專利名稱：丹參和葛根素的藥用組合物的制作方法
專利說明丹參和葛根素的藥用組合物 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，涉及一種由丹參和葛根素制成的藥物組合物，以及含有該藥物組合物的制劑及其制備方法。心腦血管疾病一直號稱威脅人類健康的頭號殺手，據有關調查報告顯示，我國每年死于心腦血管病的人有300多萬，占我國每年總死亡人數(shù)的50％，而患病幸存下來的人75％不同程度喪失勞動能力，4％重殘。特別是其發(fā)病和死亡的年齡日益呈年輕化趨勢，如何有效防治也就引起人們的高度重視。
心腦血管疾病包括冠心病、心絞痛、心肌梗塞，瘀血型肺心病，缺血性腦病、腦血栓、高血壓、高血脂等。這些疾病的主要發(fā)病原因是動脈硬化造成管腔狹窄、管道阻塞，從而導致心腦供血不足，才引起頭沉、頭暈、頭痛、胸悶等癥狀，嚴重者可導致腦中風及心肌梗塞的發(fā)生。心腦缺血后影響能量代謝，繼發(fā)乳酸堆積、鈣超載、自由基損傷等多種變化。多靶點逆轉或改善這些變化，提高綜合療效是藥物治療的重要目標。
丹參是唇形科植物丹參的干燥根及根莖，它具有多方面的藥理作用對心血管系統(tǒng)可增加冠脈流量，降低心肌興奮性和傳導性，改善微循環(huán)，抗血小板的聚集和血栓的形成，使血液粘度下降，抗氧化，增加耐氧能力，抗菌消炎，改善腎功能，對腦組織缺血和在灌注損傷的保護等作用。丹參的有效成分可分為脂溶性的和水溶性的，其中，脂溶性成分有丹參酮I、丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮等；水溶性成分有丹參素鈉、原兒茶酸、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C等?？偟⒎铀釣榈⒒钛龅挠行С煞郑渲械し铀酈鎂鹽的作用最強。
葛根素系由豆科植物野葛的干燥根中提取，分離得到的8-β-D-葡萄吡喃糖-4′，7-二羥基異黃酮。，已收載入國家藥典2000年版2002年增補本二部(新增)第1冊77頁，其中規(guī)定含C21H20O9不得少于97.0％。葛根素目前已有多家生產上市。用葛根治療一般疾病，早在我國古代的醫(yī)學著作《本經》、《傷寒雜病記》和《醫(yī)學大辭典》中就有記載。葛根素在心血管系統(tǒng)具有增加心肌血流量，改善心肌供應，降低血小板聚集及血液粘度，改變心肌細胞自律性，延長不應期，使失常的心率得到改善等重要作用。廣泛用于冠心病、肺心病、腦梗塞等治療。作為改善心腦血管循環(huán)的新藥，葛根素毒性小、安全范圍廣、療效好而極具臨床應用價值。
現(xiàn)代藥理及藥效學研究都表明丹參及葛根素在治療心腦血管疾病方面有較好的功效。目前已有單一有效成分的注射劑上市，如葛根素注射液、丹參注射液等單有效成分的注射劑。這種單一有效成分的制劑，便于控制質量、控制用藥，但失去了中藥復方中各有效成分協(xié)同作用的優(yōu)點。
因此，有必要研制一種有效成分確定且含量準確的復方制劑。而且，利用丹參及葛根素相互作用，配伍組方治療心腦血管疾病的藥物，還未見報道。本發(fā)明的目的是提供一種治療心腦血管疾病的藥物，它由以下重量配比的藥物制成丹參1500～15000份；葛根素100～1000份。優(yōu)選丹參2500～10000份；葛根素120～400份。最佳優(yōu)選丹參5000份；葛根素150份。
以上組成，若以克為單位，可以制成100～1000次用量的制劑，如作為注射劑，可制成1000支，每次用量1～10支。如作為片劑，可制成1000片，每次服用1～10片。
以上組成是按重量比作為配比的，在生產時可按照相應比例增大或減小，如大規(guī)模生產可以以千克為原料，或以噸為單位，小規(guī)模生產也可以以克為單位，重量可以增大或者減小，但各組成之間重量配比的比例不變。
以上重量配比的比例是經過科學篩選得到的，對于特殊病人，可以相應調整組成的比例，增加或者減少不超過100％。
丹參經過提取加工得到丹參提取物，丹參提取物再和藥用輔料混合加工制成各種任何一種制劑。
丹參可以通過水提酸沉、醇提、水提醇沉、或水提過柱等多種方式制備，本發(fā)明對丹參的提取工藝進行了優(yōu)選，如下取丹參藥材粗粉，加水煎煮二次，第一次加水12倍量，第一次加水10倍量，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度1.08～1.12的濃縮液，加乙醇至含醇量至85％，冷藏24小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加鹽酸調PH值至2，用醋酸乙酯振搖提取3次，合并醋酸乙酯液，蒸干。殘渣加PH值2的酸水溶解，加于已處理好的聚酰胺柱上，先用2倍柱體積的水洗脫，棄去水洗液，再用4倍柱體積的95％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，并真空干燥，即得。
通過上述工藝制備的丹參提取物，得率1.5～2％丹參總酚酸含量＞70％丹酚酸B含量＞30％。
