專利名稱：23－羥基白樺酸在抑制血管生成中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
23-羥基白樺酸在抑制血管生成中的應(yīng)用，涉及中藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及23-羥基白樺酸的新用途。
背景技術(shù)：
原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于源自既存血管的新生血管的生成，這個過程叫做血管生成(angiogenesis)。腫瘤既可通過腫瘤血管從宿主獲取營養(yǎng)和氧氣，又可通過腫瘤血管源源不斷地向宿主輸送轉(zhuǎn)移細(xì)胞，并在機(jī)體的其他部位繼續(xù)生長和誘導(dǎo)血管形成，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會超過1～2mm，也不會出現(xiàn)浸潤和轉(zhuǎn)移。抑制腫瘤血管生成與阻斷腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可阻止癌前病變向癌的惡性轉(zhuǎn)變。不僅實體腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴新生血管生成，血液系統(tǒng)惡性腫瘤(如惡性淋巴瘤、淋巴細(xì)胞白血病等)的生長和轉(zhuǎn)移也與血管生成密切相關(guān)。腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、預(yù)后與血管生成密切相關(guān)，以腫瘤的血管生成為靶點，開發(fā)血管生成抑制劑，不但可用于大多數(shù)實體腫瘤的治療，還可用于癌的預(yù)防和血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療，同時對其他與血管生成有關(guān)的疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等的預(yù)防與治療，都具有重要的理論及現(xiàn)實意義。因此，腫瘤的血管系統(tǒng)已成為一個嶄新的、有希望的抗腫瘤治療靶點。
開發(fā)和研究能破壞或抑制血管生成，有效地阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的藥物(腫瘤血管生成抑制劑，tumor angiogenesis inhibitor，TAI)是目前的研究熱點。TAI通過切斷腫瘤賴以生長和轉(zhuǎn)移的營養(yǎng)來源和遷移通道，具有許多優(yōu)勢①治療發(fā)生時，血管生成已被啟動，故TAI治療具有良好的特異性。②血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血流中，藥物能直接發(fā)揮作用，故劑量小、療效高。③內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)相對穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性。④腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖速度較正常血管內(nèi)皮細(xì)胞快許多倍，故TAI對正常組織毒性極小。近年來，這類抑制劑的研究已取得進(jìn)展，可望在21世紀(jì)初成為一類嶄新的、有希望的抗腫瘤治療藥物，其中天然藥物的開發(fā)備受關(guān)注。
白頭翁是一傳統(tǒng)中藥，具清熱解毒、活血化瘀功效，中醫(yī)臨床主要用于結(jié)腸癌、直腸癌等腸道腫瘤及子宮頸癌、腦垂體瘤、甲狀腺瘤、肺癌的治療。23-羥基白樺酸是從傳統(tǒng)中藥白頭翁(Pulsatilla Chinensis)根部分離出的一種五環(huán)三萜類皂苷，是中藥白頭翁的特征性成分，其結(jié)構(gòu)式為 分子式為C30H48O4，類白色粉狀物，分子量為472，易溶于二甲亞砜、氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有機(jī)溶劑，不溶于水。它可通過采取“23-羥基白樺酸在制備治療或預(yù)防腫瘤和艾滋病藥物中的應(yīng)用”(申請?zhí)枮?3152904.6的中國發(fā)明專利申請文件中作了詳細(xì)的敘述)而獲得，但這不是獲得23-羥基白樺酸的唯一方法和唯一來源。
23-羥基白樺酸具有廣泛的抗腫瘤活性。體內(nèi)外抑瘤實驗表明，它較白頭翁中提取的其它衍生物抗黑色素瘤作用更強(qiáng)，低劑量時(10-20ug/mL)對黑色素瘤B16細(xì)胞即有明顯的分化誘導(dǎo)作用，高劑量時(小鼠灌胃300-600mg/kg)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對體內(nèi)外黑色素瘤增殖有明顯的抑制作用。此外，它不同于Pisha等報道的在樺樹皮中提取的成分白樺酸，后者只對黑色素瘤有抑制作用而對其它腫瘤細(xì)胞沒有作用。它對多種腫瘤細(xì)胞系如人胃癌SGC-7901細(xì)胞系、人卵巢癌A0細(xì)胞系、人白血病HL-60細(xì)胞系、人白血病K562細(xì)胞系、人宮頸癌Hela細(xì)胞系及小鼠腹水瘤S180細(xì)胞系等均有抑制作用。中國專利(申請?zhí)枮?3152904.6)還報道，它對肺癌、肝癌、腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腸道腫瘤、艾滋病毒等均有抑制作用。但由于其抗癌作用機(jī)制還不明確，限制了其抗癌作用的發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供23-羥基白樺酸的一種新用途，23-羥基白樺酸在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，23-羥基白樺酸具有抑制血管生成的作用。因此本發(fā)明的技術(shù)方案是23-羥基白樺酸在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用時，其有效劑量為3～50mg/kg體重/天。
需要的時候，在23-羥基白樺酸制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑等，必要時還可以加入香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明的藥物可以制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑、乳劑等多種形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
