專利名稱：復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法。
背景技術(shù)：
慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是各種原因所致腎損害后病情持續(xù)進展的結(jié)果，嚴(yán)重危害人類健康。我國每百萬人口中約有100人死于CRF。當(dāng)前，雖然替代療法(透析、移植)對終末期腎衰(end stage renal disease，ESRD)的治療有較大的作用，但不能解決該病的早中期防治問題，而且費用昂貴。腎衰一體化治療新概念認(rèn)為，盡管CRF呈慢性進展，但除了在病變活動期使用激素和免疫抑制劑外，還應(yīng)嚴(yán)格控制血壓、最大程度降低蛋白尿、合理使用阻斷腎素-血管緊張素系統(tǒng)藥物等，盡量避免過度啟動殘腎單位的代償機制，使腎臟功能得以最大的保存，這樣才有可能使病變進展延緩至最低程度。因此，如何控制疾病發(fā)展、改善腎功能和延緩腎衰進程已成為腎臟病專業(yè)的主攻方向之一。
臨床實踐證明，藥材提取生產(chǎn)工藝對療效影響非常顯著。本發(fā)明人的已有專利專利申請?zhí)枮?00410024761.7、發(fā)明名稱為“一種含積雪草的中藥組合物及其應(yīng)用”的發(fā)明專利，提供了一種復(fù)方積雪草中藥組合物，可對抗腎細(xì)胞纖維化、用于早期防治和延緩慢性腎功能衰竭，其中藥有效成分的提取方法僅為普通的水煎法，難以達(dá)到中藥組合物有效成分的充分利用、不能更好的發(fā)揮其療效。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明既是為了提供一種有效成分提取充分、療效好的復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法。
為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法，所中藥組合物主要成分質(zhì)量組成如下積雪草15～45份，制大黃6～10份，桃仁6～10份，黃芪9～45份，當(dāng)歸6～20份；所述的提取方法按如下步驟進行(1)桃仁置于萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，留下脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，靜置，過濾，濾液用大孔樹脂提純，以水、乙醇水溶液梯度洗脫，洗脫液回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)潤濕后的制大黃，進行滲漉，40～95％乙醇水溶液浸漬24～48h，收集滲漉液，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入40～95％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加稀釋劑混勻，過篩，得混懸藥液，即為復(fù)方積雪草中藥有效成分。
特別的，所述的中藥組合物質(zhì)量組成如下積雪草20份，制大黃10份，桃仁10份，黃芪20份，當(dāng)歸6份；所述的提取方法按如下步驟進行(1)桃仁置于萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，留下脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，靜置，過濾，濾液用大孔樹脂提純，以水、乙醇水溶液梯度洗脫，洗脫液回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)潤濕后的制大黃，進行滲漉，40～95％乙醇水溶液浸漬24～48h，收集滲漉液，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入40～95％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，制成千粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加稀釋劑混勻，過篩，得混懸藥液，即為復(fù)方積雪草中藥有效成分。