本發(fā)明藥物還可以由一定比例的丹參提取物、葛根素組成，其重量配比為1∶0.05～64，優(yōu)選配比1∶1～32，最優(yōu)配比1∶2。丹參提取物可以是水提酸沉提取物、醇提取物、水提醇沉提取物、或水提過柱提取物。丹參提取物可以為丹參總酚酸或丹酚酸B。丹參提取物可利用現(xiàn)有技術的制備方法獲得，例如可利用中國專利申請CN1352985A、CN1247855A、CN1242364A、CN1384090A、02117923.9，郭瑩等(云南中醫(yī)學院學報，2001，24(4)6)的制備方法獲得。也可自行摸索制備工藝獲得。本發(fā)明丹參提取物中丹酚酸B含量在45％～70％，其總酚酸含量在70％以上，最好在80％以上。無論是通過現(xiàn)有技術還是自行摸索制備工藝制備本發(fā)明的丹參提取物，如果未達到上述含量標準，則應進行精制，使之符合上述含量標準。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種治療心腦血管疾病的藥物組合物。尤其適用于治療急性心肌梗塞、冠心病、心絞痛、缺血性腦血管病、腦血栓、高血壓等。
該組合物可以加一種或多種藥學上可接受的載體，以口服、鼻吸入或腸胃外給藥的方式施用于需要這種治療的患者。用于口服時，可將其制成常規(guī)的固體制劑，如片劑、膠囊、軟膠囊、分散片、口服液、顆粒、咀嚼片、口崩片、滴丸、緩釋片、緩釋膠囊、控釋片、控釋膠囊，制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿等；用于腸胃外給藥時，可將其制成注射用的溶液、水或油懸浮劑等，如水針、凍干粉針、無菌粉針、輸液等。本組合物的優(yōu)選的形式是注射劑或口服制劑，其中丹參提取物中，丹參總酚酸的含量不低于51％，丹酚酸B含量不低于30％。
本發(fā)明的藥物可采用現(xiàn)有制藥領域中的常規(guī)方法生產，需要的時候可以添加各種藥學上可接受的載體。所述的載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
在注射劑中為了增加其溶解度，可以加入吐溫-80等增溶劑。輸液中可以加入用于調節(jié)滲透壓的等滲調節(jié)劑，例如，氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、乳酸鈉、葡萄糖、木糖醇、山梨醇和右旋糖苷等，優(yōu)選氯化鈉或葡萄糖。粉針中可加入賦形劑，例如，甘露醇、葡萄糖等。
本發(fā)明經過藥理學研究和藥效動物實驗研究結果證明，由丹參與葛根素為主要成分制成的藥物，可以增加冠脈血流量，增加心肌供血，降低左室舒張末期壓，降低心臟前負荷等，明顯改善犬血液流動力學；改善腦血管循環(huán)，減小腦缺血面積；顯著抗血小板聚集；顯著減小心肌梗塞范圍；對家兔腦缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用。本發(fā)明實驗研究結果證明，丹參與葛根素合并用藥呈協(xié)同作用，藥效明顯增強。
本發(fā)明的優(yōu)點在于對已知的丹參與葛根素的相互作用、配伍組方進行研究，以與葛根素為原料直接投料，制備工藝簡單，避免了提取時造成的藥物損失和由于原藥材質量差異造成的不同產品質量差異較大的缺點，使藥品純度更高，雜質少，安全性更高，且不同批次藥品間質量差異小，藥品質量更均勻穩(wěn)定。采用丹參與葛根素合理配伍后合并用藥，經藥理學實驗證明，藥效優(yōu)于單獨使用丹參或葛根素，藥效提高，產生了意想不到的效果。丹參與葛根素合并用藥呈協(xié)同作用，且用藥劑量相對減小，具有廣泛的應用前景。
本發(fā)明藥物組分的用量是經過發(fā)明人進行大量摸索總結得出的，各組分用量在下述重量份范圍內都具有較好的療效。
以下通過實驗例來進一步闡述本發(fā)明所述藥物的有益效果，這些實驗例包括本發(fā)明藥物組合物的藥效學實驗，丹參提取物和葛根素的組合物以下簡稱GD組合物。實驗例中的丹參提取物來自于實施例1。
受試動物Wister大鼠，雄性，體重200～220g，140只，每組10只，隨機分為14組。
供試品生理鹽水對照組模型組丹參提取物組丹參提取物注射液，自制葛根素組葛根素注射液，自制GD組合物注射液(不同配比)組，10組，自制實驗方法將大鼠隨機分為14組生理鹽水對照組；模型組；丹參提取物組；葛根素組；GD組合物注射液組丹+葛(1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶10、1∶20、1∶32、1∶64)。各藥物均以生理鹽水稀釋至所需濃度，尾靜脈注射給藥。
大鼠實驗性心肌梗死模型動物戊巴比妥腹腔注射麻醉(45mg/kg)仰位固定。氣管插管，在胸骨左側作2cm的縱切口，近胸骨側剪斷第3、第4肋軟骨，打開胸腔后，連接人工呼吸機(通氣量2ml/100g，50次/min)。剪開心包膜，暴露心臟，冠狀動脈左前降支根部穿線以備結扎，記錄標準II導聯(lián)心電圖，穩(wěn)定10分鐘，結扎冠狀動脈左前降支，關閉胸腔。用針筒吸出動物喉部分泌物，使動物恢復自主呼吸。結扎冠狀動脈15min后，靜脈給藥。結扎冠狀動脈4小時后，摘取心臟，在結扎線以下橫切5片，進行氯化硝基四氮唑藍(N-BT)染色，計算心肌梗死區(qū)面積占心室及心臟面積的百分比，并進行統(tǒng)計學處理(t檢驗)。結果見表1。
