專(zhuān)利名稱(chēng)：醌類(lèi)化合物及其制備方法與抗腫瘤應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物化合物領(lǐng)域，具體涉及一類(lèi)源于真菌的具有抗腫瘤活性的醌類(lèi)化合物及其制備方法，以及它們?cè)谥苽淇鼓[瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自從1929年從真菌中發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，真菌的代謝產(chǎn)物成為了藥物的豐富來(lái)源，絕大多數(shù)臨床應(yīng)用的抗生素都來(lái)源于真菌和細(xì)菌，真菌的代謝產(chǎn)物還有其他的藥用價(jià)值，如抗腫瘤，治療心血管疾病，免疫調(diào)節(jié)劑等。由于海洋環(huán)境的特殊性，海洋微生物種類(lèi)繁多，來(lái)源廣泛，篩選獲得率高，根據(jù)John教授在2005年《Natural Product Reports》的報(bào)道，2003年發(fā)現(xiàn)海洋天然產(chǎn)物新化合物中，海洋微生物是主要來(lái)源之一(另外包括海綿和腔腸動(dòng)物)。海洋真菌能提供陸生真菌無(wú)法提供的代謝產(chǎn)物。
植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)生活在高等植物的組織中，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，在進(jìn)化過(guò)程中與宿主建立了和諧的共生關(guān)系，據(jù)保守的估計(jì)內(nèi)生真菌的種類(lèi)繁多，大約有1.5×106種，由于數(shù)量龐大，而且與其他生物之間緊密的生態(tài)關(guān)系，使這類(lèi)真菌成為潛在的具有產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物的來(lái)源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一類(lèi)新的來(lái)源于海洋真菌的具有潛在藥用價(jià)值的醌類(lèi)化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述醌類(lèi)化合物的制備方法。
本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供上述醌類(lèi)化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
發(fā)明人由南海海洋真菌Halorosellinia sp.1403(以下簡(jiǎn)稱(chēng)真菌1403)的發(fā)酵培養(yǎng)物中提取分離得到三種結(jié)構(gòu)相似的化合物，該三種化合物的結(jié)構(gòu)分別如下列式E、式F、式G和所示(以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)為化合物E、F和G)
本發(fā)明所用的真菌1403已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國(guó)武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCC NOM201018，保藏日為2001年4月23日。
本發(fā)明化合物E、F和G可從真菌1403的發(fā)酵培養(yǎng)液中提取分離得到，制備方法的具體步驟如下a.真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養(yǎng)5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5-15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25～35℃靜置1～2個(gè)月；
c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體；d.真菌#1403培養(yǎng)液過(guò)濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液濃縮，將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；e.培養(yǎng)液浸膏經(jīng)過(guò)柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經(jīng)過(guò)多次柱層析并重結(jié)晶，濃縮得紅色物質(zhì)，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經(jīng)薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結(jié)晶，即得到F。收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復(fù)薄層層析和柱層析，不斷重結(jié)晶得到化合物G。
本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)證明，化合物E、F和G均能有效抑制腫瘤細(xì)胞株的生長(zhǎng)，可用于制備抗腫瘤藥物，可以是藥物上可接受的任意一種劑型。
