專利名稱：一種抗高血壓核酸疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，本發(fā)明提供了一種治療和預(yù)防高血壓的核酸疫苗。
背景技術(shù)：
血壓水平與心血管疾病風(fēng)險呈連續(xù)性相關(guān)。世界衛(wèi)生組織把高血壓定義為未服抗高血壓藥情況下，收縮壓≥140mmHg和/或舒張壓≥90mmHg。而高血壓誘因很多主要有遺傳因素，環(huán)境因素，臟器病變因素。其中研究最為透徹的是腎素—血管緊張素(RAS)系統(tǒng)，而且大部分的藥物也是針對腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)起效的。RAS系統(tǒng)是高血壓形成的最重要的途徑，其升高血壓的機制如下腎臟近球小動脈的近球細胞分泌腎素，把肝臟分泌的血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素I，血管緊張素I在肺上皮細胞的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)作用下降解為血管緊張素II(AngII)，AngII與血管緊張素受體結(jié)合，而血管緊張素受體主要存在于血管，以及心，腦，腎，從而引起血管的強烈收縮，并刺激醛固酮的分泌，引起血壓升高，同時使心肌重構(gòu)造成心肌肥厚，加重高血壓的病情。
AngII水平升高與醛固酮水平增加相協(xié)同，可使冠狀動脈通透性增加生長因子滲入心肌間質(zhì)，引起纖維組織增生，心肌壁增厚變硬，形成心室充盈不良，進而再增強RAS系統(tǒng)活動，抑制纖維蛋白溶解。研究表明AngII抑制纖維連接素而刺激纖維蛋白溶酶原抑制因子表達，因而減低纖溶，促進血栓形成。AngII可加重急性腦血管病人的多臟器衰竭。
目前全世界約有20％的成人患高血壓，其中大約有50％的高血壓病人還沒有被診斷出來，已經(jīng)被確診的高血壓患者中又有半數(shù)未接受治療，而在接受治療者中，血壓真正得到有效控制的也僅占半數(shù)。高血壓不僅是一個獨立的疾病，而且是心臟病、腦卒中、腎功能衰竭等疾病的主要危險因素。國外研究顯示，得了高血壓，不經(jīng)治療，任其發(fā)展，三到五年就出現(xiàn)了部分心、腦、腎的損害，這組病人平均患病年齡32歲，平均死亡年齡51歲。
目前市場上所用的針對RAS系統(tǒng)抗高血壓藥物，主要是化學(xué)合成藥物，他們可分為兩種1.血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)，2.血管緊張素受體拮抗劑(ARB)。ACEI和ARB需要病人長期用藥，給藥間隔短，而本發(fā)明可長期抑制高血壓，用藥后可兩周保持血壓穩(wěn)定，而且直接針對AngII產(chǎn)生抗體，降血壓效果明顯。疫苗作為生物制品，具有完全不同于現(xiàn)有化學(xué)藥物的本質(zhì)和作用機制，通過激活人自身的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生具有保護效力并可在體內(nèi)維持相當長時間的抗體，故抗高血壓疫苗的開發(fā)為安全有效地預(yù)防和治療高血壓提供了一個新思路和新方法。
AngII是八肽組成的升高血壓的效應(yīng)分子，血壓的升高與之直接相關(guān)。本發(fā)明誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生針對AngII的抗體，屏蔽AngII的升血壓作用，從而產(chǎn)生藥效。白介素IV是一種細胞因子，可以增強免疫刺激作用，并且介導(dǎo)Th1(T輔助細胞)轉(zhuǎn)為Th2免疫。由于Th1細胞參與許多器官特異性自身免疫疾病，而Th2細胞則起抑制作用，白介素IV可以使基因疫苗的所引起的細胞免疫和體液免疫，變?yōu)橐泽w液免疫為主，從而升高抗體滴度，增強藥效，減少副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗高血壓的核酸疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)該抗高血壓核酸疫苗的方法。
本發(fā)明的還有一個目的是該抗高血壓核酸疫苗的用途。
