專利名稱：2,2’－二吡啶n－氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及2，2’-二吡啶N-氧化物二硫的新用途，具體涉及2，2’-二吡啶N-氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
20世紀70年代至20世紀80年代，我國惡性腫瘤發(fā)病率明顯上升，腫瘤成為嚴重危害人類生命的主要疾病之一。根據(jù)國家衛(wèi)生部相關統(tǒng)計資料表明，在我國，每年新增腫瘤病人200萬人，因腫瘤而死的人數(shù)高達130萬多人/年，目前全國腫瘤患者總數(shù)已達450萬人。隨著人口老齡化、吸煙人數(shù)增多、體育運動減少、飲食中缺少蔬菜水果等不良習慣可能進一步導致癌癥患者人數(shù)猛增。世界衛(wèi)生組織國際腫瘤研究中心近期公布的一份研究報告亦指出，根據(jù)目前腫瘤的發(fā)病趨勢，2020年全世界腫瘤發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50％。腫瘤死亡率呈明顯上升趨勢。可以預見，隨著腫瘤發(fā)病率的增長，對抗腫瘤藥物的需求將進一步增加。
我國抗腫瘤藥物的研究生產(chǎn)始于20世紀50年代末，目前國內(nèi)市場上普遍使用的抗腫瘤藥物多數(shù)屬化學合成藥(化療藥)，其中常用臨床藥包括烷化劑類、抗代謝劑和阿霉素、絲裂霉素等等。這些藥物的藥理作用基本上都是細胞毒性藥物。阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。無機金屬--鉑的絡合物是另一類常用的抗癌藥品，其中最常用的是順鉑，本品屬細胞周期非特異性藥物，具有細胞毒性，可抑制癌細胞的DNA復制過程，并損傷其細胞膜上結構，有較強的廣譜抗癌作用。但毒性較大，即使在低劑量下也會使人惡心、嘔吐，對人的腎臟也會造成一定的損害。
目前的抗腫瘤藥物存在一定的缺陷，許多藥物用量較大，在毒殺腫瘤細胞的同時對正常組織細胞也有一定的殺傷作用，提高抗癌化療藥物的藥效和降低藥物對正常組織細胞的毒性是各國科學家一直不斷努力的研究目標。
2，2’-二吡啶N-氧化物二硫(PTS2)是由兩個1-羥基-2-吡啶硫酮(PT)分子之間的巰基連在一起的化合物。結構式如式I 式I1-羥基-2-吡啶硫酮(PT)是在50年代初由Shaw等首次合成。2，2’-二吡啶N-氧化物二硫(PTS2)也已經(jīng)被合成。已有研究表明PTS2對多種細菌和真菌有強效抑制作用，作為高效光譜的防霉抗菌劑在國內(nèi)外廣泛應用，作為外用抗菌劑對治療皮膚癬菌病，痤瘡，脂溢性皮膚病和止癢去頭屑有滿意的效果。但目前尚無發(fā)現(xiàn)PTS2在抗腫瘤方面的應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種2，2’-二吡啶N-氧化物二硫的新用途，即2，2’-二吡啶N-氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明的技術方案是2，2’-二吡啶N-氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本發(fā)明的有益效果是，提供了2，2’-二吡啶N-氧化物二硫的新用途，為腫瘤的治療找到新型有效藥物，2，2’-二吡啶N-氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中應用，不僅能夠有效抑殺腫瘤細胞；而且對正常細胞的細胞毒作用??；相對于現(xiàn)在臨床上經(jīng)常使用的抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素，本發(fā)明對腫瘤細胞的毒殺作用更明顯，藥物的起效劑量較低，藥物發(fā)揮藥效所需時間較短。


圖1是PTS2處理過的細胞形態(tài)照片其中1.經(jīng)DMSO處理過的HEK293細胞形態(tài)2.經(jīng)PTS2處理過的HEK293細胞形態(tài)3.經(jīng)DMSO處理過的Hela細胞形態(tài)4.經(jīng)PTS2處理過的Hela細胞形態(tài)5.經(jīng)DMSO處理過的231細胞形態(tài)6.經(jīng)PTS2處理過的231細胞形態(tài)7.經(jīng)DMSO處理過的KB細胞形態(tài)8.經(jīng)PTS2處理過的KB細胞形態(tài)9.經(jīng)DMSO處理過的U937細胞形態(tài)10.經(jīng)PTS2處理過的U937細胞形態(tài)11.經(jīng)DMSO處理過的K562細胞形態(tài)12.經(jīng)PTS2處理過的K562細胞形態(tài)。
圖2是PTS2處理后腫瘤細胞的凋亡情況其中1.經(jīng)DMSO處理過的HEK293細胞核染色2.經(jīng)PTS2處理過的HEK293細胞核染色3.經(jīng)DMSO處理過的Hela細胞核染色4.經(jīng)PTS2處理過的He1a細胞核染色5.經(jīng)DMSO處理過的231細胞核染色6.經(jīng)PTS2處理過的231細胞核染色7.經(jīng)DMSO處理過的KB細胞核染色8.經(jīng)PTS2處理過的KB細胞核染色9.經(jīng)DMSO處理過的U937細胞核染色10.經(jīng)PTS2處理過的U937細胞核染色11.經(jīng)DMSO處理過的K562細胞核染色12.經(jīng)PTS2處理過的K562細胞核染色。