或者，所述的方法按如下步驟進行
(1)桃仁置于萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，留下脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，加入藥材總質(zhì)量6～12倍的40～70％乙醇水溶液，回流提取2～3次，合并提取液，靜置過夜，過濾，濾液過大孔樹脂，濾液與樹脂質(zhì)量比為1∶1.5～2.5，柱床徑高比1∶3～4，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液進行洗脫，收集70％乙醇洗脫液量為樹脂用量10～20倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)潤濕1～5h后的制大黃，進行滲漉，40～95％乙醇水溶液浸漬24～48h，收集滲漉液量為干藥材質(zhì)量4～8倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入質(zhì)量為藥渣40％的40～95％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于萃取釜中，45～65℃、24～45Mpa下萃取1.5～3.5h，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加稀釋劑，混勻，過篩，得混懸藥液，即為所述復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分。進一步，所述的方法按如下步驟進行(1)桃仁于SFE-CO2萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，加入藥材總質(zhì)量10倍的60％乙醇水溶液，回流提取2次，每次3h，合并提取液，靜置過夜，過濾，濾液過大孔樹脂，濾液與樹脂質(zhì)量比為1∶2，柱床徑高比1∶3，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液進行洗脫，收集70％乙醇洗脫液量為樹脂用量20倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)制大黃潤濕5h后，裝入滲漉筒，70％乙醇水溶液浸漬24h，收集滲漉液量為干藥材質(zhì)量6倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于SFE-CO2萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入質(zhì)量為藥渣40％的70％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于SFE-CO2萃取釜中，釜溫65℃、壓力45Mpa下萃取2.5h，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，-35～50℃下冷凍4h后，抽真空至12～20MPa、水分含量小于3％，緩慢升溫至50℃，得凍干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加PEG-400，混勻，過篩，得混懸藥液，即為所述復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分。
本發(fā)明所述的復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法的有益效果主要體現(xiàn)在(1)有效成分提取充分，療效好；(2)所得有效成分安全、穩(wěn)定，可根據(jù)需要制成任何劑型，尤其適用于軟膠囊的制備。