表1 組合物對大鼠實驗性心肌梗塞范圍的影響(x±s)
注*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比；#P＜0.05，與丹參提取物組或葛根素組相比；&P＜0.05，模型組與生理鹽水組相比。
結論模型組與生理鹽水組相比有顯著差異，說明造模成功(&P＜0.05)。各給藥組都具有明顯的抗心肌缺血作用(*P＜0.05和**P＜0.01)，其中丹參提取物與葛根素配伍的各個配比(1∶0.5～64)的作用優(yōu)于單用丹參提取物或葛根素(#P＜0.05)，提示兩藥配伍有協(xié)同增效作用；在配比為1∶2時，效果最好。
實驗動物Wister大鼠，雄性，體重200～220g，60只，每組10只，隨機分為6組。
供試品生理鹽水對照組丹參提取物組丹參提取物注射液，自制葛根素組葛根素注射液，自制
GD組合物注射液(不同劑量配比)組，3組，自制實驗方法將大鼠隨機分為6組，每組10只，分別為生理鹽水對照組；丹參提取物組；葛根素組；GD組合物注射液(丹+葛＝100mg+100mg；丹+葛＝75mg+150mg；丹+葛＝50mg+150mg)組。各組動物給藥，每日一次，連續(xù)給藥7天，末次給藥后1小時，動物麻醉后自腹主動脈取血，抗凝劑采用3.28％枸櫞酸鈉，與血液以1∶9比例混合。將抗凝全血在20℃條件下1500r.min-1離心5min獲得富血小板血漿(PPR)。留取定量PPR后，將剩余PPR再次以3000r.min-1離心10min，獲得自身對照貧富血小板血漿(PPP)。以PPP調節(jié)PPR濃度，使各PPR濃度相同。將PPR在37℃的恒溫孔中預熱后，加入ADP(終濃度為3μmol.L-1)引起血小板聚集，記錄最大聚集率。結果見表2。
表2 抗血小板聚集作用(X±SD)
注GD組與丹參提取物組或葛根素組相比，P＜0.05結論各給藥組都能明顯抑制血小板聚集(P＜0.05和P＜0.01)，其中GD組合物注射液的作用強于單用丹參提取物或葛根素(P＜0.05)，證明丹參提取物與葛根素配伍的組合物有很好的抗血小板聚集作用，且與組合物的劑量配比有關，丹+葛＝75mg+150mg時作用最強。
實驗例3GD組合物注射液靜脈給藥對麻醉開胸犬血流動力學的影響實驗動物雜種犬，30只，體重在11.0～13.0公斤，每組5只。
供試品生理鹽水對照組丹參提取物組丹參提取物注射液，自制葛根素組葛根素注射液，自制GD組合物注射液(不同劑量配比)組，3組，自制給藥劑量20mg/kg實驗方法取30只雜種犬，體重在11.0～13.0公斤，每組5只，雌雄兼用，隨機分為6組，分別為生理鹽水對照組；丹參提取物組；葛根素組；GD組合物注射液(丹+葛＝100mg+100mg；丹+葛＝75mg+150mg；丹+葛＝50mg+150mg)組。各給藥組在給藥前用0.9％生理鹽水配制所需濃度藥液。
犬用3％戊巴比妥鈉1ml/kg前肢靜脈注射麻醉，仰臥位固定于手術臺上，剪去頸部、胸部和右后肢內側的毛。75％乙醇消毒剪毛區(qū)。分離氣管，并插入氣管插管，備人工呼吸用；分離頸外靜脈，并從頸外靜脈插管經上腔靜脈進入右心房并達到心房竇處，用于抽取冠狀靜脈的血液；分離股靜脈，插入靜脈插管，整個實驗過程中緩慢恒速注入10％葡萄糖。分離股動脈，插入動脈插管(管內充滿25U/ml的肝素鈉生理鹽水)，接通TP-400T型壓力換能器，由AP-641G型血壓放大器記錄血壓(收縮壓SAP，舒張壓DAP，平均動脈壓MAP)。人工呼吸下，于第4肋間開胸，剪開心包膜，分離升主動脈根部和左冠狀動脈前降支，分別放置適宜內徑的電磁血流量計探頭(13，2mm)測量心輸出量(CO)和冠狀動脈血流量(CBF)。將左心室插管(管內充滿25U/ml的肝素生理鹽水)經左心室心尖部插入左心室內，通過TP-400T型壓力換能器，由AP-641G型血壓放大器記錄左室內壓(LVP)，通過AD-601G型放大器記錄左室舒張末期壓(LVEDP)將針狀電極插入犬四肢皮下，描記標準II導聯(lián)心電圖(ECG)。上述測量信號均輸入RM-6000型八道生理記錄儀記錄，描記。同時將心輸出量、心電、血壓及心室內壓的電信號輸入微機的生物醫(yī)學生理信號處理系統(tǒng)進行處理，并由微機讀出心室內壓峰值(LVSP)、舒張末期壓(LVEDP)、心室收縮參數(shù)(+dp/dtmax)、心室舒張參數(shù)(-dp/dtmax)。最后，計算心指數(shù)(CI)、每搏輸出量(SV)、心搏指數(shù)(SI)、每搏功指數(shù)(SWI)、血管總外周阻力等參數(shù)(TPVR)。手術完成后穩(wěn)定20min，將藥物溶于100ml生理鹽水中，15min內經股靜脈恒速滴入。
在給藥前、給藥后1h、2h分別抽取左心室及冠狀靜脈血，肝素抗凝，注射于i-STAT G3+Cartridges(i-STAT公司G3+型測試片)中，通過血氣分析儀測量動、靜脈血氧分壓。心肌耗氧量由Kanter公式計算而來，其公式是MVO2＝3.25×10×CF(PaO2-PvO2)/Wt。MVO2是指每100g左室心肌的耗氧量，CF為冠脈流量，PaO2、PvO2分別表示動、靜脈血氧分壓，Wt是左心室肌重。