在本發(fā)明的第一個方面，提供了一種抗高血壓核酸疫苗。該質(zhì)粒pCR3.1-X8-HBc-six ANGII載體結(jié)構(gòu)框架圖見說明書附圖1，測序圖見附4，除具有真核表達載體基本元件外，還包含有編碼乙肝核心蛋白(HBc)的核苷酸序列，該HBc序列中已引入一個限制性內(nèi)切酶的識別位點，并且引入了六段重復(fù)AngII序列。由于人源AngII是人體內(nèi)固有短肽，自身無免疫原性，被自身免疫系統(tǒng)所耐受，若采用AngII直接作為免疫原，則無法產(chǎn)生理想的免疫效果。為增強AngII II的免疫原性，打破免疫耐受，我們采用乙肝核心蛋白(HBc)顆粒作為免疫載體。HBc具有在真核細胞大量表達，并自身裝配成不具傳染性的病毒樣顆粒的獨特性質(zhì)。該顆粒由240個HBc單體組成，表面呈現(xiàn)有120個刺突，HBc的主要免疫區(qū)(MIR)即位于刺突的尖端。HBc病毒樣顆粒易于被專職抗原遞呈細胞攝取，有顯著刺激B細胞、T輔助細胞及細胞毒T細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力。使用六段重復(fù)AngII多肽作為表位可以增強機體針對血管緊張素II的免疫作用。
白介素IV(IL-4)具有免疫刺激作用。該質(zhì)粒(pIL-4)結(jié)構(gòu)框架圖見圖2，測序圖見圖3。IL-4可作為佐劑，增強核酸疫苗的免疫效果，而且其本身在治療自身免疫性疾病方面也發(fā)揮獨特作用，抑制自身免疫性疾病的發(fā)生。
在本發(fā)明的第二方面，提供生產(chǎn)抗高血壓核酸疫苗的方法，其技術(shù)路線詳述如下1.抗高血壓核酸疫苗質(zhì)粒pCR3.1-X8-HBc-six ANGII及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建根據(jù)血管緊張素II的多肽序列設(shè)計3條引物，用加端PCR方法擴增得到編碼六段重復(fù)AngII的DNA片段，插入本實驗室構(gòu)建pCR3.1-X8-HBc的質(zhì)粒載體中的AgeI的酶切位點中，組成融合表達的重組質(zhì)粒pCR3.1-X8-HBc-six ANGII，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α，獲得重組基因工程菌。
2.工程菌發(fā)酵及抗高血壓核酸疫苗重組質(zhì)粒的獲得以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)和發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵參數(shù)如下溫度36-38℃，PH6.8-7.2。發(fā)酵后離心收集工程菌。用堿裂解法對工程菌中的質(zhì)粒DNA進行粗提，粗提液經(jīng)陰離子交換樹脂DEAE纖維素純化，在TE(pH8.0)中以NaCl溶液進行梯度洗脫，先用0.3mol/L NaCl將雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、低分子量RNA)洗脫除去，然后用0.6mol/L NaCl將質(zhì)粒DNA洗脫收集，并將收集液用兩倍體積無水乙醇沉淀，離心所得沉淀即為純化質(zhì)粒DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測純化的重組質(zhì)粒純度。
3高血壓核酸疫苗最終制備把提取的pIL-4的質(zhì)粒與pCR3.1-X8-HBc-sixANGII質(zhì)粒在生理鹽水中按1∶5的比例混合。
在本文的第三方面是抗高血壓核酸疫苗的用途。將抗高血壓核酸疫苗重組質(zhì)粒直接免疫動物，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)在機體內(nèi)表達出表面呈現(xiàn)有AngII表位的重組HBC病毒樣顆粒，激發(fā)機體產(chǎn)生針對AngII的特異性抗體?？笰ngII抗體能與體內(nèi)內(nèi)源AngII結(jié)合，阻斷AngII與其受體結(jié)合，從而降低血壓，避免心肌重構(gòu)，減少心肌纖維化。另一方面白介素IV(IL-4)可以通過改變局部的細胞因子水平，誘導(dǎo)Th1轉(zhuǎn)化為Th2免疫，即增強了核酸疫苗的體液免疫效果，降低了由細胞免疫引起的自身免疫損傷。


圖1pCR3.1-X8-HBc-six ANGII質(zhì)粒結(jié)構(gòu)2pIL-4質(zhì)粒結(jié)構(gòu)3pIL-4質(zhì)粒測序4pCR3.1-X8-HBc-six ANGII中部分HBC和六段AngII測序5大鼠收縮壓用藥前后比較圖。結(jié)果顯示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII可以使高血壓大鼠收縮壓下降20mmHg(汞柱)。
圖6大鼠舒張壓用藥前后比較圖。結(jié)果顯示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+Il-4可以使高血壓大鼠舒張壓下降10mmHg(汞柱)。