本發(fā)明的研究表明，除了治療和/或預(yù)防癌癥，以23-羥基白樺酸為活性成分的抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物，對于與血管生成有關(guān)的疾病如糖尿病、視網(wǎng)膜病變、早熟視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、老年盤狀斑變性、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、血管瘤、動脈粥樣硬化等疾病具有確切的治療和預(yù)防作用，同時對傷口愈合中的斑痕形成也有顯著的抑制作用。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明巧妙地以血管生成作為治療疾病的靶點，具有以下優(yōu)點1、治療針對已經(jīng)啟動的新生血管進(jìn)行，具有特異性；2、由于血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血流中，藥物直接發(fā)揮作用，故劑量小，療效高，副作用小；3、由于內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)相對穩(wěn)定，故不易產(chǎn)生耐藥性。


圖1 23-HBA對HMEC細(xì)胞體外增殖的抑制作用。
圖2 23-HBA對HMEC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響。
圖3 23-HBA對HMEC細(xì)胞Matrigel體外小管形成的影響。
具體實施例方式
實施例123-羥基白樺酸對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。
1.1 23-羥基白樺酸(23-HBA)對人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC)的體外增殖試驗將人血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC，法國國家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院惠贈)置于含1mmol-谷氨酰胺，1μg/mL氫化可的松，10ng/mL表皮生長因子(EGF)和15％小牛血清的MCDB-131培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37℃、5％CO2、95％濕度)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以105cell/mL細(xì)胞接種于96孔板，100μL/孔，每組設(shè)4個平行孔，放置于37℃、5％濕化CO2的培養(yǎng)箱過夜。加不同濃度(10～100μg/mL)的23-HBA，以溶媒二甲亞砜(DMSO)為陰性對照，培養(yǎng)48小時后，去掉上清液，每孔輕輕地加入10％三氯醋酸100μL固定，靜置5min后移到4℃放置1h后倒掉固定液，用去離子水洗5次，空氣干燥。每孔加入0.4％磺酰羅丹明B(SRB)100μL室溫放置30min，用1％醋酸液洗5飲，加150μL 10mM Tris堿液(pH10.5)溶解，自動分光光度儀在531nm波長處測定每個小孔的吸光度值(A)。上述實驗重復(fù)3次。抑制率(％)計算公式如下
結(jié)果如圖1所示，23-羥基白樺酸對人血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖呈劑量依賴性抑制作用，其半數(shù)抑制量為40.44ug/mL。
1.2 23-HBA對HMEC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響24孔板中先加入玻璃片，再加對數(shù)生長期HMEC細(xì)胞，每孔2×105個細(xì)胞，37℃、5％濕化CO2培養(yǎng)24h。加入不同濃度(1～60μg/mL)的23-HBA處理72h，取出玻璃片，0.001M磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH7.4)洗滌，冷丙酮固定，HE染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變并拍照。結(jié)果如圖2所示正常的細(xì)胞經(jīng)染色仍然保持原有的生長形狀，細(xì)胞核完整，染成均一藍(lán)色或略帶一點紅色。加1μg/mL 23-HBA后，部分細(xì)胞開始凋亡，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色或深紅色，染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀。當(dāng)23-HBA濃度提高到10μg/mL以上，HMEC細(xì)胞的凋亡現(xiàn)象更加明顯。
實施例223-羥基白樺酸對人血管內(nèi)皮細(xì)胞管形成能力的抑制作用。
2.1體外小管形成試驗4℃下于96孔培養(yǎng)板底部加入50μL生長減少型Matrigel，鋪平后培養(yǎng)箱內(nèi)37℃孵育4h，將23-HBA與15％小牛血清MCDB-131培養(yǎng)液和HMEC細(xì)胞(4×104細(xì)胞/孔，每孔體積為0.25ml)混勻后加入培養(yǎng)板，23-HBA終濃度為1～60μg/mL，以溶媒為陰性對照。37℃、5％濕化CO2培養(yǎng)24h后，應(yīng)用倒置顯微鏡，觀察23-HBA對內(nèi)皮細(xì)胞體外構(gòu)建血管的影響。結(jié)果可見23-HBA對HMEC細(xì)胞體外Matrigel小管形成有顯著的抑制作用。23-HBA濃度為1μg/mL時，對HMEC細(xì)胞小管形成即有明顯影響，不僅小管數(shù)目減少，而且管腔不完整；濃度為10μg/ml時，HMEC細(xì)胞貼壁后幾乎無移動，根本無小管形成；在60μg/ml濃度下，細(xì)胞貼壁困難。23-HBA濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和60μg/ml時4個實驗組形成管腔的面積與對照組相比有明顯差異(圖3)。
