專利名稱：一種適用于基因輸送的載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有效輸送基因的高分子載體及其制備方法。
二、技術(shù)背景基因治療是通過(guò)將正常的基因?qū)氚屑?xì)胞來(lái)彌補(bǔ)某些代謝酶基因的缺陷而達(dá)到治療的目的，它為治療人類疾病和輸送藥物提供了一條新的途徑，引起了人們的極大關(guān)注[Kevin R.Smith，“Archives of Medical Research”，第247-268頁(yè)(2003年)]。尋求安全有效的轉(zhuǎn)染模式一直是研究的核心。輸送基因的主要技術(shù)障礙是缺少理想的基因輸送的載體。只要足量的基因被輸送至靶細(xì)胞，就有可能取得良好的效果。現(xiàn)在已經(jīng)建立了轉(zhuǎn)基因的手段和策略，包括磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、質(zhì)脂體輸送、以及受體介導(dǎo)的基因輸送方式等，雖然它們已用于動(dòng)物的培養(yǎng)細(xì)胞，但是有效地將基因?qū)塍w內(nèi)的靶細(xì)胞還有一些困難。例如，用逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒做載體可以產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)染效率，特別是，逆轉(zhuǎn)錄病毒已經(jīng)成功地將外源基因?qū)牖钴S地分化細(xì)胞。但是，病毒載體易引發(fā)免疫炎癥和致癌等缺陷也限制了它在臨床的應(yīng)用[Vladislav A.Lanzov，“Molecular Genetics andMetabolism”，第276-282頁(yè)(1999年)]；質(zhì)脂體雖然相對(duì)于病毒載體有較低的免疫原性和易制備的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)細(xì)胞毒性大轉(zhuǎn)染率較低也是其主要缺點(diǎn)[Sang-ohHan等人，“Molecular Therapy”，第303頁(yè)(2000年)]。
聚陽(yáng)離子高分子有很多優(yōu)點(diǎn)，有希望成為基因輸送的最佳選擇。通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)條件可以獲得各種分子量大小的分子；許多活性官能團(tuán)可以偶連細(xì)胞特異性受體識(shí)別的配體，從而提高基因輸送的靶向性，也可能賦予載體良好的生理和理化性質(zhì)；靜電吸引可以使帶負(fù)電的DNA和帶正電的高分子形成納米復(fù)合物，它易被細(xì)胞吞噬，并保護(hù)DNA免受酶的降解；低成本和易制備也是其優(yōu)點(diǎn)。
目前，作為非病毒載體的聚陽(yáng)離子高分子有以下幾種聚乙烯亞胺(PEI)[Bettinger T等人，“Bioconjugation Chemistry”，第558-561頁(yè)(1999年)]是目前研究最多的載體，它容易制備、能攜帶大量的DNA，有較高的轉(zhuǎn)染效率，但是它毒性較大，且在體內(nèi)不能降解；多聚賴氨酸[Wu G等，“Journal ofbiological chemistry”，262卷，第4429-4432頁(yè)(1987年)]是一種多肽型的載體，它有良好的生物相容性和生物可降解性，但是，它在生理pH條件下，溶解性差，而且毒性較大，制備困難，價(jià)格較貴；殼多糖是唯一天然的聚陽(yáng)離子高分子，分布廣泛，生物相溶性好，無(wú)毒無(wú)副作用，但是它較難溶于水，轉(zhuǎn)染效率不如PEI[Koping-Hoggard，“Gene Therapy”，第1108-1112(2001年)]。
一種理想的基因輸送載體應(yīng)該具備以下條件1，良好的生物相容性；2，能有效結(jié)合DNA；3，無(wú)毒，無(wú)致癌作用；4，低粘度，水溶性好，容易為細(xì)胞所攝??；5，易制備，成本低。
目前，以天冬氨酸為原料合成的生物材料有以下幾種α，β-poly(N-2-hydroxyethyl)-D，L-aspartamide(PHEA)[Paolo Neri，“MedicalChemistry”，第893-899(1973年)]，是一種良好的血漿替代品和非離子型藥物載體[G.Pitarresi，“Biomaterial”，第4333-4343(2004年)]，其結(jié)構(gòu)式如下 它是一種中性大分子，不適合輸送DNA；另外一種是a，β-polyasparthylhydrazide(PAHy)[Gaetano iammona，“PolymerInternational”，第93-98(2000年)]，是一種新的聚陽(yáng)離子載體，其結(jié)構(gòu)式如下 其合成要用到無(wú)水的肼，肼易燃易爆，操作困難；另外，分子鏈上的伯胺基攜帶DNA能力較弱。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是要公開(kāi)一種用于基因輸送的載體聚陽(yáng)離子高分子化合物(PDAI)及其制備方法，它包括原料聚天冬氨酸和3-二甲氨基丙胺及溶劑N，N-二甲基甲酰胺。
本發(fā)明的方案為1、載體的結(jié)構(gòu)本發(fā)明所述用于基因輸送的載體是含有叔氨基的聚天冬氨酸的陽(yáng)離子衍生物，分子量為12萬(wàn)，其結(jié)構(gòu)式 2、載體的合成方法及反應(yīng)條件用磷酸做催化劑，在高溫下，天冬氨酸聚合成為聚天冬酰胺；聚天冬酰胺再與3-二甲氨基丙胺反應(yīng)，用透析提純，最后冷凍干燥，獲得產(chǎn)物PDAI。其合成路線為
3、載體的分子量及叔氨基含量測(cè)定方法采用高效凝膠過(guò)濾色譜和染料比色法。
4、載體的毒性評(píng)價(jià)將L929、Hela和HepG2三種細(xì)胞分別在含有PDAI的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用MTT法，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
5、載體的轉(zhuǎn)染效率用β-半乳糖苷酶的基因作為報(bào)告基因，將質(zhì)粒DNA與PDAI復(fù)合，選擇L929、Hela和HepG2三種細(xì)胞為考察對(duì)象，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶表達(dá)量來(lái)衡量PDAI的轉(zhuǎn)染效果。