與現(xiàn)有抗腫瘤藥物相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明的醌類(lèi)化合物來(lái)源于海洋真菌，海洋真菌種類(lèi)繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡(jiǎn)單，使得醌類(lèi)化合物來(lái)源豐富、成本低廉；醌類(lèi)化合物抗腫瘤活性高，應(yīng)用前景廣闊。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 化合物E、F與G的分離制備方法a.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養(yǎng)5～7天；b.真菌Halorosellinia sp.1403CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫25～35℃靜置1～2個(gè)月；c.將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體；d.真菌#1403培養(yǎng)液過(guò)濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液濃縮，將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫。
e.培養(yǎng)液浸膏經(jīng)過(guò)柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經(jīng)過(guò)多次柱層析并重結(jié)晶，濃縮得紅色物質(zhì)，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經(jīng)薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結(jié)晶，即得到E、F與G。浸泡的菌體得到的浸膏經(jīng)過(guò)柱層析；收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復(fù)薄層層析和柱層析，不斷重結(jié)晶得到化合物H。
化合物E的試驗(yàn)數(shù)據(jù)紅色粒狀晶體，mp 222-225℃。FABMS m/z 321[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.20(1H，s)，12.67(1H，s)，6.43(1H，s)，4.71(1H，dd，2.5，5.0)，4.38(1H，d，2.5)，3.92(3H，s)，3.62(1H，m)，1.19(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc 184.3(C)，183.0(C)，175.9(C)，161.7(C)，160.3(C)，138.8(C)，136.4(C)，109.4(CH)，109.0(C)，106.8(C)，70.1(CH)，68.8(C)，56.8(CH3)，35.5(CH2)，29.9(CH2)，25.2(CH3)。
化合物F的試驗(yàn)數(shù)據(jù)橙紅色固體，mp 249-253℃，F(xiàn)ABMS m/z 301[M+1]+。1H NMR(DMSO-d6，500MHz)dH13.39(1H，s)，13.37(1H，s)，11.01(1H，s)，7.87(1H，s)，7.48(1H，s)，6.76(1H，s)，3.92(3H，s)，2.20(3H，s)；13C NMR(DMSO-d6，125MHz)dc185.8(C)，184.0(C)，162.0(C)，159.9(C)，157.5(C)，149.2(C)，133.6(C)，131.8(C)，129.5(CH)，124.4(C)，111.6(C)，110.9(CH)，106.4(CH)，105.5(C)，56.1(CH3)，16.1(CH3)。
化合物G的試驗(yàn)數(shù)據(jù)灰色粉末.mp235-237℃.1H NMR(DMSO，300MHz)dH12.351(s，1H，5-OH)，8.448(S，1H，8-OH)，6.486，(S，1H，6-CH)，5.000(d，1H，J＝5.7Hz，9-OH)，4.73(brd，1H，J＝5.7，12.0Hz，9-CH)，4.002(s，1H，2-OH)，3.87(s，3H，15-CH3)，3.82(Brd，j＝2.1，8.4，10Hz，4-CH)，3.0(dd，1H，J＝8.4，5.7Hz，3-CH)，2.74(1H，dd，J＝12，10Hz，14-CH)，2.11，(brd，J＝12，12Hz，13-CH)，1.70(1H，t，J＝13.0Hz，1-CHa)，1.53(1H，dd，J＝13.0，3.6Hz，1-CHb)，1.17(S，3H，16-CH3)；13C NMR(DMSO，300MHz)dc205.80(C-10)，157.85(C-5)，155.85(C-12)，135.69(C-7)，129.29(C-12)，107.40C-11)，98.86(C-6)，78.10(C-3)，70.57(C-4)，70.39(C-2)，61.77(C-9)，55.98(C-15)，47.13(C-14)，37.05(C-1)，27.100(C-16)。
化合物E的試驗(yàn)數(shù)據(jù)
實(shí)施例2 MTT還原法檢測(cè)化合物E、F和G抗腫瘤活性試驗(yàn)1.材料1.1四脞鹽(MTT)用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解MTT(3-(4，5-dimethythiazol-z-yl)2，5-diphenyltetrazolium bromide，SIGMA)終濃度5mg/mL，過(guò)濾除菌，分裝后4℃避光保存。