所有數(shù)據均以平均值±標準偏差表示，根據用藥前后各組中各個指標的變化，采用配對t-檢驗來判斷用藥前后各種指標改變的統(tǒng)計學意義。
實驗結果(1)對麻醉犬總外周血管阻力的影響與對照組比較，各配比GD組合物注射液組均能顯著降低麻醉犬總外周血管阻力(p＜0.01)，葛根素組能明顯降低麻醉犬總外周血管阻力(p＜0.05)，丹參提取物組的作用較葛根素注射液組低(p＜0.05)。
(2)對麻醉犬左室舒張末期壓的影響與對照組比較，各配比GD組合物注射液組均能顯著降低麻醉犬左室舒張末期壓(p＜0.01)，丹參提取物組以及葛根素注射液組能明顯降低麻醉犬左室舒張末期壓(p＜0.05)。
(3)對麻醉犬冠狀動脈血流量的影響與對照組比較，各配比GD組合物注射液組均能顯著增加麻醉犬冠狀動脈血流量(p＜0.01)，丹參提取物組以及葛根素注射液組能明顯增加麻醉犬冠狀動脈血流量(p＜0.05)。
(4)對麻醉犬心室收縮參數(shù)的影響與對照組比較，各配比GD組合物注射液組均能顯著增加麻醉犬心室收縮參數(shù)(p＜0.01)，丹參提取物組以及葛根素注射液組能明顯增加麻醉犬心室收縮參數(shù)(p＜0.05)。
(5)對麻醉犬心室舒張參數(shù)的影響與對照組比較，各配比GD組合物注射液組均能顯著增加麻醉犬心室舒張參數(shù)(p＜0.01)，丹參提取物組以及葛根素注射液組能明顯增加麻醉犬心室舒張參數(shù)(p＜0.05)。
(6)對麻醉犬心輸出量、每搏輸出量、心指數(shù)以及心搏指數(shù)的影響與對照組比較，各配比GD組合物注射液組均能顯著增加麻醉犬的心輸出量、每搏輸出量、心指數(shù)、心搏指數(shù)(p＜0.01)，丹參提取物組以及葛根素注射液組能明顯增加麻醉犬的心輸出量、每搏輸出量、心指數(shù)、心搏指數(shù)(p＜0.05)。
結論丹參提取物和葛根素合并用藥可通過增加冠狀動脈血流量，使心肌的供血增加，降低左室舒張末期壓，使血液易于從心外膜向心內膜下區(qū)域流動，對冠狀動脈血流量進行重新分配；能明顯降低心臟前負荷，對后負荷無明顯影響；能顯著改善心臟的泵血功能；能明顯改善心臟的收縮和舒張功能。丹參提取物和葛根素合并用藥的效果優(yōu)于丹參提取物或葛根素單獨用藥的效果，提示兩藥有協(xié)同增效作用。
實驗例4GD組合物對實驗性犬腦缺血的影響實驗動物雜種犬，30只，體重在11.0～13.0公斤，每組5只。
供試品生理鹽水對照組丹參提取物組丹參提取物注射液，自制葛根素組葛根素注射液，自制GD組合物注射液(不同劑量配比)組，3組，自制實驗方法取30只雜種犬，體重在11.0～13.0公斤，每組5只，雌雄兼用，隨機分為6組，分別為生理鹽水對照組；丹參提取物組；葛根素組；GD組合物注射液(丹+葛＝100mg+100mg；丹+葛＝75mg+150mg；丹+葛＝50mg+150mg)組。犬大腦中動脈結扎所致腦缺血模型的制作取犬腹腔注射3％戊巴比妥鈉1.0ml/kg(30mg/kg)麻醉，固定犬于手術臺上，然后在犬右外眼角與右耳根部1/2處(中點)，用電刀切開皮膚，分離肌肉，用手術專用顱骨鉆鉆開顱骨，以咬骨鉗擴大顱骨孔，切開硬腦膜，找到大腦中動脈。先用多譜勒超聲血流探測儀測定大腦中動脈血流速度，然后立即將大腦中動脈結扎造成腦缺血。大腦中動脈結扎6小時后，分離雙側頸總動脈并夾閉之，即刻從右側頸總動脈夾閉處的遠心端灌注20ml龍膽紫飽和溶液對腦組織進行染色，然后處死動物，開顱取出腦組織，稱全腦重，遂切下未染色的腦組織(即缺血區(qū)腦組織)稱重，求出其占全腦重量的百分率，并進行病理組織學檢查，以判斷其是否屬于腦缺血性損傷，結果見表3。
表3 組合物對實驗性犬腦缺血的影響(X±SD)
注*P＜0.05，**P＜0.01，與生理鹽水對照組相比#P＜0.05，與丹參提取物組或葛根素組相比結論實驗結果表明，各給藥組都能不同程度的降低犬大腦中動脈結扎后的腦組織缺血區(qū)重量(*P＜0.05、**P＜0.01)。其中GD組合物注射液的作用強于單用丹參提取物或葛根素(#P＜0.05)，證明丹參提取物與葛根素配伍的組合物有很好的抗腦缺血作用，且與組合物的劑量配比有關，丹+葛＝75mg+150mg時作用最強。
實驗例5GD組合物對家兔腦缺血灌注損傷的保護作用實驗動物家兔，114只，雌雄兼用，體重2.4～2.8kg，隨機分為缺血再灌注組(18只)、GD組合物注射液治療組(每一配比18只)、丹參提取物治療組(18只)、葛根素注射液治療組(18只)和假手術對照組(6只)。
