專利名稱：一種在大腸桿菌中生產(chǎn)重組內(nèi)皮抑素的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管生成對(duì)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是必須的。為了促進(jìn)血管生成，腫瘤組織生成一系列的血管生成因子(如bF6F)，同時(shí)許多腫瘤也會(huì)產(chǎn)生抗血管生成蛋白，其中之一內(nèi)皮抑素(endostatin)，是由美國(guó)哈佛大學(xué)Folkman博士研究組首次從鼠血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞系條件培養(yǎng)基中分離得到的(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，F(xiàn)olkman，J.Cell 88277-285，1997)。內(nèi)皮抑素是膠原XVIII的C-端片段，分子量為20kDa，能夠特異性抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，減少膠質(zhì)細(xì)胞瘤血管和血流，有效抑制小鼠各種原發(fā)腫瘤。人們?cè)噲D生產(chǎn)具有生物活性的內(nèi)皮抑素，但重組內(nèi)皮抑素蛋白在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中易聚集成無生物活性的、不溶性的包涵體。在體外變復(fù)性過程中，可溶性的活性內(nèi)皮抑素的產(chǎn)率很低，而且由于含有多對(duì)二硫鍵和非有效折疊，大部分沉淀的蛋白又再次沉淀(O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，F(xiàn)olkman，J.Cell 88277-285，1997；You，W.K.，So，S.H.，Lee，H.，Park，S.Y.，Yoon，M.R.，Chang，S.L.，Hong，Y.K.，Chung，S.L.Experimental and Molecular Medicine 31197-202，1999)。曾經(jīng)有報(bào)道在酵母中表達(dá)活性內(nèi)皮抑素(Dhanabal，M.，Ramchandran，R.，Volk，R.，Stillman，I.E.，Lombardo，M.，Iruela-Arispe，M.L.，Simons，M.Sukhatme，V.P.Cancer Res.59189-197，1999)。在小鼠動(dòng)物模型給藥中，需要大量?jī)?nèi)皮抑素(20mg/kg)，才能使腫瘤消退。高效、大量、低成本地生產(chǎn)具有生物活性的內(nèi)皮抑素，是其作為抗腫瘤藥物的開發(fā)和應(yīng)用的一個(gè)重要的瓶頸環(huán)節(jié)，也是目前內(nèi)皮抑素研究中的一個(gè)難點(diǎn)。目前重組人內(nèi)皮抑素的分離純化主要依靠肝素-親和層析介質(zhì)進(jìn)行純化、獲得高純度的重組人內(nèi)皮抑素，其生產(chǎn)過程費(fèi)時(shí)、分離純化昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本專利發(fā)明建立在中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200410065733.X《一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性重組蛋白質(zhì)的方法及其應(yīng)用》的基礎(chǔ)上，和中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)200410065733.X配套使用效果最佳。
本發(fā)明專利需要解決的問題是建立適用、簡(jiǎn)便、廉價(jià)地在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性的、有生物活性的重組人內(nèi)皮抑素的工藝和方法、建立相應(yīng)的可溶性的重組人內(nèi)皮抑素純化工藝，為重組人內(nèi)皮抑素作為抑制血管新生和腫瘤轉(zhuǎn)移的治療藥物用于治療腫瘤和其它血管生成相關(guān)疾病建立大規(guī)模、廉價(jià)生產(chǎn)的方法和工藝。本發(fā)明對(duì)于重組人內(nèi)皮抑素作為治療腫瘤和其它血管生成相關(guān)疾病藥物的開發(fā)和研究具有重要的實(shí)用意義。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來達(dá)到將人內(nèi)皮抑素基因克隆在大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將具有分子伴侶活性的蛋白質(zhì)在低溫下與人內(nèi)皮抑素共表達(dá)，低溫和分子伴侶都分別能夠促進(jìn)可溶性人內(nèi)皮抑素的產(chǎn)量。當(dāng)將人內(nèi)皮抑素或血管抑素表達(dá)菌株在低溫(35℃～16℃)下共表達(dá)，共表達(dá)分子伴侶能夠更有效防止人內(nèi)皮抑素包涵體形成。例如，在25℃時(shí)，當(dāng)人內(nèi)皮抑素和分子伴侶DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES共表達(dá)時(shí)，可溶性人內(nèi)皮抑素的產(chǎn)率約為36mg/L，每升培養(yǎng)液至少可純化獲得16mg的人內(nèi)皮抑素。可溶性的重組人內(nèi)皮抑素經(jīng)過硫酸銨沉淀，溶解、透析，離子交換層析和凝膠過濾層析得以純化。純化的人內(nèi)皮抑素能夠特異性、劑量依賴性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在雞胚尿囊絨膜(CAM)上，具有抑制新生血管生成的作用。