本發(fā)明合成了一種新的生物降解性聚陽(yáng)離子高分子化合物(PDAI)，其優(yōu)點(diǎn)是合成步驟簡(jiǎn)單，操作容易，安全性高，不需要特殊的設(shè)備和通風(fēng)條件；其結(jié)構(gòu)的骨架依然是聚天冬氨酸，但側(cè)鏈上引入了叔氨基團(tuán)，它比伯氨基團(tuán)更容易結(jié)合質(zhì)子，攜帶陽(yáng)離子的能力更大。
本發(fā)明通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的摸索，一方面，很好的解決了氨基含量影響載體毒性的問(wèn)題；另一方面，選擇天冬氨酸為原料，具有極好的生物相容性，本發(fā)明滿足一款理想的基因輸送載體的應(yīng)當(dāng)具備的條件，達(dá)到了更好的輸送效果和更高的安全性。
四

圖1為PDAI的分子量測(cè)定。
圖2為PDAI的紅外圖譜。
圖3為PDAI的核磁共振圖譜。
圖4為PDAI的叔氨基含量測(cè)定。
圖5(a)、(b)和(c)為PDAI對(duì)L929、Hela和HepG2三種細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖6(a)、(b)和(c)為PDAI對(duì)L929、Hela和HepG2三種細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
五具體實(shí)施例方式
1、載體PDAI的制備將13.1克的天冬氨酸放入圓底燒瓶中，與5ml的85％的H3PO4混合，將燒瓶安裝在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，維持減壓狀態(tài)在180℃用油浴加熱4小時(shí)。將產(chǎn)物溶于100ml的N，N-二甲基甲酰胺中，然后加入200mL的水，使產(chǎn)物沉淀析出，離心，棄上清；用水洗滌沉淀，直到顯中性。加熱去除水分。
將1.5克的聚天冬氨酸溶于8ml二甲基甲酰胺(DMF)中，加入0.04mol的3-二甲氨基丙胺，室溫?cái)嚢?4小時(shí)，用0.1mol/l的醋酸調(diào)pH＝7，用純凈水透析后冷凍干燥。
2、PDAI的理化性質(zhì)測(cè)定用高效凝膠液相色譜測(cè)定PDAI的分子量，用DMF做流動(dòng)相，流速0.5ml/l，用細(xì)胞色素C(13000Da)、牛血清蛋白(67000Da)、β-半乳糖苷酶(116000Da)和堿性磷酸酯酶(140000Da)做對(duì)照品，以洗脫體積(Ve)和分子量的對(duì)數(shù)(LogMr)做回歸直線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，將PDAI的洗脫體積代入回歸方程，求得分子量為120000Da。
叔氨基含量可以用Xylidine Tobceau 2R染料的比色滴定法測(cè)定，XylidineTobceau 2R是帶負(fù)電荷的染料，含兩個(gè)磺酸基團(tuán)，每個(gè)染料分子可與兩個(gè)正電荷結(jié)合，從而使其最大吸收峰(OD505)的OD值會(huì)隨著體系中叔氨基的濃度上升而下降，達(dá)到一個(gè)最小值，即染料分子全部反應(yīng)后，氨基濃度雖然上升而體系的OD值不變，以O(shè)D值為Y軸，體系中PDAI溶液的體積為X軸作圖，得到兩條直線，這兩條直線的交點(diǎn)的X值就是含有與體系中染料的陰離子數(shù)目相等帶正電荷的PDAI的體積，由此可以推斷出PDAI的叔氨基的百分含量。
用0.1mol/l的醋酸為溶劑，準(zhǔn)確配制1mmol/l染料溶液以及40μg/ml的PDAI溶液，將不同體積的PDAI溶液與一定體積的染料溶液相混合均勻，靜置15分鐘后，在505nm測(cè)吸光度，求得叔氨基含量是52％。
用紅外光譜和核磁共振確認(rèn)PDAI的結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。
3、PDAI對(duì)L929細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)將96孔板在75％的酒精中浸泡過(guò)夜；在超凈臺(tái)中吹干，紫外殺菌；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，用胰酶消化，以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種96孔板，100μl/孔，培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞貼壁，除去培液，1×PBS清洗，每孔加100μl含不同量(10～100μg)的PDAI無(wú)血清培液，培養(yǎng)24小時(shí)；吸棄培液，每孔加入100μl的無(wú)血清培養(yǎng)液和20μl的5mg/ml的MTT溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)；小心吸棄孔內(nèi)培液，每孔加150μiDMSO，室溫培育30min；輕輕振動(dòng)后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)每孔490nm的光吸收值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
研究發(fā)現(xiàn)，PDAI對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，PDAI幾乎沒(méi)什么毒性。
4、PDAI對(duì)Hela細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)選擇Hela細(xì)胞為考察對(duì)象，具體步驟同實(shí)施例3。
將96孔板在75％的酒精中浸泡過(guò)夜；在超凈臺(tái)中吹干，紫外殺菌；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，用胰酶消化，以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種96孔板，100μl/孔，培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞貼壁，除去培液，1×PBS清洗，每孔加100μl含不同量(10～100μg)的PDAI無(wú)血清培液，用磷酸鈣和PHEA做對(duì)照，培養(yǎng)24小時(shí)；吸棄培液，每孔加入100μl的無(wú)血清培養(yǎng)液和20μl的5mg/ml的MTT溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)；小心吸棄孔內(nèi)培液，每孔加150μlDMSO，室溫培育30min；輕輕振動(dòng)后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)每孔490nm的光吸收值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