供試品氯化鈉注射液對照組丹參提取物組丹參提取物注射液，自制葛根素組葛根素注射液，自制GD組合物注射液(不同劑量配比)組，3組(丹+葛＝100mg+100mg；丹+葛＝75mg+150mg；丹+葛＝50mg+150mg)，自制供試液的配制所有供試品均配成20mg/ml的供試液給藥劑量20mg/kg實驗方法(1)缺血再灌注組18只，用25％的氨基甲酸乙脂溶液1g/kg耳緣靜脈麻醉，頸部正中切口分離氣管插入氣管套管，暴露兩側頸總動脈，夾閉兩側動脈20min，造成腦缺血，分別再灌注1、6和12h，3個時間點各6只。松夾10min后，耳緣靜脈推注生理鹽水5ml/kg。(2)GD組合物注射液治療組每一配比的GD組合物注射液為一大組，共3大組，每大組18只，手術方法同缺血再灌注組，3個時間點各6只。松夾10min后，耳緣靜脈推注GD組合物注射液20mg/kg。(3)丹參提取物治療組18只，手術方法同缺血再灌注組，3個時間點各6只。松夾10min后，耳緣靜脈推注丹參提取物供試液20mg/kg。(4)葛根素注射液治療組18只，手術方法同缺血再灌注組，3個時間點各6只。松夾10min后，耳緣靜脈推注葛根素注射液20mg/kg。(5)假手術對照組6只，僅行麻醉和動脈分離術而不夾閉，1h后處死。上述各組實驗結束后即斷頭，在冰浴中剝出大腦，冰盤上解剖出雙側海馬區(qū)組織，用錫紙包裹放在4℃冰箱中儲存，備測磷脂酶A2(PLA2)；切取皮層組織測腦梗死面積、腦含水量，選取大腦中動脈供血區(qū)的額頂區(qū)組織標本進行病理學觀察。所有計量資料數(shù)據均采用平均值±標準偏差表示，組間比較采用t檢驗。
實驗結果(1)對海馬組織PLA2活性的影響缺血再灌注組再灌注1h、6h和12h后，PLA2活性較假手術對照組明顯增高(p＜0.01)，且隨灌注時間延長，PLA2活性呈遞減趨勢，但各時間點間比較差異不顯著(p＞0.05)；各個配比的GD組合物注射液治療組(1h、6h、12h)PLA2活性明顯降低，與假手術對照組和缺血再灌注組各相應時間點比較具有顯著性差異(p＜0.01)，且隨再灌時間延長，PLA2活性逐漸恢復正常水平；丹參提取物治療組和葛根素注射液治療組(1h、6h、12h)PLA2活性降低，與假手術對照組和缺血再灌注組各相應時間點比較具有明顯差異(p＜0.05)，丹參提取物的作用低于葛根素注射液。
(2)對皮層組織含水量(％)和梗死面積(％)的影響缺血再灌注組各時間點腦含水量均增高；各個配比的GD組合物注射液治療組各時間點腦水含量與缺血再灌注組相比明顯減輕(p＜0.001)，腦梗死面積與缺血再灌注組相比明顯縮小(p＜0.01)；丹參提取物治療組和葛根素注射液治療組各時間點腦水含量與缺血再灌注組相比明顯降低(p＜0.01)，腦梗死面積與缺血再灌注組相比明顯縮小(p＜0.05，p＜0.01)。
(3)腦組織病理改變假手術對照組無梗死狀，神經元結構形態(tài)正常，無間質水腫；缺血再灌注組有梗死狀，梗死狀周神經元腫脹，細胞輪廓不清，間質水腫明顯；各個配比的GD組合物注射液治療組、丹參提取物治療組、葛根素注射液治療組梗死狀面積均縮小，梗死狀周神經元腫脹不明顯，間質水腫明顯減輕；GD組合物注射液治療組作用更明顯。
結論上述實驗結果表明，腦缺血再灌注后，GD組合物注射液、丹參提取物、葛根素注射液均可降低海馬組織PLA2活性，改善腦缺血所致內環(huán)境紊亂，減輕腦水腫，減小腦梗死面積；說明GD組合物、丹參提取物、葛根素均具有清除自由基，快速切斷自由基連鎖反應，抑制脂質過氧化，減輕遲發(fā)性腦損傷等腦組織保護作用。各個配比的GD組合物注射液在各項指標中藥效均高于丹參提取物和葛根素注射液單獨用藥的效果，提示兩藥具有協(xié)同增效作用。
實驗例6GD組合物注射液穩(wěn)定性實驗樣品GD組合物注射液(自制，丹+葛＝75mg+150mg)考察項目性狀、pH值、澄明度長期穩(wěn)定性實驗方法及結果將本品置溫度25℃±2℃、相對濕度60％±10％的條件下放置6個月、12個月，各項指標均無明顯變化，實驗結果表明組合物注射液長期放置基本穩(wěn)定。以下通過實施例來進一步闡述本發(fā)明藥物組合物的制備方法。以下的實施例可以使本專業(yè)技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例2-10所用的丹參提取物來自于實施例1。
實施例1丹參提取物的制備1.水提工藝篩選實驗加水量、提取時間和提取次數(shù)對提取結果的影響較大，因此以丹參總酚酸含量和浸膏得率為指標，用正交實驗法考察三種因素對提取結果的影響。因素及水平設計見表4。
表4 丹參醇提工藝考察因素水平表
實驗方法 稱取丹參100g，共9份，按表4各列號的要求提取，合并提取液，濾過，濾液濃縮并定容至500ml，備用。
丹參總酚酸的含量測定對照品溶液的制備 精密稱取干燥的原兒茶醛對照品1mg，加水溶解，定容至100ml。
供試品溶液的制備 精密量取樣品溶液25ml，置50ml容量瓶中，加水稀釋至刻度精密量取0.1ml置25ml容量瓶中加乙醇5ml，加入0.3％十二烷基硫酸鈉2ml，0.6％鐵氰化鉀-0.9％三氧化鐵(臨用前等量混合)1ml，如此暗處放置5min，加入0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，暗處放置20min后，置lena比色池中，720nm處測定。
測定法 比色法浸膏得率的測定 精密量取各樣品溶液25ml，置已恒重的蒸發(fā)皿中，于水浴蒸干后，在105℃干燥3小時，移置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。計算浸膏得率。結果見表5。
表5 丹參水提工藝考察正交實驗表
表6 丹參提取工藝方差分析表