2.2體內(nèi)Matrigel plug法血管抑制試驗4℃下取液態(tài)Matrigel與不同濃度(1～200μg/mL)的23-HBA分別混合，取0.4mL注射入BALB/c小鼠的腋部皮下，4只小鼠為一組。7d后處死小鼠，取出Matrigel小包，10％中性福爾馬林固定，包埋，切片，HE染色，顯微鏡下攝片，放大200倍，隨機(jī)選取5個視野內(nèi)遷移入Matrigel小包內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果見表1。鏡下觀察23-HBA濃度高于1μg/mL時，可明顯減少侵入Matrigel小包的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量，且隨濃度的升高，細(xì)胞侵入的數(shù)目下降，與對照組相比，差異有顯著性(P＜0.001)。
表1 23-HBA對Matrigel小包內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量的影響

與對照組比較P＜0.001實施例323-羥基白樺酸對人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的抑制作用。
3.1抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移試驗將24孔板呈60°傾斜，在每孔底部的1/2處加1％的瓊脂糖，待凝固后用培養(yǎng)基洗滌，沒有瓊脂糖的一側(cè)加HMEC細(xì)胞，每孔105個細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后分別加陰性對照和不同濃度(1～60μg/ml)的23-HBA，72h后用倒置顯微鏡記錄每一組內(nèi)皮細(xì)胞向另一半遷移的數(shù)量。結(jié)果顯示，沒有23-HBA干預(yù)組細(xì)胞的遷移數(shù)量較高，細(xì)胞遷移抑制率呈濃度依賴性，23-HBA可能通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移而抑制新生血管的生成(表2)。
表2 23-羥基白樺酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移數(shù)的影響

與對照組比較P＜0.001實施例4荷瘤裸鼠體內(nèi)試驗。
人類結(jié)腸癌細(xì)胞系LoVo細(xì)胞，用PBS制成細(xì)胞懸液，以200萬cell/200ul接種至8周大的BALB/cAnN-nu/nu裸鼠的右股部皮下。待瘤體生長至5mm×5mm大小時，隨機(jī)分成兩組，每組5只。23-羥基白樺酸用藥組給藥劑量為25mg/kg(藥物以含10％DMSO的PBS溶液溶解)，對照組給含10％DMSO的PBS溶液200ul，連續(xù)給藥60天，每天記錄瘤體的長徑和短徑。用藥期間，小鼠未出現(xiàn)不良反應(yīng)。處死小鼠后，取出腫瘤，檢測腫瘤的微血管密度。結(jié)果顯示，用藥組瘤體較對照組縮小，生長明顯減慢，微血管密度明顯低于對照組。說明該藥具有體內(nèi)抑制腫瘤的作用，而且副作用小。
實施例5荷瘤裸鼠體內(nèi)試驗。
操作方法同實施例4。23-羥基白樺酸用藥組給藥劑量為3mg/kg，結(jié)果顯示，用藥組瘤體較對照組縮小，生長減慢，微血管密度低于對照組。說明該藥具有體內(nèi)抑制腫瘤的作用，而且副作用小。
實施例6荷瘤裸鼠體內(nèi)試驗。
操作方法同實施例4。23-羥基白樺酸用藥組給藥劑量為50mg/kg，結(jié)果顯示，用藥組瘤體較對照組縮小，生長顯著減慢，微血管密度顯著低于對照組。說明該藥具有體內(nèi)抑制腫瘤的作用，而且副作用小。
權(quán)利要求
1.23-羥基白樺酸在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述23-羥基白樺酸在抑制血管生成的藥物中的有效劑量為3～50mg/Kg體重/天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于在制備該抑制血管生成的藥物中還可加入一種或多種藥學(xué)上能接受的載體，此類載體為包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、乳化劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物能制成注射液、片劑、粉劑、粒劑、膠囊、口服液、膏劑、霜劑或乳劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防癌癥的藥物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為傷口愈合中抑制斑痕形成的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防糖尿病視網(wǎng)膜病、早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞的藥物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防老年盤狀斑變性及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防銀屑病的藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防血管瘤的藥物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為治療和/或預(yù)防動脈粥樣硬化的藥物。
全文摘要
23－羥基白樺酸在抑制血管生成中的應(yīng)用，涉及中藥應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了23－羥基白樺酸在抑制血管生成中的新用途，研究表明，23－羥基白樺酸具有抑制血管生成的作用。23－羥基白樺酸在制備抑制血管生成的治療和/或預(yù)防藥物中應(yīng)用的有效劑量為3～50mg/kg體重/天。本發(fā)明巧妙地以血管生成作為治療疾病的靶點，具有以下優(yōu)點1.治療針對已經(jīng)啟動的新生血管進(jìn)行，具有特異性；2.由于血管內(nèi)皮細(xì)胞暴露于血流中，藥物直接發(fā)揮作用，故劑量小，療效高，副作用??；3.由于內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)相對穩(wěn)定，故不易產(chǎn)生耐藥性。
文檔編號A61P27/02GK1682742SQ200510038469
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月15日
發(fā)明者楊敏, 蔣孟軍, 張榮軍, 周堯遠(yuǎn), 曹國憲, 項景德, 王廣基, 葉文才 申請人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所