圖7大鼠心肌肥厚各組比較圖。結(jié)果顯示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4免疫大鼠可以減輕大鼠心肌肥厚程度。
圖8ELISA抗體檢測圖。ELISA測定結(jié)果顯示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4共免疫大鼠，可以使大鼠產(chǎn)生最高的抗體滴度。
圖9血清中血管緊張素II放免測定。結(jié)果顯示核酸疫苗pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4共免疫大鼠，可以有效的降低血清中血管緊張素II的濃度。
圖10心肌纖維化切片圖。結(jié)果顯示pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+IL-4共免疫大鼠可以有效得保護心肌，減輕心肌的肥厚程度和纖維化的程度。
具體實施例方式
(1)菌株，細胞系和質(zhì)粒宿主菌Escherichia coli DH-5α是基因工程常用工具菌種，與基因工程研究有關(guān)的實驗室一般都有保存。
質(zhì)粒pCR3.1uni購自Invitrogen公司。
(2)乙肝病毒提取自南京市第二醫(yī)院HBcAg陽性病人血清(3)酶和試劑分子克隆工具酶購自MBI公司試劑PCR純化試劑盒、膠回收試劑盒為Promega公司產(chǎn)品乙肝病毒基因組提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品其它試劑為上海生工生物工程有限公司訂購(4)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
(5)Cellouse-DEAE52為Whatman公司產(chǎn)品。
(6)辣根過氧化物酶標記兔抗大鼠二抗為武漢博士德公司產(chǎn)品。
(7)3、3`、5、5`-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、過氧化氫尿素和牛血清白蛋白(BSA)為美國西格馬(Sigma)公司產(chǎn)品。
(8)96孔酶標板為美國康寧(Corning)公司產(chǎn)品。
(9)BESN-11多通道動物無創(chuàng)測壓儀，南京德賽生物技術(shù)有限公司方法質(zhì)粒提取、聚合酶鏈反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、DNA片斷的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp.16-340。
核酸的定量測定參見Sambrook J，F(xiàn)ristsh E F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NYCold Spring Harbor Laboratory Press，1989。
實施例1真核表達載體pCR3.1-X8-HBc的構(gòu)建用QIAamp DNA Blood Mini Kit從南京市第二醫(yī)院HBcAg陽性病人血清中提取乙肝病毒基因組RNA。并用市場銷售的隨機引物將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)乙肝核心抗原基因序列分別合成兩對能與該基因互補的引物P1-P4。引物P1、P3和P4的5’端分別含有HindIII、AgeI和XbaI酶切位點，而引物P2的5’端依次含有PstI和AgeI兩個酶切位點。第一步以P1和P2為引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得的乙肝病毒DNA為模板進行PCR，94℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共30輪；72℃，10min。擴增得到的PCR產(chǎn)物即HBc的N端用限制性內(nèi)切酶HindIII和PstI消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的pCR3.1uni質(zhì)粒連接。再以P3和P4為引物，以反轉(zhuǎn)錄獲得的乙肝病毒DNA為模板進行PGR，94℃，5min；94℃，1min，58℃，1min，72℃，1min，共30輪；72℃，10min。擴增得到的PCR產(chǎn)物即HBc的C端用限制性內(nèi)切酶AgeI和XbaI消化，與用相同限制性內(nèi)切酶消化的第一步構(gòu)建的質(zhì)粒連接。這樣就在HBcAg序列中的第80、81位氨基酸所對應(yīng)的核苷酸處引入了AgeI位點。