F0.05(2，2)＝19.00F0.05(2，2)＝99.00由表5、表6結果可以看出，加水量是影響丹參提取的主要因素，提取時間和提取次數(shù)對其影響不大，結合工業(yè)生產，參考浸膏得率，確定丹參提取工藝為A3B3C2，即取丹參，加水煎煮兩次，兩次都為2小時，第一次加水12倍量，第二次加水10倍量。
2.醇沉工藝的考察醇沉濃度的考察實驗方法 稱取丹參200g，共3份，分別加水煎煮兩次，第一次1.5小時，加水12倍量，第二次1小時，加水10倍量，合并提取液，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.17～1.20(80℃)，用乙醇處理2次，第一次溶液中含乙醇量為75％，第二次分別為80％、85％、90％，每次均冷藏放置，濾過，回收乙醇，濃縮并定容至1000ml。精密量取50ml，照1項下含量測定與浸膏得率測定方法，測定總酚酸的含量和浸膏得率。實驗結果見表7。
表7 醇沉濃度考察實驗結果
由表7結果可以看出，當醇沉濃度為85％時，既能保證總酚酸的含量，又能達到除雜的目的，因此選擇兩次醇沉濃度為85％。
丹參提取物鑒別實驗取本品0.2g，研細，加70％甲醇25ml，加熱回流1小時，濾過，濾液蒸干，殘渣加70％甲醇1ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹酚酸B對照品，加70％甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法測定，吸取上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。
供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點。
丹參提取物含量測定實驗總酚酸含量測定 比色法對照品溶液的制備 精密稱取于105℃干燥至恒重的原兒茶醛對照品1mg，加水溶解，定容至100ml。
供試品溶液的制備 精密稱取樣品50mg，置50ml容量瓶中，加水稀釋至刻度精密量取0.1ml置25ml容量瓶中加乙醇5ml，加入0.3％十二烷基硫酸鈉2ml，0.6％鐵氰化鉀-0.9％三氧化鐵(臨用前等量混合)1ml，如此暗處放置5min，加入0.1mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻，暗處放置20min后，置lena比色池中，720nm處測定。
丹酚酸B的含量測定 高效液相色譜法色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)為流動相；檢測波長為286nm。理論塔板數(shù)按丹參素峰計算應不低于1500。
對照品溶液的制備 精密稱取丹酚酸B對照品適量，加75％甲醇制成每1ml含0.14mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備 取本品約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50ml，稱定重量，加熱回流1h，取出，放冷，再稱定重量，用75％甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
測定法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀，測定，即得。
按照上述優(yōu)選工藝，取丹參藥材粗粉100kg，加水煎煮二次，第一次加水12倍量，第一次加水10倍量，每次2小時，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度1.08~1.12的濃縮液，加乙醇至含醇量至85％，冷藏24小時，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，加鹽酸調PH值至2，用醋酸乙酯振搖提取3次，合并醋酸乙酯液，蒸干。殘渣加PH值2的酸水溶解，加于已處理好的聚酰胺柱上，先用2倍柱體積的水洗脫，棄去水洗液，再用4倍柱體積的95％乙醇洗脫，收集洗脫液，回收乙醇，并真空干燥，得丹參提取物。
按照上述方法獲得3批丹參水溶性提取物，其中總酚酸和丹酚酸B含量測定結果見表8。從結果可以看出，本方法得到的丹參提取物的得率為1.5～2％，丹參總酚酸含量＞70％，丹酚酸B含量＞45％。
表8 丹參提取物的含量測定結果和得率
實施例2GD組合物粉針劑的制備處方丹參提取物 100g葛根素 100g聚山梨酯80 50g甘露醇 300g無菌注射用水 加至3000ml共制備 1000支丹參提取物 75g葛根素 150g聚山梨酯80 75g甘露醇 300g無菌注射用水 加至3000ml共制備 1000支丹參提取物 50g葛根素 150g聚山梨酯80 75g甘露醇 300g無菌注射用水 加至3000ml共制備 1000支制備工藝1)首先將配液用的容器具及抗生素玻璃瓶，膠塞等進行無菌處理。
2)按照處方量稱取原輔料。