圖1為日服干膏量試驗研究的提取工藝流程圖；圖2為回流提取法試驗研究提取工藝流程圖；圖3積雪草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性方程Y＝95404.4X-4721.6(r＝0.9992)；圖4黃芪甲苷HPLC色譜圖，(A)為對照品、(B)為樣品；圖5黃芪甲苷UV掃描圖；圖6為黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性方程94.37X+734.84(r＝0.9996)圖7為黃芪甲苷洗脫曲線圖，黃芪甲苷峰面積10×106；圖8為大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖9為阿魏酸色譜圖，(A)為對照品、(B)為樣品；圖10為阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，線性方程Y＝6798.89X-1.89(r＝0.9998)具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述在明確藥材來源、產(chǎn)地、主要有效成分的前提下，為了選擇合理、簡而易行的提取方法，依據(jù)處方中各有效成分的理化性質(zhì)積雪草的積雪草苷(asiaticoside)和黃芪的黃芪甲苷(astragaloside)，桃仁(脫脂)的苦杏仁苷(amygdalin)均易溶于水、稀醇；大黃的大黃素(emodin)和大黃酸(rhein)等蒽醌衍生物易溶于乙醇、熱水；當(dāng)歸的揮發(fā)油易被水蒸氣蒸餾出，易溶于乙醇、乙醚、醋酸乙酯等有機溶劑，但在蒸餾過程中揮發(fā)油主成分-藁本內(nèi)酯(lingustilide)容易異構(gòu)化而生成4-羥基-3-甲基-乙酰苯、三甲基苯甲醛等次生物質(zhì)；阿魏酸(ferulic acid)易溶于水、稀醇，但在水溶液中不穩(wěn)定，酸性溶液中較穩(wěn)定。同時結(jié)合劑型要求，對藥材的提取方法作了預(yù)試和各種方法的比較試驗。首先以日服干膏量為考察指標(biāo)，進行了水提醇沉與回流提取加大孔樹脂提純法的比較試驗；再以積雪草苷、黃芪甲苷的含量及TLC斑點顯色反應(yīng)為指標(biāo)，進行了積雪草、黃芪、脫脂桃仁提取溶媒的選擇和黃芪藥材粒度選擇試驗；以大黃素、大黃酸的TLC斑點顯色反應(yīng)為指標(biāo)，進行了大黃SFE-CO2萃取法與滲漉法提取的比較試驗；又根據(jù)當(dāng)歸揮發(fā)油、阿魏酸的理化特性，以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，進行了水蒸氣蒸餾法與超臨界流體萃取法的比較試驗；以阿魏酸含量為指標(biāo)，進行了酸性溶劑回流法與超臨界流體萃取法加夾帶劑的比較試驗；以及以阿魏酸的TLC熒光斑點為追蹤指標(biāo)，進行了夾帶劑濃度的選擇試驗等多項研究。
(1)藥材積雪草、制大黃、桃仁、黃芪、當(dāng)歸。
(2)試劑藥用酒精，對照品積雪草苷、黃芪甲苷、苦杏仁苷、大黃素、大黃酸、阿魏酸，乙醚、氯仿、苯等均為分析純，甲醇為色譜純。
(3)儀器設(shè)備HPLC儀、CS-930掃描儀、UV分析儀，標(biāo)準(zhǔn)揮發(fā)油測定器，回流提取器(磨口)，SEF-CO2萃取設(shè)備(1L-HA231-50-2.5和10L-HA220-40-48型，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)。
實施例1日服處方配比量的不同提取方法得干膏量(或裝0號膠囊數(shù)量)的考察①水提醇沉法由于處方中有效成分積雪草苷、黃芪甲苷、苦杏仁苷、阿魏酸、大黃素、大黃酸等均易溶于熱水，積雪草、黃芪中又有大量多糖等雜質(zhì)存在，故按常規(guī)臨床用藥習(xí)慣采用水提醇沉法。
投料取日服的處方配比量。
日服干膏量試驗研究的提取工藝流程見圖1。
結(jié)果經(jīng)水提醇沉，得干膏8.2g，當(dāng)歸揮發(fā)油β-CD包合物1.58g，計9.78g。裝入0#膠囊，每粒0.46g，大約能制成21粒。按日服用劑量每日服用三次，每次7粒，服用量太大，病人難以接受。因而，說明水提醇沉后仍有諸多雜質(zhì)存在，本法不適合膠囊劑型。