本發(fā)明提供了一種可行地、方便地生產(chǎn)可溶性的、具有生物活性的重組人內(nèi)皮抑素的方法，建立了與之相應(yīng)的簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的純化工藝。本發(fā)明工藝生產(chǎn)的重組人內(nèi)皮抑素可在制備治療腫瘤和血管生成相關(guān)性疾病藥物中應(yīng)用。
同已有的重組人內(nèi)皮抑素生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明的特色和創(chuàng)新之處在于(1)本發(fā)明建立了一個(gè)簡(jiǎn)便、價(jià)廉、高效地在大腸桿菌體系中提高可溶性重組人內(nèi)皮抑素產(chǎn)量的方法。利用分子伴侶共表達(dá)和低溫生長(zhǎng)聯(lián)合使用的方法，可以很容易地將原本幾乎都以包涵體形式表達(dá)的重組人內(nèi)皮抑素轉(zhuǎn)變?yōu)閹缀跞靠扇艿闹亟M人內(nèi)皮抑素。
(2)目前，常用的人內(nèi)皮抑素的分離純化方法主要是依賴于肝素親和層析，肝素親和層析介質(zhì)價(jià)格較為昂貴。本發(fā)明中，對(duì)于可溶性的重組人內(nèi)皮抑素，我們運(yùn)用了極為傳統(tǒng)和常用的硫酸銨沉淀、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析的純化步驟就達(dá)到了獲得純化的重組人內(nèi)皮抑素的目的，方法簡(jiǎn)便、價(jià)廉，具有很好的適用性，推廣方便，適于生產(chǎn)。
四

圖1.純化的重組人內(nèi)皮抑素1a.SDS-PAGE分析結(jié)果；1b.Western blot分析結(jié)果。
圖2.重組人內(nèi)皮抑素抑制b-FGF刺激的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。
黑色NIH3T3細(xì)胞；白色血管內(nèi)皮細(xì)胞。
圖3.重組人內(nèi)皮抑素抑制雞胚尿囊膜新生血管生成活性實(shí)驗(yàn)。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例重組人內(nèi)皮抑素基因的克隆、表達(dá)、分離純化和性質(zhì)鑒定1.重組人內(nèi)皮抑素的表達(dá)將重組人內(nèi)皮抑素表達(dá)質(zhì)粒pET23a-hE和分子伴侶表達(dá)質(zhì)粒pG-TF2(共表達(dá)分子伴侶TF和GroEL/ES)和pG-KJE8(共表達(dá)分子伴侶DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL/ES)共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株(Novagen公司)。TF和GroEL/ES由20ng/ml四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)，DnaK-DnaJ-GrpE由0.3mg/ml L-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá)，1mM IPTG用來誘導(dǎo)重組人內(nèi)皮抑素表達(dá)。表達(dá)菌體經(jīng)超聲破碎細(xì)胞，8000rpm離心10min收集菌體。
2.重組人內(nèi)皮抑素的分離純化1升表達(dá)菌體用50ml超聲液(20mMTris-Cl，pH7.5，2mM EDTA)懸浮，冰浴超聲20分鐘(5秒超聲，5秒間隔)。超聲后的混合物12000rpm，4℃下離心30分鐘。將表達(dá)上清液用20％硫酸銨沉淀濃縮，沉淀的蛋白4℃透析過夜，透析液A(10mMT Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4)，6-8小時(shí)換液一次，共換液3次，樣品直接進(jìn)行SP-Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)層析。柱床平衡洗滌均用透析液A，用0.6MNaCl，Tris-HCl，pH7.4和1M NaCl，Tris-HCl，pH7.4分步洗脫，將洗脫液混合，透析液A透析后凍干濃縮，Sephardex G75凝膠(Amersham Pharmacia Biotech)層析進(jìn)一步純化。
3.重組蛋白質(zhì)表達(dá)分析收獲細(xì)胞并超聲破菌，離心分離上清和沉淀，15％SDS-PAGE電泳分析，將考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE掃描(UVPWhite/Ultraviolet transilluminator)，分析結(jié)果并根據(jù)定量的分子量標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算重組人內(nèi)皮抑素的產(chǎn)率(使用UVP公司的軟件Grab-it 2.5和Gelwork)。用western blot分析確定重組人內(nèi)皮抑素純化產(chǎn)物，實(shí)驗(yàn)中使用PVDF westernblotting膜(Roche)，鼠多克隆抗人內(nèi)皮抑素抗體(Santa Cruz)。