3)將丹參提取物加入配液量30％無菌注射用水中加熱溶解完全。甘露醇加配液量30％的無菌注射用水加熱攪拌溶解完全，聚山梨酯80加20％的無菌注射用水后制成水溶液加入葛根素加熱溶解，合并上述溶液，補加無菌注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘。
5)經砂濾棒過濾脫炭。測定并調節(jié)溶液的PH值。
6)經0.22um的微孔濾膜精濾。
7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗。
8)分裝于抗生素玻璃瓶中，半壓塞。將樣品放入凍干機中冷凍干燥。預凍-45℃5小時，低溫真空干燥-45℃～0℃20小時，然后升溫至25℃真空干燥3小時。
9)凍干結束，壓塞，軋蓋。
10)成品全檢，包裝入庫。
實施例3GD組合物水針劑的制備處方丹參提取物100g葛根素100g丙二醇700ml注射用水 加至2000ml共制備1000支丹參提取物75g葛根素150g丙二醇700ml注射用水 加至2000ml共制備1000支丹參提取物50g葛根素150g丙二醇700ml注射用水 加至2000ml共制備1000支制備工藝1)一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水沖洗。
2)將丹參提取物加入配液量20％的注射用水中加熱攪拌溶解完全。葛根素加入丙二醇中加熱攪拌溶解完全。
3)合并上述兩溶液，補加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘。
5)經砂濾棒過濾脫炭。測定并調節(jié)溶液的PH值。
6)經0.45um的微孔濾膜精濾。
7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗。
8)將溶液熔封于玻璃安瓿中。
9)100℃流通蒸汽滅菌30分鐘。
10)趁熱將樣品放入0.01％的亞甲藍溶液中檢漏。
11)燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實施例4GD組合物輸液的制備氯化鈉輸液處方丹參提取物100g葛根素100g聚山梨酯8050g氯化鈉900g注射用水 加至100000ml共制備1000瓶丹參提取物75g葛根素150g聚山梨酯8075g氯化鈉900g注射用水 加至100000ml共制備1000瓶丹參提取物50g葛根素150g聚山梨酯8075g氯化鈉900g注射用水 加至100000ml共制備1000瓶制備工藝1)前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水沖洗。
2)將丹參提取物加入配液量20％注射用水加熱攪拌溶解完全，將氯化鈉用配液量20％的注射用水溶解完全。聚山梨酯80加20％的無菌注射用水后制成水溶液加入葛根素加熱溶解。
3)合并上述溶液，補加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘。
5)經砂濾棒過濾脫炭。測定并調節(jié)溶液的PH值。
6)經0.45um的微孔濾膜精濾。
7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗。
8)灌裝于100ml的輸液瓶中。
9)115℃熱壓滅菌30分鐘。
10)燈檢，成品全檢，包裝入庫。
葡萄糖輸液處方丹參提取物100g葛根素100g聚山梨酯8050g葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml共制備1000瓶丹參提取物75g葛根素150g聚山梨酯8075g葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml共制備1000瓶丹參提取物50g葛根素150g聚山梨酯8075g葡萄糖5000g注射用水 加至100000ml共制備1000瓶制備工藝1)提前一天處理配液用的管道及容器等，臨用前再用新鮮的注射用水沖洗。
2)將丹參提取物加入配液量20％注射用水中加熱攪拌溶解完全，將葡萄糖用配液量20％的注射用水溶解完全，加熱煮沸15分鐘。聚山梨酯80加20％的無菌注射用水后制成水溶液加入葛根素加熱溶解。
3)合并上述溶液，補加注射用水至全量。
4)加入配液量0.1％的針用活性炭，加熱攪拌15分鐘。
5)經砂濾棒過濾脫炭。測定并調節(jié)溶液的PH值。
6)經0.45um的微孔濾膜精濾。
7)檢查溶液的澄明度，半成品化驗。
8)灌裝于100ml的輸液瓶中。
9)115℃熱壓滅菌30分鐘。
10)燈檢，成品全檢，包裝入庫。
實施例5GD組合物片劑的制備處方丹參提取物75g葛根素150g淀粉 40.0g微晶纖維素40.0g2％HPMC水溶液 適量硬脂酸鎂 6.0g羧甲淀粉鈉12.0g共制備1000片制備工藝1)將葛根素和丹參提取物粉碎過100目篩備用。
2)按照處方量稱取原輔料。
3)將羥丙甲纖維素溶于水中制成2％的水溶液備用。
4)將丹參提取物、葛根素、淀粉、微晶纖維素混合均勻，加入2％HPMC水溶液適量，攪拌均勻，制成適宜軟材。
5)過20目篩制顆粒。
6)顆粒在60℃的條件下烘干。
7)干燥好的顆粒加入硬脂酸鎂和羧甲淀粉鈉，過18目篩整粒，混合均勻。