②溶劑回流后，再經(jīng)大孔樹脂提純法投料量同①法。積雪草、黃芪、脫脂桃仁、大黃、當(dāng)歸揮發(fā)油提取后的藥渣，用70％乙醇10倍量，回流提取二次，每次2h，合并提取液，回收乙醇至無醇味，提取液通過大孔樹脂吸附(藥材量-大孔樹脂＝1∶10)，依次以大量水洗脫(經(jīng)TLC檢查，無積雪草苷、黃芪甲苷、蒽醌類，棄去)，再以70％乙醇充分洗至TLC斑點無皂苷類、蒽醌類化合物的顯色反應(yīng)。收集70％乙醇洗脫液，濃縮，干燥，稱重。
結(jié)果得干膏2.56g，加揮發(fā)油包合物，計4.14g。同①法裝9粒膠囊。日服三次，每次三粒。說明該工藝可把大量雜質(zhì)除去，既保留了有效成分，又可使服用量減少。
③結(jié)論根據(jù)預(yù)試結(jié)果，采用溶劑回流，再經(jīng)大孔樹脂提純法可以滿足膠囊劑型的要求。
④討論處方中積雪草、黃芪、桃仁的主要有效成分為水溶性成分，可以采用溶劑回流法。而大黃的大黃素和當(dāng)歸的阿魏酸及其揮發(fā)油中的藁本內(nèi)酯對熱、或在水中不穩(wěn)定等性質(zhì)，需經(jīng)提取方法考察后，方能確定提取方法。
實施例2含水溶性成分藥材——積雪草、黃芪、桃仁的溶劑回流提取方法研究試驗①回流提取法溶媒的選擇試驗②根據(jù)藥材中主要有效成分——積雪草苷、黃芪甲苷、苦杏仁苷的理化性質(zhì)，均易溶于水或稀醇，故選擇水或不同濃度乙醇作為提取溶媒進行試驗。
方法取積雪草、黃芪(飲片)各20g、脫脂桃仁7g(n＝2)。分別用水、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH回流提取，以積雪草苷、黃芪甲苷為考察指標(biāo)，進行TLC檢測。
回流提取法試驗研究提取工藝流程見圖2。
試驗用的脫脂桃仁，采用EtOAC為溶媒用索氏提取器，回流脫脂法。
水、不同濃度的乙醇回流提取的檢測結(jié)果#.以黃芪甲苷為指標(biāo)的TLC檢測方法分別將黃芪甲苷對照品溶液、提取液(水、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH)，定量點在同一塊硅膠G薄層板上，用氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置過夜的下層溶液展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰。
#.以積雪草苷為指標(biāo)的TLC檢測方法分別將積雪草苷對照品溶液、提取液(水、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH)，定量點在同一塊硅膠G薄層板上，用氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)作展開劑，展開，取出，晾干，10％硫酸乙醇溶液顯色，在100℃加熱至斑點顯色清晰。
#.不同溶媒提取物TLC檢測結(jié)果，見表1。
表1不同溶媒提取物TLC檢測結(jié)果
結(jié)論40～70％乙醇回流提取效果為佳。
實施例3黃芪粒度選擇試驗根據(jù)黃芪有效成分黃芪甲苷易溶于稀醇的理化特性和實施例2實驗結(jié)果，采用60％EtOH為溶媒進行藥材粒度的正交試驗。
①因素水平設(shè)計不同粒度(A)、溶媒量(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)是影響黃芪甲苷提取率的主要因素，設(shè)計三因素四水平，以黃芪甲苷為考察指標(biāo)，進行L9(34)正交試驗，選擇最佳藥材粒度。因素水平表(見表2)。
表2因素水平設(shè)計
②正交試驗I.方法 取不同粒度(粗粉、黃豆粒大、飲片)藥材各約20g，精密稱定，加60％EtOH，分別回流提取，按L9(34)安排試驗，濾液濃縮至干膏，加甲醇50ml，超聲處理30min，濾過，濾液回收甲醇并濃縮至干，殘渣加20ml水微熱使溶解，如下同上述黃芪藥材的[含量測定]項下進行測定。
II.結(jié)果(見表3、4)。
表3正交試驗結(jié)果分析(n＝3)
表4方差分析結(jié)果
F0.05(2，9)＝4.26F0.01(2，9)＝8.02③結(jié)論 表3直觀分析結(jié)果表明，因素對黃芪甲苷含量的影響大小順序為D＞B＞C＞A。表4方差分析結(jié)果表明，因素A、B、C、D均有顯著性意義。故選擇A2B2C1D3為最佳條件，即黃豆粒大，8倍量60％EtOH提取三次，每次1h。