圖3是MTT法測定PTS2對腫瘤細胞的毒殺作用。
圖4是PTS2與PT、順鉑和阿霉素對腫瘤細胞的毒殺作用效果比較。
圖5是比較PTS2與順鉑、阿霉素對腫瘤細胞毒殺作用時間依賴的細胞形態(tài)，其中1，7，13是經(jīng)DMSO處理的Hela細胞形態(tài)2，8，14是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后3h Hela細胞形態(tài)
3，9，15是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后6h Hela細胞形態(tài)4，10，16是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后12h Hela細胞形態(tài)5，11，17是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后24h Hela細胞形態(tài)6，12，18是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后36h Hela細胞形態(tài)。
圖6是比較PTS2與順鉑、阿霉素對腫瘤細胞毒殺作用的起效時間。
具體實施例方式
實施例1MTT法檢測PTS2對腫瘤細胞的殺傷作用1)實驗原理活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解，將MTT(一種淡黃色的唑氮鹽)分解為蘭紫色的甲(formaZan)結晶而顯色，應用酶標儀測定特定波長下的吸光度，其光密度值能夠反映細胞的增殖情況。MTT法是一種快速，簡便的能夠半自動化定量分析細胞增值及藥物細胞毒作用的方法。
2)實驗儀器與材料ELX-800酶標儀購于BIO-TEC公司PTS2使用前用DMSO配制為5mg/ml的溶液MTT(Sigma)使用時用1XPBS配制為5mg/ml的溶液DMSO(Amresco)培養(yǎng)液DMEM(GIBCO) RPMI1640(GIBCO)血清四季青胎牛血清96孔板(Greiner)細胞系HEK293，Hela，KB，231，U937，K562購于中科院上海細胞所3)實驗步驟將HEK293，Hela，KB，231，U937，K562細胞分別以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。細胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)。HEK293，Hela在DMEM中培養(yǎng)，KB，231，U937，K562在RPMI1640中培養(yǎng)，10％胎牛血清。用當細胞密度達到70-80％時，加入終濃度為2.50μg/ml的PTS2，以經(jīng)DMSO處理的細胞為對陰性照組，每種細胞設三個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)36小時后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)15μl，4h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液(150μl)，吸打溶解紫色結晶，繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘，到結晶紫充分溶解。酶標儀570nm處測定吸光度。
細胞存活率按下式計算細胞存活率＝實驗組OD值/空白對照組OD值×100％數(shù)據(jù)統(tǒng)計以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用t檢驗。
4)實驗結果由圖1可以看出經(jīng)DMSO處理的細胞形態(tài)正常(圖1中的1、3、5、7、9、11)，經(jīng)PTS2處理過的HEK293細胞形態(tài)(圖1中的2)無明顯變化，而其他腫瘤細胞呈現(xiàn)明顯的死亡形態(tài)(圖1中的4、6、8、10、12)，大部分細胞脫落而懸浮于培養(yǎng)液中，細胞形態(tài)變圓折。MTT結果如表1和圖3顯示經(jīng)PTS2處理的腫瘤細胞增殖下降，細胞存活率明顯降低，而對正常細胞的增殖影響不大，存活率無明顯變化。此實驗結果說明PTS2對腫瘤細胞有強烈的抑殺作用，而對正常細胞的毒性卻相對較小。
表1.PTS2對腫瘤細胞的毒殺作用 將對照組細胞存活率設為100％，結果由均值±標準差表示，***P＜0.01，與對照組比較。實驗重復三次。
實施例2Hoechst染色法檢測經(jīng)PTS2處理后腫瘤細胞的凋亡情況1)實驗原理Hoechst33258是與DNA特異結合的活性染料，DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大得細胞毒作用。是一種快速簡便的細胞凋亡檢測方法。