1.2靶細(xì)胞的制備HepG2細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng)a.從液氮罐中取出人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞的凍存管，迅速置入37℃水浴中，不停搖動(dòng)使之迅速溶化，無(wú)菌操作移入離心管中；b.加全培養(yǎng)液至10mL，1000rmp離心5s，棄上清；c.重復(fù)以上操作一次；d.以全培養(yǎng)液吹打使細(xì)胞混勻后移入培養(yǎng)瓶中，5％CO2，37℃培養(yǎng)；e.觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，及時(shí)更換培養(yǎng)液，分瓶。
1.3細(xì)胞計(jì)數(shù)a.選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，全培養(yǎng)終止，移入離心管中，加全培至10mL；b.取一滴滴入計(jì)數(shù)板一側(cè)凹槽中，顯微鏡下計(jì)數(shù)四大格的細(xì)胞總數(shù)、除以4，乘104，即為每毫升培養(yǎng)液所含細(xì)胞數(shù)；c.調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×105/mL；1.4化合物E、F和G的配制分別取一定量的化合物E、F和G加入到全培中，調(diào)整濃度為500μg/mL，超聲乳化，過(guò)濾除菌，4℃保存。
2.試驗(yàn)方法a.96孔板各孔加入HepG2細(xì)胞100μL(1×105/mL)，5％CO2，37℃培養(yǎng)4hr。
b.加入不同濃度受試對(duì)象100μL，對(duì)照加全培100μL，繼續(xù)培養(yǎng)48hr。
c.加入MTT(5mg/mL)各10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4hr。
d.去除培養(yǎng)液。每孔加入DMSO100μL，輕輕振蕩5-10min，使顆粒溶解。
e.酶聯(lián)免疫儀570nm下測(cè)定每孔OD值。
f.計(jì)算抑制率腫瘤細(xì)胞殺傷率％＝[(對(duì)照組測(cè)定的平均OD值-加藥組測(cè)定的平均OD值)/對(duì)照組測(cè)定的平均OD值]×100％g.以抑制率對(duì)藥物濃度的對(duì)數(shù)作圖，求得IC50值以lgc為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，求得IC50值3.試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果顯示化合物E、F和G均能有效抑制HepG2細(xì)胞株生長(zhǎng)。其中，E和F的IC50值分別為10.5μg/ml和3.5μg/ml。
權(quán)利要求
1.下述結(jié)構(gòu)式E、F和G的醌類(lèi)化合物
2.權(quán)利要求1所述醌類(lèi)化合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的種子培養(yǎng)培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖0.5～1.5，酵母提取物0.05～0.15，蛋白胨0.1～0.3，瓊脂1～1.5，氯化鈉3～5，水100，制成試管斜面，挑取菌株接入斜面，30～35℃培養(yǎng)5～7天；(2)真菌Halorosellinia sp.1403 CCTCC NOM 201018的發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基按重量比為葡萄糖5～15，酵母提取物1～4，蛋白胨0.5～4，氯化鈉3～5，水100，將斜面中培養(yǎng)好的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基，于室溫25～35℃靜置1～2個(gè)月；(3)將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液過(guò)濾除去菌體；(4)真菌#1403培養(yǎng)液過(guò)濾，菌體和培養(yǎng)液分別收集，培養(yǎng)液濃縮，將發(fā)酵液加熱濃縮至原液體積的1/10～1/5，用乙酸乙酯萃取多次，濃縮乙酸乙酯萃取液，在硅膠柱中進(jìn)行色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇為洗脫劑梯度洗脫；(5)培養(yǎng)液浸膏經(jīng)過(guò)柱層析后，收集20％～100％的乙酸乙酯/石油醚洗脫液，30％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液經(jīng)過(guò)多次柱層析并重結(jié)晶，濃縮得紅色物質(zhì)，即為E；再用50％的乙酸乙酯/石油醚為洗脫液，經(jīng)薄層層析和硅膠柱層析多次分離，重結(jié)晶，即得到F；收集100％的乙酸乙酯洗脫液反復(fù)薄層層析和柱層析，多次重結(jié)晶得到化合物G。
3.權(quán)利要求1所述醌類(lèi)化合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了醌類(lèi)化合物及其制備方法與抗腫瘤應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新的來(lái)源于海洋真菌的具有潛在藥用價(jià)值的醌類(lèi)化合物。海洋真菌種類(lèi)繁多、數(shù)量龐大，從真菌提取的方法簡(jiǎn)單，使得醌類(lèi)化合物來(lái)源豐富、成本低廉；醌類(lèi)化合物抗腫瘤活性高，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1762961SQ200510037139
公開(kāi)日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月13日
發(fā)明者佘志剛, 林永成, 黃華容, 夏雪奎, 蔡小玲, 周世寧, 關(guān)利平 申請(qǐng)人:中山大學(xué)