǔ)加50％甘油(含有PTM1，12ml/L)，補(bǔ)料速度為18ml/L·h，持續(xù)4-6小時(shí)。最后進(jìn)入誘導(dǎo)期，用氨水或磷酸調(diào)節(jié)pH至所需值，流加甲醇和甘油混合誘導(dǎo)碳源進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)碳源的流加速度從1ml/L·h經(jīng)10小時(shí)線性上升至6ml/L·h，持續(xù)96小時(shí)，期間如果溶氧低于20％就通過增加通氣量和轉(zhuǎn)速來提高罐內(nèi)培養(yǎng)基的溶氧濃度或者暫停補(bǔ)料來維持溶氧在20％以上的水平。
由于畢赤酵母生長會(huì)產(chǎn)酸性代謝物，在發(fā)酵過程中，用發(fā)酵罐系統(tǒng)泵自動(dòng)補(bǔ)入37％氨水，調(diào)節(jié)罐內(nèi)pH值，及時(shí)補(bǔ)充消泡劑。并每隔24小時(shí)取樣測(cè)定OD600及菌體濕重，同時(shí)將發(fā)酵上清進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)狀況。
5.發(fā)酵液收集4℃，8000rpm離心15min棄菌體，收集上清。
實(shí)施例3重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑制備與純化用甲醇誘導(dǎo)人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑分泌表達(dá)96小時(shí)后，在4℃以8000rpm離心15分鐘收集上清液，取上清液上Sepherdex G-25分子篩(用56mMTris-HCl pH9.0緩沖液預(yù)先平衡)，收集穿過紫外蛋白峰，取樣15％SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)過脫鹽和換緩沖液的蛋白溶液上樣至Q Sepharose XL層析柱(用56mM Tris-HCl pH9.0緩沖液預(yù)先平衡)，用平衡緩沖液洗脫紫外至基線后，收集穿過紫外蛋白峰，取樣15％SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果。然后用緩沖液56mMTris.HCl，40mM KCl，pH9.0一步洗脫，收集蛋白洗脫峰，取樣15％SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果。把Q Sepharose XL洗脫峰上樣至Sepherdex G-50分子篩(用50mMNH4HCO3緩沖液預(yù)先平衡)收集目的蛋白組分，冷凍干燥并取樣15％SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果，獲得的凍干粉可在-20℃冷凍干燥保存實(shí)施例4重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的性質(zhì)分析主要參照Norihisa Kikuchi等(1987)測(cè)定胰分泌型蛋白酶抑制劑活性的方法。該方法主要以BAPNA作為胰蛋白酶(Trypsin)的底物，隨著酶促反應(yīng)的發(fā)生，底物BAPNA會(huì)釋放出顯色基團(tuán)，其顯色基團(tuán)在405nm處的光吸收會(huì)發(fā)生變化，通過測(cè)定光吸收值，可以測(cè)定胰蛋白酶(Trypsin)的活性。根據(jù)該方法測(cè)得1mg的重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑可以抑制3.4-3.8mg的牛胰蛋白酶(Trypsinfrom bovine pancreas，6630U/mg，Sigma)，與理論上的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的抑制效價(jià)相一致。
參考文獻(xiàn)Norihisa Kikuchi.et al.Production of Recombinant Human Pancreatic Secretory TrypsinInhibitor by Escherchia coli.Journal of Biochemistry.1987，102607-612；
權(quán)利要求
1.人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，包括以下步驟(1)按畢赤酵母密碼子偏好性化學(xué)合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因，其核苷酸序列為5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAACGGTTGTACCAAAATTTATGATCCAGTTTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAGACCTCTATTCTGATTCAGAAATCTGGTCCATGT-3’；(2)設(shè)計(jì)引物，以所合成的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因?yàn)槟０澹M(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)將所獲得的編碼人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因克隆在質(zhì)粒中，進(jìn)行DNA序列測(cè)序分析與所設(shè)計(jì)的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因序列完全相符；(4)經(jīng)序列分析后的人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因克隆到商業(yè)化表達(dá)載體pPIC9K，轉(zhuǎn)化甲醇酵母菌株KM71；(5)對(duì)甲醇酵母菌株KM71進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。
2.按權(quán)利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(1)畢赤酵母密碼子偏好性化學(xué)合成人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因的化學(xué)合成是通過以下合成的4段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得(a)5’-GATTCTCTGGGTCGTGAAGCCAAATGTTATAACGAACTGAA-3’；(b)5’-TGTTACCATCGGTACCACAAACTGGATCATAAATTTTGGTACAACCGTTCAGTTCGTTATAACATTT-3’；(c)5’-TTGTGGTACCGATGGTAACACCTATCCAAACGAATGTGTTCTGTGTTTTGAAAACCGTAAACGTCAG-3’；(d)5’-ACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAATAGAGGTCTGACGTTTACGGTTTTCAA-3’。
3.按權(quán)利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(2)以內(nèi)含有Xho I酶切位、pPICZαA載體上部分序列的上游引物5’-AAACTAGAGAAAGAGAGGCTGAAGCTGATTCTCTGGGTCGTGAAGC-3’以及內(nèi)含Not I酶切位點(diǎn)和強(qiáng)終止子的下游引物5’TTTGCGGCCGCTTAACATGGACCAGATTTCTGAATCAGAA-3’進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
4.按權(quán)利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于在步驟(3)中，把步驟(2)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先以Xho I/Not I的組合克隆到pPICZαA質(zhì)粒上構(gòu)建成pPICZαA-rHuPSTI克隆載體更換酶切窗口，然后以Sac I/Not I的組合克隆到表達(dá)載體克隆到載體pPIC9K上，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-rHuPSTI。
5.按權(quán)利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(5)采用發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基如下基礎(chǔ)培養(yǎng)基(NH4)2SO420g/L，glycerol 40g/L，KH2PO4 12g/L，CaSO4·2H2O 1g/L，Histidine 0.4g/L；微量元素PTM1CuSO4·5H2O 6.0g/L，NaI 0.08g/L，MgSO4·H2O 3.0g/L，ZnCl2 20.0g/L，HBO4 0.02g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 65g/L，CoCl2 0.5g/L，Biotin0.2g/L，NaMnO4·2H2O 0.2g/L，H2SO4 4ml/L；誘導(dǎo)碳源50％甲醇+25％甘油(每升含12ml PTM1)。
6.按權(quán)利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(5)的培養(yǎng)基的溶氧在20％以上。
7.按權(quán)利要求1所述的人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法，其特征在于進(jìn)一步包括步驟(6)以對(duì)步驟(5)甲醇酵母菌株KM71進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后的上清中的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過層析柱等分離純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了人源性胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的基因工程生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用真核分泌表達(dá)的方法來制備重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，包括(1)具有工程菌密碼子偏好性人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑基因的合成以及表達(dá)載體的構(gòu)建；(2)工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵；(3)重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑的制備與純化。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)制備重組人胰腺分泌型胰蛋白酶抑制劑，克服了從人體組織中提取，成本高且來源少等缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P1/00GK1806847SQ200510036959
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者徐安龍, 任宇鋒, 賴春娥, 區(qū)景行, 王磊 申請(qǐng)人:中山大學(xué)