PDAI對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，PDAI幾乎沒(méi)什么毒性，而且有促進(jìn)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的趨勢(shì)。
5、PDAI對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性評(píng)價(jià)選擇HepG2細(xì)胞為考察對(duì)象，具體步驟同同實(shí)施例3。
將96孔板在75％的酒精中浸泡過(guò)夜；在超凈臺(tái)中吹干，紫外殺菌；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用胰酶消化，以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種96孔板，100μl/孔，培養(yǎng)過(guò)夜；待細(xì)胞貼壁，除去培液，1×PBS清洗，每孔加100μl含不同量(10～100μg)的PDAI無(wú)血清培液，用磷酸鈣和PHEA做對(duì)照，培養(yǎng)24小時(shí)；吸棄培液，每孔加入100μl的無(wú)血清培養(yǎng)液和20μl的5mg/ml的MTT溶液，37℃反應(yīng)4小時(shí)；小心吸棄孔內(nèi)培液，每孔加150μlDMSO，室溫培育30min；輕輕振動(dòng)后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)每孔490nm的光吸收值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
PDAI對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)影響較小，PDAI幾乎沒(méi)什么毒性，而且有促進(jìn)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的趨勢(shì)。
通過(guò)四唑鹽(MTT)比色法測(cè)定，并與血漿替代物PHEA、磷酸鈣復(fù)合物進(jìn)行比較。MTT細(xì)胞毒性證明PDAI該載體的細(xì)胞毒性比脂質(zhì)體(數(shù)據(jù)未給出)和磷酸鈣復(fù)合物低得多，生物相容性很好。
6、PDAI對(duì)L929細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染評(píng)價(jià)培養(yǎng)L929細(xì)胞40小時(shí)左右，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液加入到含有300μl裸β-gal質(zhì)粒儲(chǔ)液的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)6小時(shí)；倒出培養(yǎng)瓶中的廢液，1×PBS沖洗，重新加入2ml含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-48小時(shí)；收集細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；用紫外分光光度計(jì)測(cè)酶活性。
培養(yǎng)L929細(xì)胞40小時(shí)左右，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將分別含有400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml PDAI的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液加入到含有300μl β-gal儲(chǔ)液的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，使陽(yáng)離子載體的終濃度為200μg/ml；將細(xì)胞放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)6小時(shí)；倒出培養(yǎng)瓶中的廢液，1×PBS沖洗，重新加入2ml含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-48小時(shí)；收集細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；用紫外分光光度計(jì)測(cè)酶活性。
為確定PDAI載體/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的最優(yōu)質(zhì)量比，我們用不同質(zhì)量比的復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，其結(jié)果見(jiàn)附圖6(a)。從圖中可以看出，在載體/DNA質(zhì)量比是1-5的范圍內(nèi)，該材料介導(dǎo)的L929細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與裸質(zhì)粒無(wú)明顯提高，但當(dāng)質(zhì)量比為6時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，高達(dá)50％。
7、PDAI對(duì)Hela細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染評(píng)價(jià)選擇Hela細(xì)胞為考察對(duì)象，具體步驟同實(shí)施例6。
培養(yǎng)Hela細(xì)胞40小時(shí)左右，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液加入到含有300μl裸β-gal質(zhì)粒儲(chǔ)液的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)6小時(shí)；倒出培養(yǎng)瓶中的廢液，1×PBS沖洗，重新加入2ml含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-48小時(shí)；收集細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；用紫外分光光度計(jì)測(cè)酶活性。