4.重組內(nèi)皮抑素的細(xì)胞測(cè)活在添加20％小牛血清、抗生素及3ng/ml的人重組bFGF的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)BCE細(xì)胞(牛毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞)或者NIH 3T3細(xì)胞至足夠數(shù)量，加入0.05％胰蛋白酶消化，細(xì)胞重懸于含20％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。約12500個(gè)細(xì)胞/0.5ml(孔)加入24孔板中，37℃(10％CO2)培養(yǎng)24小時(shí)后分別加入25μl空白對(duì)照及不同劑量的重組人內(nèi)皮抑素于各個(gè)孔中。30分鐘后加入bFGF至終濃度1ng/ml。進(jìn)一步培養(yǎng)48h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，重懸于PBS，用70％冰冷乙醇固定30min，7-AAD染色，用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，比較樣品及空白孔中的活細(xì)胞數(shù)，可以計(jì)算出不同濃度的抑制率。
5.雞胚尿囊膜血管檢測(cè)重組人內(nèi)皮抑素活性實(shí)驗(yàn)取孵化8～9天雞胚，在血管豐富處挑去三角形蛋殼，挑破殼膜，將重組人內(nèi)皮抑素加在滅菌濾紙上，再將濾紙貼在尿囊膜上面。用無菌膠帶封口。給藥3天后，打開雞胚，在給藥處滴加等量甲醇和丙酮的混合液，室溫固定15分鐘，待血液凝固后剪下尿囊膜，放入水中展平，進(jìn)行觀察和拍照。
本發(fā)明建立了應(yīng)用傳統(tǒng)和常用的硫酸銨沉淀、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析的純化步驟就達(dá)到了獲得純化的重組人內(nèi)皮抑素的純化工藝，方法簡(jiǎn)便、價(jià)廉，具有很好的適用性，推廣方便，適于生產(chǎn)。
在25℃下，利用低溫和分子伴侶共表達(dá)能夠產(chǎn)生約36mg可溶性的重組人內(nèi)皮抑素，通過上述純化步驟能夠純化獲得至少16mg，經(jīng)SDS-PAGE分析純度為98％的重組人內(nèi)皮抑素，其分子量為預(yù)期的20kDa，能夠?yàn)榭谷藘?nèi)皮抑素抗體所識(shí)別。重組人內(nèi)皮抑素可以抑制BCE細(xì)胞的增殖，并且呈劑量依賴關(guān)系(見附圖2)，其ED50＝0.5μg/ml，對(duì)于其它細(xì)胞(如NIH3T3等)則沒有抑制細(xì)胞增殖的活性。重組人內(nèi)皮抑素具有明顯的抑制雞胚尿囊膜新生血管生成活性和明顯的血管抑制作用，4μg重組人內(nèi)皮抑素導(dǎo)致血管完全被抑制，導(dǎo)致雞胚死亡。
權(quán)利要求
1.一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性重組人內(nèi)皮抑素的方法，其特征是將重組人內(nèi)皮抑素表達(dá)菌株在低溫下和分子伴侶共表達(dá)。
2.一種分離純化可溶性重組人內(nèi)皮抑素的方法，其特征是將可溶性的重組人內(nèi)皮抑素經(jīng)過硫酸銨沉淀、溶解、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析進(jìn)行純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法生產(chǎn)的重組人內(nèi)皮抑素在制備治療腫瘤和血管生成相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述方法生產(chǎn)的重組人內(nèi)皮抑素在制備治療腫瘤和血管生成相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種在大腸桿菌中生產(chǎn)可溶性的、有生物活性的重組人內(nèi)皮抑素的工藝和分離純化方法。利用本發(fā)明表達(dá)和純化的具有生物活性的重組人內(nèi)皮抑素能夠特異性、劑量依賴性地抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，在雞胚尿囊絨膜動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有抑制新生血管生成的作用。本發(fā)明適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。
文檔編號(hào)A61K38/17GK1661019SQ20051003812
公開日2005年8月31日 申請(qǐng)日期2005年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月18日
發(fā)明者華子春, 徐寒梅 申請(qǐng)人:南京大學(xué)