P15’AAAAAGCTTATGGACATTGACACGTATAAAGAA 3’P25’TTTTTCTGCAGACCGGTTGGGTCTTCCAAATTACTTCC 3’P35’ATCACCGGTCGGGAATTAGTAGTCGGTTATGTCAATG 3’P45’TTGTCTAGACTAACATTGAGATTCCCGAGATTG 3’設(shè)計T1和T2引物3’端25堿基互補，以引物自身為模板PCR得到三段重復(fù)AngII的序列并兩端引入單酶切位點Age1，在3’末端引入Kpn1酶切位點。設(shè)計P3與P2，3’端25堿基互補，以引物自身為模板PCR得到三段重復(fù)AngII的序列并兩端引入單酶切位點Kpn1。引物由上海博亞合成。
PCR反應(yīng)體系100pmo1 T1，100pmol T2，2μl dNTP(10mmol/L)以及5單位的PFU DNA聚合酶，總體系為50μl。
100pmol T3，100pmol T2，2μl dNTP(10mmol/L)以及5單位的PFU DNA聚合酶，總體系為50μl。
PCR反應(yīng)條件94℃ 5min；94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 30s，循環(huán)數(shù)30；72℃10min。
將擴增純化后的引物P1與P2，P3和P2擴增出的DNA片段，采用Age1進行酶切，反應(yīng)體系如下ddH2O 27μl；10×Buffer O+6μl；Ang II DNA片段24μl；AgeI 3μl，共60μl，37℃，反應(yīng)2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收。
采用堿裂解法對上步構(gòu)建的pCR-X8-HBc質(zhì)粒進行抽提，抽提得到的質(zhì)粒也用AgeI進行酶切。酶切體系如下ddH2O 39ul，10×Buffer O+6μl，pCR-X8-HBc質(zhì)粒12μl，AgeI 3μl，共60μl，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，并經(jīng)0.8％agarose gel電泳檢測確證。將該質(zhì)粒酶切產(chǎn)物進行去磷酸化(CIAP1)處理。CIAP體系如下ddH2O 37μl，10×CIAP Buffer 7μl，pCR-X8-HBc質(zhì)粒酶切產(chǎn)物24μl，CIAP 2μl，共70μl。CLAP產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，并經(jīng)0.8％agarose gel電泳檢測，確證CIAP產(chǎn)物已高效回收。將上述酶切回收后得到的P1和P2擴增得到的DNA片段和pCR-X8-HBc質(zhì)粒片段進行連接。連接反應(yīng)體系如下10×T4DNA連接酶Buffer 1μl，P1和P2擴增DNA片段4μl；pCR-X8-HBc質(zhì)粒片段4μl，T4DNA連接酶1μl，共10μl，16℃連接過夜，所得連接產(chǎn)物為pCR-X8-HBc-3×ANGII質(zhì)粒。
用堿裂解法提取pCR-X8-HBc-3×ANG質(zhì)粒，用華瞬的質(zhì)粒純化試劑盒純化后用Kpn1酶切。反應(yīng)體系如下ddH2O 39μl，10×L 6μl，pCR-X8-HBc-3×ANG質(zhì)粒12μl，KpnI 3μl，共60μl，37℃酶切2h。酶切產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，并經(jīng)0.8％agarose gel電泳檢測確證。將該質(zhì)粒酶切產(chǎn)物進行去磷酸化(CIAP)處理。CIAP體系如下ddH2O 37μl，10×CIAPBuffer 7μl，pCR-X8-HBc質(zhì)粒酶切產(chǎn)物24μl，CIAP 2μl，共70μl。CIAP產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，并經(jīng)0.8％agarose gel電泳檢測，確證CIAP產(chǎn)物已高效同收。將上述酶切回收后得到的T3和T2擴增得到的DNA片段和pCR-X8-HBc-3×ANG II質(zhì)粒片段進行連接。連接反應(yīng)體系如下10×T4DNA連接酶Buffer 1μl，T3、T2擴增的DNA片段4μI；pCR-X8-HBc-3×ANG質(zhì)粒片段4μl，T4DNA連接酶1μl，共10μl，16℃連接過夜，所得連接產(chǎn)物為pCR-X8-HBc-sixANG II質(zhì)粒。