實施例4桃仁脫脂法選擇試驗①溶劑脫脂法 取10g(n＝2)桃仁粗粉，置于索氏提取器，加入醋酸乙酯100ml，回流提取6h，桃仁油提取率約30％。
②SFE-CO2法脫脂 取桃仁粗粉500g(n＝2)投入萃取釜I中，溫度45℃，壓力25MPa，流量36kg/h；分離釜I溫度40℃，壓力8MPa；分離釜II溫度40℃，壓力6MPa；分離釜III溫度40℃，壓力6MPa；萃取6h，桃仁油提取率約44％。
③結(jié)論 采用SFE-CO2脫脂法，脫脂較完全，簡而易行。
實施例5桃仁的苦杏仁苷提取方法選擇試驗①SFE-CO2萃取法 取500g桃仁脫脂后的殘渣，直接加夾帶劑60％乙醇110ml，萃取釜I，溫度60℃，壓力40Mpa，流量36kg/h；分離釜I溫度50℃，壓力8MPa；分離釜II溫度40℃，壓力6MPa；分離釜III溫度40℃，壓力6MPa；萃取1h，補加60％乙醇50ml，繼續(xù)萃取2h。收集分離釜I、II、III萃取液，分別用50％甲醇定容至50ml容量瓶中，作為供試品溶液。
②溶劑回流提取法 取脫脂后桃仁殘渣100g，加10倍量60％乙醇，回流提取二次，每次3h，合并提取濾液，回收乙醇，濃縮至干，用50％甲醇溶解，并定容至10ml容量瓶中，作為供試品溶液。
③苦杏仁苷檢測與結(jié)果 照藥典附錄VIB薄層色譜法。稱取對照品苦杏仁苷，用50％甲醇溶解，配制成1.25mg/ml，作為對照品溶液。分別吸取對照品、①、②供試液2μl點于同一塊硅膠G薄層板上，以CHCl3-EtOAc-MeOH-H2O(15∶40∶22∶10)，5～10℃放置12h的下層溶液為展開劑，展開，取出，立即噴以磷鉬酸硫酸溶液顯色劑，105℃烘約10min，比較各顯色斑點。
結(jié)果 供試品色譜中，在于對照品色譜相應(yīng)位置上，供試液②有明顯的相同顯色斑點，而供試液①的斑點模糊。
④結(jié)論 以溶劑回流法提取苦杏仁苷為宜?？膳c積雪草、黃芪合并提取。
實施例6當(dāng)歸揮發(fā)油提取方法選擇試驗①水蒸氣蒸餾法 照2000年版藥典一部附錄XD揮發(fā)油測定法進行提取。
I.試驗 取100g當(dāng)歸飲片(n＝3)，加水1500ml，蒸餾8h，得比重＞1和比重＜1的揮發(fā)油，芳香水呈乳白狀，用乙醚萃取后，計當(dāng)歸揮發(fā)油量。
II.揮發(fā)油測定結(jié)果，見表5。
表5水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油測定結(jié)果
結(jié)果 每批次含揮發(fā)油分別為0.50、0.45、0.43％，平均揮發(fā)油含量為0.46％。
②超臨界流體萃取法萃取揮發(fā)油I.萃取條件取當(dāng)歸粗粉(三批)，投入萃取釜中，萃取釜溫度45℃，壓力30MPa；分離釜I溫度65℃，壓力10MPa；分離釜II溫度60℃，壓力8MPa；分離釜III溫度55℃，壓力6MPa；提取時間2h；CO2流量36kg/h。
II.揮發(fā)油(含油脂)測定結(jié)果，見表6。
表6 SFE-CO2萃取法揮發(fā)油(含油脂)測定結(jié)果
結(jié)果三次SFE-CO2萃取當(dāng)歸揮發(fā)油(含油脂)得率平均為1.44％(或1.68ml/100g)。
III、SFE-CO2萃取當(dāng)歸揮發(fā)油(含油脂)的揮發(fā)油含量測定照2000年版藥典一部附錄XD揮發(fā)油測定法，取批號030411、030416、030418的含油脂揮發(fā)油，分別加500ml水，蒸餾至揮發(fā)油的量不再增加，讀取揮發(fā)油ml數(shù)。
結(jié)果各批號分別得揮發(fā)油8、7、6.5ml，平均含量為0.9％。
③結(jié)論由于水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油得率低，且蒸餾過程產(chǎn)生異構(gòu)化等弊端，SFE-CO2萃取法得率為水蒸氣蒸餾法近2倍，故采用SFE-CO2萃取法。