8)取樣，半成品化驗。
9)按照化驗確定的片重壓片。
10)成品全檢，包裝入庫。
實施例6GD組合物膠囊劑的制備處方丹參提取物75g葛根素150g淀粉 20.0g微晶纖維素60.0g2％HPMC水溶液 適量硬脂酸鎂 6.0g共制備1000粒制備工藝1)將葛根素和丹參提取物粉碎過100目篩備用。
2)按照處方量稱取原輔料。
3)將羥丙甲纖維素溶于水中制成2％的水溶液備用。
4)將丹參提取物、葛根素、淀粉、微晶纖維素混合均勻，加入2％HPMC水溶液適量，攪拌均勻，制成適宜軟材。
5)過20目篩制顆粒。
6)顆粒在60℃的條件下烘干。
7)干燥好的顆粒加入硬脂酸鎂，過18目篩整粒，混合均勻。
8)取樣，半成品化驗。
9)按照化驗確定的裝量裝入膠囊。
10)成品全檢，包裝入庫。
實施例7GD組合物顆粒劑的制備處方丹參提取物75g葛根素150g糖粉 2000.0g2％HPMC50％乙醇溶液 適量共制備1000包制備工藝1)將蔗糖粉碎過100目篩備用。將葛根素和丹參提取物粉碎過100目篩備用。
2)按照處方量稱取原輔料。
3)將葛根素、丹參提取物與糖粉以等量遞加的方法混合均勻，加入2％HPMC50％乙醇溶液適量，攪拌均勻，制成適宜軟材，4)過20目篩制顆粒。
5)顆粒在60℃的條件下烘干。
6)干顆粒過18目篩整粒。
7)取樣，半成品化驗顆粒中主藥的含量，確定裝量。
8)包裝，成品全檢，包裝入庫。
實施例8GD組合物滴丸劑的制備處方丹參提取物75g葛根素150g聚乙二醇6000 1000g制備工藝
將葛根素和丹參提取物粉碎過100目篩后備用。將聚乙二醇6000在水浴中加熱熔融，待全部熔融后加入葛根素和丹參提取物，攪拌溶解，60目篩過濾，保持60℃滴入冷至10℃以下的液體石蠟中制成丸。
實施例9GD組合物軟膠囊劑的制備處方丹參提取物75g葛根素150g大豆油1000.0g大豆磷脂 500g蜂蠟 500g共制備1000粒制備工藝將處方量的大豆油和大豆磷脂、蜂蠟加熱熔融，混勻，放冷，加入丹參提取物、葛根素研勻，壓制成軟膠囊即可。
實施例10GD組合物口服液的制備處方丹參提取物75g葛根素150g丙二醇2000ml苯甲酸鈉 15g甜菊甙10g純化水加至10000ml共制備1000支制備工藝1)將丹參提取物加入配液量50％的純化水中加熱攪拌溶解完全。葛根素加入丙二醇加熱攪拌溶解完全。
2)將苯甲酸鈉和甜菊甙用配液量20％的水溶解完全。
3)合并上述溶液，補加純化水水至全量。
4)過0.8um的微孔濾膜過濾。
5)半成品化驗。
6)灌裝。成品全檢，包裝入庫。
權利要求
1.一種治療心腦血管疾病的藥物組合物，其特征在于，由以下重量配比的原料制成丹參1500～15000份葛根素100～1000份。
2.根據權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，由以下重量配比的原料制成丹參2500～10000份葛根素120～400份。
3.根據權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，其特征在由以下重量配比的原料制成丹參5000份葛根素150份。
4.根據權利要求1-3所述的任一藥物，其特征在于所述的丹參經過提取加工得到丹參提取物，再與相應重量配比的葛根素和藥用輔料混合加工制成各種任何一種制劑。
5.據權利要求4所述的藥物，其特征在于其中的丹參的提取工藝包括以下步驟a)取丹參藥材，粉碎，加水煎煮，濾過，合并濾液，濃縮；b)醇沉，過濾，濾液調PH值；c)萃取、振搖提取，提取液蒸干，得丹參提取物A；
6.據權利要求5所述的藥物，其特征在于丹參提取物A還可以進一步精制，步驟為將丹參提取物A溶解，上聚酰胺柱分離，依次用水和乙醇洗脫，收集洗脫液，真空干燥，得丹參提取物B。
7.根據權利要求1-3所述的任一藥物，其特征在于該藥物可以制成任何一種藥劑學上所說的劑型。
8.根據權利要求1所述的藥物，其特征在于該藥物還可以由丹參提取物、葛根素組成，其重量配比為1∶0.05～64，其中的丹參提取物的主要有效成分為丹參總酚酸或丹酚酸B，含量不低于30％。
9.根據權利要求8所述的藥物，其特征在于丹參提取物及葛根素的重量配比為1∶1～32，其中的丹參提取物的主要有效成分為丹參總酚酸或丹酚酸B，含量不低于30％。
10.根據權利要求8-9所述的藥物組合物，其特征在于臨床上或藥學上可接受的劑型為注射劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，公開了一種由丹參及葛根素按一定比例制成的治療心腦血管疾病的藥物組合物，以及含有該藥物組合物的制劑及其制備方法，其中丹參1500～15000份、葛根素100～1000份。該組合物可制成臨床或藥學上可接受的劑型，優(yōu)選注射劑或口服制劑。該組合物中的丹參還可以由丹參提取物代替，以丹參提取物直接投料。該組合物具有協(xié)同增效作用，穩(wěn)定性好，比單用同劑量的丹參提取物或葛根素的效果大大提高。
文檔編號A61K9/08GK1931234SQ20051004459
公開日2007年3月21日 申請日期2005年9月14日 優(yōu)先權日2005年9月14日
發(fā)明者蔡軍 申請人:蔡軍