T1TTCACCGGTGACCGTGTTTACATCCATCCGTTCGATCGCGTGTATATTCATCCATTTGAT2TTTACCGGTACCGAACGGGTGGATGTAAACACGGTCAAATGGATGAATATACACGCGATT3AAAGGTACCGACCGTGTTTACATCCATCCGTTCGATCGCGTGTATATTCATCCATTTGA制備E.coli DH-5α感受態(tài)細胞，用上述連接液進行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化后涂布的平板上出現(xiàn)的抗amp的陽性克隆命名為pCR-X8-HBc-sixANG II，采用堿法抽提質(zhì)粒后，采用PCR篩選挑選出陽性克隆。PCR篩選中用X1、T2進行擴增，如能得到462bp長度的DNA片段即為陽性克隆X15’AAA ATGGACATTGACACGTATAAAGAA 3’白介素IV pIL-4的獲得白介素基因由Department of pathology and laboratorymedicine，University of Pennsylvania惠贈，設(shè)計了兩條引物C1，C2擴增IL-4并引入EcoRI和Kpn I酶切位點裝入Ptarget質(zhì)粒中。
C15’CGAATTATGGGTCTCAACCCC
C25’GGTACCCTACGAGTAATCCATTT實施例2工程菌發(fā)酵及抗高血壓核酸疫苗重組質(zhì)粒的大規(guī)模制備含pCR3.1-X8-HBc-six ANGII質(zhì)粒的工程菌培養(yǎng)在1000ml搖瓶中進行。從新鮮轉(zhuǎn)接的平皿中挑取單菌落接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8小時至對數(shù)期作為一級種子，以1/250接種量接入到含250mlLB液體培養(yǎng)基的1000ml搖瓶中，37℃劇烈振搖繼續(xù)培養(yǎng)12小時。以5000rpm離心15min收集菌體，將細菌沉淀物充分重懸于9ml溶液I[50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)]中，再加入100μlRNase溶液[10mg/ml RNase，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，15mmol/L NaCl]，混勻后冰浴10min。緩慢加入20ml新配制的溶液II
，輕輕混勻后于室溫放置5min。加入10ml用冰預(yù)冷的溶液III[5mol/L KAc60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml]，充分混勻內(nèi)容物后冰浴10min。4℃以12000rpm離心30min，取上清，加入0.6體積的異丙醇，室溫放置10min。室溫以12000rpm離心30min，用70％乙醇洗滌沉淀，用2ml TE(pH8.0)溶解沉淀，即得質(zhì)粒DNA粗品。將質(zhì)粒DNA粗品上DEAE纖維素DE52柱(φ1.6cm×30cm)，在TE(pH8.0)中以NaCl進行梯度洗脫，先用0.3mol/L NaCl將雜質(zhì)(如蛋白質(zhì)、低分子量RNA)洗脫除去，然后用0.6mol/L NaCl將質(zhì)粒DNA洗脫收集，并將收集液用兩倍體積的無水乙醇沉淀，離心所得沉淀即為純化質(zhì)粒DNA。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測純化的重組質(zhì)粒純度并進行定量。
實施例3抗高血壓核酸疫苗的血壓藥效學(xué)研究制作二腎一夾型腎性高血壓大鼠模型。取健康SD大鼠，體重180-220g，在水合氯醛的麻醉下，剪毛暴露左腎臟，用玻璃分針剝離腎動脈，套上U型夾縫合肌肉與毛皮，傷口用碘酒消毒并用砂布包裹分籠養(yǎng)，術(shù)后連續(xù)三天腹腔注射青霉素2-3萬單位/只，每天一次。半月后約每3-5天可以測血壓，首先連續(xù)測壓三次，凡是收縮壓高于160mmHG即得了腎性高血壓。
模型對照組和生理鹽水陰性對照組各8只。用無菌生理鹽水將核酸疫苗或載體質(zhì)粒稀釋成1μg/μL，在每只大鼠兩后肢脛骨前肌處各分別注射100μL核酸疫苗和20ul的白介素IV(pIL-4)核酸、載體質(zhì)?；蛏睇}水，即核酸疫苗實驗組和載體組接種量均為240μgDNA/只。以后每隔2周加強免疫一次，共進行5次免疫。初次免疫后每隔2周眼眶內(nèi)眥取血一次，血量為1.5ml，離心，取血清冷凍保存。用ELISA檢測血清中抗AngII抗體，ELISA結(jié)果見圖8，發(fā)現(xiàn)pCR3.1-X8-HBc-six ANG II和pIL-4按5∶1混合注射能誘發(fā)特異的抗Ang II的抗體，而且使大鼠的收縮壓降低20mmHg見附圖5，同時使大鼠的舒張壓降低10mmHg見附圖6(T檢驗P＜0.05)。