培養(yǎng)Hela細(xì)胞40小時(shí)左右，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將分別含有400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml PDAI的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液加入到含有300μl β-gal儲(chǔ)液的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，使陽(yáng)離子載體的終濃度為200μg/ml；將細(xì)胞放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)6小時(shí)；倒出培養(yǎng)瓶中的廢液，1×PBS沖洗，重新加入2ml含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-48小時(shí)；收集細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；用紫外分光光度計(jì)測(cè)酶活性。
為確定PDAI載體/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的最優(yōu)質(zhì)量比，我們用不同質(zhì)量比的復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，其結(jié)果見(jiàn)附圖6(b)。從圖中可以看出，在載體/DNA質(zhì)量比是1-6范圍內(nèi)，該材料介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率比裸質(zhì)粒提高2倍左右。
8、PDAI對(duì)HepG2細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染評(píng)價(jià)選擇HepG2細(xì)胞為考察對(duì)象，具體步驟同實(shí)施例6。
培養(yǎng)HepG2細(xì)胞40小時(shí)左右，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液加入到含有300μl裸β-gal質(zhì)粒儲(chǔ)液的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，將細(xì)胞放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)6小時(shí)；倒出培養(yǎng)瓶中的廢液，1×PBS沖洗，重新加入2ml含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-48小時(shí)；收集細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；用紫外分光光度計(jì)測(cè)酶活性。
培養(yǎng)HepG2細(xì)胞40小時(shí)左右，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；將分別含有400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml PDAI的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液加入到含有300μl β-gal儲(chǔ)液的1ml無(wú)血清1640培養(yǎng)液中，使陽(yáng)離子載體的終濃度為200μg/ml；將細(xì)胞放入37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)6小時(shí)；倒出培養(yǎng)瓶中的廢液，1×PBS沖洗，重新加入2ml含血清的1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24-48小時(shí)；收集細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；用紫外分光光度計(jì)測(cè)酶活性。
為確定PDAI載體/DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染的最優(yōu)質(zhì)量比，我們用不同質(zhì)量比的復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，其結(jié)果見(jiàn)附圖7(c)。從圖中可以看出，在載體/DNA質(zhì)量比是6時(shí)，該材料介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率有明顯提高，特別是在3∶1的時(shí)候最高；而當(dāng)質(zhì)量比6∶1之后，轉(zhuǎn)染效率明顯降低可能是因?yàn)檫^(guò)多的正電荷使得HepG2細(xì)胞的死亡率增高，降低了轉(zhuǎn)染效率的緣故。
研究表明，本發(fā)明對(duì)動(dòng)物細(xì)胞安全有效，有較高的轉(zhuǎn)染效率。
權(quán)利要求
1.一種用于基因輸送的載體，其特征在于載體含有叔氨基的聚天冬氨酸的陽(yáng)離子衍生物，分子量為12萬(wàn)，其結(jié)構(gòu)為
2.一種權(quán)利要求1所述載體的制備方法，其特征是按以下步驟進(jìn)行將聚天冬氨酸溶于DMF中，加入適量3-二甲氨基丙胺，室溫?cái)嚢?，用醋酸溶液調(diào)pH＝7，用純凈水透析后冷凍干燥，合成路線為
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因輸送載體及其制備方法，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是含有叔氨基的聚天冬酰氨的衍生物，分子量約為12萬(wàn)。該載體用于基因輸送，具有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)具有優(yōu)良的生物相容性和低毒性，并能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)A61K47/34GK1706500SQ20051004026
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月27日
發(fā)明者張峻峰, 薛偉華, 魯維飛, 刁華佳 申請(qǐng)人:南京大學(xué)