2)實驗儀器與材料Nikon熒光顯微鏡Hoechst33258(Sigma)使用時配制成1mg/ml的溶液固定液配制甲醇∶乙酸＝3∶1培養(yǎng)液DMEM(GIBCO) RPMI1640(GIBCO)血清四季青胎牛血清細胞系HEK293，Hela，KB，231，U937，K562購于中科院上海細胞所3)實驗步驟將普通蓋玻片于2M NaOH中浸泡4小時，然后用清水沖洗干凈，將其浸泡于70％乙醇中，在無菌超凈臺內(nèi)吹干，再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi)，種入細胞過夜。HEK293，Hela在DMEM中培養(yǎng)，KB，231，U937，K562在RPMI1640中培養(yǎng)，10％胎牛血清。37℃，5％CO2。當細胞密度達到70-80％時，加入終濃度為2.50μg/ml的PTS2，以經(jīng)DMSO處理的細胞為對陰性照組，每種細胞設三個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)36小時后，吸干培養(yǎng)液，加入0.5ml固定液，4℃固定10分鐘。去除固定液，用PBS洗三遍，每次3分鐘，洗滌時用搖床晃動。吸盡液體，然后加入0.5ml Hoechst33258染色液，4℃染色5分鐘，去除染色液，用PBS洗三遍，每次3分鐘，洗滌時用搖床晃動。吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，盡量避免氣泡。使細胞接觸封片液，熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。激發(fā)波長在350nm左右，發(fā)射波長在460nm左右。4)實驗結果結果如圖2，細胞經(jīng)Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下見陰性對照組(圖2中的1、3、5、7、9、11)和經(jīng)PTS2處理過的HEK293(圖2中的2)大部分細胞胞膜完整，胞質(zhì)豐富核形態(tài)飽滿表現(xiàn)為彌散均勻的藍色熒光。而PTS2處理過的腫瘤細胞組(圖2中的4、6、8、10、12)可見核體積縮小，熒光染色增強，染色質(zhì)呈致密濃染的塊狀或顆粒狀熒光以及凋亡小體形成，呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征。結果說明一定劑量下，PTS2對腫瘤細胞有效的殺傷作用，而對正常細胞沒有太大影響。
實施例3MTT法比較PTS2與PT、順鉑和阿霉素對腫瘤細胞的毒殺作用1)實驗材料ELX-800酶標儀購于BIO-TEC公司PTS2使用前用DMSO配制為5mg/ml的溶液MTT(Sigma)使用時用1XPBS配制為5mg/ml的溶液DMSO(Amresco)順鉑(齊魯制藥有限公司)使用時用DMSO配制為5mg/ml的溶液阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)使用時用DMSO配制為5mg/ml的溶液培養(yǎng)液DMEM(GIBCO) RPMI1640(GIBCO)血清四季青胎牛血清96孔板(Greiner)細胞系Hela購于中科院上海細胞所2)實驗步驟將Hela細胞以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。細胞在37℃，5％CO2培養(yǎng)，Hela在DMEM中培養(yǎng)，10％胎牛血清，37℃，5％CO2。當細胞密度達到70-80％時，按照不同的濃度梯度(0.25μg/ml，0.5μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml，5.0μg/ml)分別加入PTS2、PT、順鉑和阿霉素。以經(jīng)DMSO處理的細胞為對陰性照組。每個濃度設三個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)36小時后每孔加入MTT溶液(5mg/ml)15μl，4 h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液(150μl)，吸打溶解紫色結晶，繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘，到結晶紫充分溶解。酶標儀570nm處測定吸光度。
細胞存活率按下式計算細胞存活率＝實驗組OD值/空白對照組OD值×100％數(shù)據(jù)統(tǒng)計以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用t檢驗。
3)實驗結果結果如表2和圖4所示，經(jīng)PT處理過的細胞的存活率幾乎不受任何影響，經(jīng)順鉑和阿霉素處理過的細胞存活率稍微下降，而PTS2能顯著抑制腫瘤細胞的增殖，經(jīng)PTS2處理過的細胞的存活率明顯下降。結果說明PTS2毒殺腫瘤細胞的作用不是通過其前體PT發(fā)揮的，而是PTS2本身具有殺傷腫瘤細胞的能力。相對于目前臨床上常用的抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素，PTS2對腫瘤細胞的抑殺效果更為明顯，藥物使用有效劑量少。