實施例4抗高血壓核酸疫苗的血壓藥效學(xué)研究產(chǎn)生腎性高血壓的大鼠給藥后，停藥后一個月處死。取心臟分離心臟左心室稱重，并計算左心室與體重比值。pCR3.1-X8-HBc-six ANG II和pIL-4按5∶1混合注射能減輕心肌肥厚程度(T檢驗p＜0.05)，檢測指標是左心室與體重的比值，見附圖7，pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+pIL-4共注射組左心室肥厚程度比高血壓模型對照組輕。切片檢測進一步證實了pCR3.1-X8-HBc-six ANGII+pIL-4共注射對心肌的保護作用見圖10。
圖10對免疫組，模型組，生理鹽水組的心肌進行了切片，發(fā)現(xiàn)免疫組的心肌與模型組的心肌相比，免疫組的心肌纖維增厚程度減弱，血管壁增厚有所抑制，心肌纖維組織增生有所抑制。
圖10中切片1為生理鹽水組，其纖維分布，走行無異常，血管壁無增厚未見心肌增厚。切片2，4為模型組，明顯心肌纖維增粗增厚，局部性萎縮，心肌間質(zhì)纖維組織增生，血管壁增厚，部分纖維化，心臟增大，心肌壁增厚。切片3，4，6為免疫組心肌纖維與模型組相比無明顯增厚，增粗；心肌間質(zhì)無明顯纖維組織增生，部分血管壁輕度增厚，心臟輕度增大。
權(quán)利要求
1.一種抗高血壓的核酸疫苗，其特征為含有編碼乙肝核心蛋白(HBc)的DNA序列，并在該HBc序列中引入編碼人源血管緊張素II多肽重復(fù)片斷(以下簡稱AngII)的DNA序列。該核酸疫苗質(zhì)粒與白介素4(pIL-4)聯(lián)合使用用于增強其免疫原性。
2.權(quán)利要求1所述的核酸疫苗，其特征為將一限制性內(nèi)切酶(AgeI)的識別位點引入HBc的第80-81位氨基酸所對應(yīng)的核苷酸序列中，用于插入外源表位六個重復(fù)AngII序列。重復(fù)的AngII序列插入后，經(jīng)轉(zhuǎn)染表達的融合蛋白仍能裝配成納米級顆粒，極大增強AngII的免疫原性。
3.權(quán)利要求2所述的核酸疫苗，其特征為HBc顆粒表面插入的抗原表位AngII，其氨基酸序列是Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe。
4.權(quán)利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于核酸疫苗與白介素4的真核表達質(zhì)粒混合后注射，可以誘導(dǎo)出針對血管緊張素II的高滴度抗體。白介素4可以特異性的增強體液免疫，并且增強機體對外原性物質(zhì)的免疫應(yīng)答，與該核酸疫苗聯(lián)用可以誘發(fā)極強的免疫應(yīng)答。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸疫苗，其特征在于免疫動物后能激發(fā)機體產(chǎn)生抗血管緊張素II多肽的抗體，通過該抗體與機體內(nèi)內(nèi)源的血管緊張素II結(jié)合，調(diào)節(jié)生物體血壓，減少心肌的灌注量，延緩心肌肥厚的形成，治療高血壓和心肌肥厚。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述核酸疫苗，其特征在于該核酸疫苗與白介素4真核質(zhì)粒按5∶1的比例混合，能產(chǎn)生較好的免疫刺激作用，減輕本核酸疫苗的細胞免疫帶來的副作用，增強體液免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對AngII的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗高血壓核酸疫苗，其特征在于可與其他藥物活性成分組合制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療高血壓的核酸疫苗及增強其藥效的方法。該核酸疫苗以乙肝核心蛋白為免疫載體，以及白介素4(IL－4)作為免疫佐劑，用以增強抗原表位血管緊張素II多肽的(ANG II)的免疫原性。該疫苗與白介素4共同作用下，誘發(fā)機體產(chǎn)生抗血管緊張素II的抗體，該抗體與內(nèi)原性血管緊張素II結(jié)合，抑制其活性，通過腎素－血管緊張素－醛固酮系統(tǒng)(RAS系統(tǒng))，降低血壓，保護心肌，減緩心肌肥厚等癥狀。
文檔編號A61K48/00GK1706502SQ20051004023
公開日2005年12月14日 申請日期2005年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月25日
發(fā)明者劉景晶, 吳若飛, 曹榮月, 劉文濤, 吳潔 申請人:中國藥科大學(xué)