表2.PTS2與PT、順鉑和阿霉素對腫瘤細胞的毒殺作用效果比較 將對照組細胞存活率設為100％，結果由均值±標準差表示，***P＜0.01，**P＜0.05，與對照組比較。實驗重復三次。
實施例4MTT法比較PTS2與順鉑、阿霉素對腫瘤細胞毒殺作用的起效時間1)實驗材料ELX-800酶標儀購于BIO-TEC公司PTS2使用前用DMSO配制為5mg/ml的溶液MTT(購于Sigma公司)使用時用1XPBS配制為5mg/ml的溶液DMSO(購于Amresco公司)順鉑(齊魯制藥有限公司)使用時用DMSO配制為5mg/ml的溶液阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司)使用時用DMSO配制為5mg/ml的溶液培養(yǎng)液DMEM(GIBCO)血清四季青胎牛血清96孔板(購于Greiner公司)細胞系Hela購于中科院上海細胞所2)實驗步驟
將Hela細胞以5000-10000個/孔的密度接種于96孔板。細胞在DMEM中，10％胎牛血清，37℃，5％CO2培養(yǎng)，當細胞密度達到70-80％時，分別加入終濃度為2.5μg/ml的PTS2、順鉑和阿霉素，以經(jīng)DMSO處理的細胞為對陰性照組。繼續(xù)培養(yǎng)3小時后每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)15μl，4h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液(150μl)，吸打溶解紫色結晶，繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘，到結晶紫充分溶解。酶標儀570 nm處測定吸光度。同樣方法測定藥物處理后6小時，12小時，24小時，36小時的細胞存活率。每種藥物的每個時間樣品均設三個復孔。
細胞存活率按下式計算細胞存活率＝實驗組OD值/空白對照組OD值×100％數(shù)據(jù)統(tǒng)計以均數(shù)±標準差(x±s)表示，采用t檢驗。
3)實驗結果如圖5，其中1，7，13是經(jīng)DMSO處理的Hela細胞形態(tài)(陰性對照組)，2，8，14是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后3h Hela細胞形態(tài)，3，9，15是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后6h Hela細胞形態(tài)，4，10，16是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后12h Hela細胞形態(tài)，5，11，17是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后24h Hela細胞形態(tài)，6，12，18是分別經(jīng)PTS2，順鉑，阿霉素處理后36h Hela細胞形態(tài)，如圖5所示，陰性對照組Hela細胞，貼壁生長核膜核仁輪廓明顯，形態(tài)正常。經(jīng)PTS2處理3小時后，各組的細胞的細胞形態(tài)沒有明顯變化，但增殖已被抑制；6小時后，經(jīng)PTS2處理后的細胞開始呈現(xiàn)死亡形態(tài)，細胞開始由貼壁而脫落，36h后脫落更明顯，大部分細胞懸浮于培養(yǎng)液中，細胞形態(tài)變圓折。而同樣劑量的順鉑和阿霉素處理過的細胞24h內(nèi)無明顯變化，直到36h細胞形態(tài)才發(fā)生變化。MTT結果如表3和圖6顯示經(jīng)藥物處理3小時后，細胞的存活率不受影響；6小時后，經(jīng)PTS2處理后的細胞開始呈現(xiàn)死亡形態(tài)，存活率開始下降，而經(jīng)順鉑和阿霉素處理后的細胞的存活率沒有明顯變化；24小時后順鉑處理后的細胞存活率開始下降，而經(jīng)阿霉素處理的細胞存活率直到36小時后才開始下降。實驗結果說明在一定劑量下，PTS2毒殺腫瘤細胞的起效時間較順鉑和阿霉素短。
表3.比較PTS2與順鉑和阿霉素對Hela細胞毒殺作用的起效時間 將對照組細胞存活率設為100％，結果由均值±標準差表示，***P＜0.01，**P＜0.05，與對照組比較。實驗重復三次。
權利要求
1.2，2’-二吡啶N-氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及2，2’－二吡啶N－氧化物二硫的新用途，具體是2，2’－二吡啶N－氧化物二硫在制備抗腫瘤藥物中的應用。2，2’－二吡啶N－氧化物二硫能夠有效抑殺腫瘤細胞；而且對正常細胞的細胞毒作用??；相對于目前經(jīng)常使用的抗腫瘤藥物順鉑和阿霉素，對腫瘤細胞的毒殺作用更明顯，藥物的起效劑量較低，藥物發(fā)揮藥效所需時間較短，可應用于制備臨床治療腫瘤的藥物中。
文檔編號A61K31/444GK1709250SQ20051004044
公開日2005年12月21日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權日2005年6月9日
發(fā)明者殷志敏, 牛德仲, 蔣繼宏, 樊玉梅 申請人:南京師范大學