實施例7阿魏酸提取方法選擇試驗根據(jù)阿魏酸的理化特性，既可以用酸水回流提取，又可以采用加夾帶劑的超臨界流體萃取法萃取，故分別進行試驗，以阿魏酸含量為考察指標(biāo)，選擇最佳提取方法。
①酸水回流提取法I.試驗 取當(dāng)歸提取揮發(fā)油后的殘渣100g(n＝3)，加含有0.8％冰醋酸的水600ml，回流提取二次(2h，1h)，合并酸水提液，濾過，濾液濃縮至干，105℃烘12h，得干膏粉52g。
II.阿魏酸測定 取干膏粉3.12mg，加甲醇50ml超聲提取1h，趁熱過濾至50ml容量瓶中，定容。HPLC法測定阿魏酸含量(HPLC測定條件同當(dāng)歸藥材項下)。
III.結(jié)果 三批阿魏酸含量分別為0.40、0.43、0.40mg/g，平均0.41mg/g。
②SFE-CO2萃取法I.SFE-CO2萃取夾帶劑濃度的選擇試驗取當(dāng)歸提揮發(fā)油后的藥渣250g(n＝2)，分別用20％、40％、70％、95％EtOH作夾帶劑，加入量均為藥材用量的40％，SFE萃取阿魏酸，萃取條件如下萃取釜溫度55℃，壓力30MPa；分離釜I溫度50℃，壓力15MPa；分離釜II溫度45℃，壓力8MPa；分離釜III溫度40℃，壓力6Mpa，萃取2.5h。
II.檢測方法 以阿魏酸為指標(biāo)，采用TLC和HPLC兩種檢測方法。
II-A.TLC檢測方法 取阿魏酸對照品溶液、20％EtOH、40％EtOH、70％EtOH、95％EtOH萃取液，分別定量點于同一薄層板上，用苯-氯仿-甲醇(2∶2∶0.6)作展開劑，展開，取出，晾干，105℃烘約10min，紫外燈(365nm)下檢視。
II-B.HPLC含量測定方法分別取20、40、70、95％EtOH萃取液照當(dāng)歸藥材阿魏酸含量測定項下測定阿魏酸的含量。
III.結(jié)果III-A.TLC檢測結(jié)果，見表7。
表7不同濃度的夾帶劑萃取的TLC檢測結(jié)果
結(jié)果 以40％～95％EtOH作夾帶劑的提取液，斑點顏色明顯。
III-B.HPLC阿魏酸含量測定結(jié)果，見表8。
表8不同濃度的夾帶劑萃取的HPLC測定結(jié)果
①結(jié)論I.酸水回流提取與加夾帶劑SFE-CO2法萃取所提取的阿魏酸含量相近，但SFE-CO2法操作簡單、省時、方便，故選擇加夾帶劑SFE-CO2法萃取當(dāng)歸阿魏酸。
II.選用40～95％乙醇作為夾帶劑均可，其中以70％乙醇的萃取率最高，故選用該濃度作為夾帶劑。
實施例8大黃的大黃素、大黃酸提取方法選擇試驗
①SFE-CO2萃取法 取大黃粗粉500g，照文獻(xiàn)萃取條件夾帶劑為甲醇，用量為藥材量的40％，萃取釜溫度70℃，壓力42MPa，分離釜I溫度35℃，壓力10MPa；分離釜II溫度25℃，壓力5MPa；分離釜III溫度25℃，壓力4.5MPa；萃取時間3h，CO2流量36kg/h。收集分離釜I、II、III萃取液，蒸干，用甲醇定容至50ml容量瓶中，作為供試品溶液。
②滲漉法 取大黃粗粉100g(n＝3)，用60％乙醇80ml潤濕，密閉放置3h后，裝入滲漉筒內(nèi)，60％乙醇浸漬24h，以1ml/min流速滲漉提取，收集洗脫液的量為藥材重量的6倍。濃縮至干，用甲醇溶解，并移至10ml容量瓶定容，作為供試品溶液。
③大黃素、大黃酸檢測方法與結(jié)果 照藥典附錄VIB薄層色譜法。稱取對照品 大黃素、大黃酸各5mg，分別加甲醇制成每ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。分別吸取對照品、①、②供試液2μl點于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15∶5∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365nm)下檢視。應(yīng)顯相同橙黃色熒光斑點，置氨蒸氣中熏后，日光下檢視，斑點變?yōu)榧t色。
結(jié)果 供試品色譜中，在于對照品色譜相應(yīng)位置上，供試液②有明顯而清晰的相同顯色斑點，而供試液①的斑點不十分清晰。
④結(jié)論 滲漉法優(yōu)于SFE-CO2萃取法。
實施例9藥材最佳提取生產(chǎn)工藝條件研究在確定藥材提取方法的基礎(chǔ)上，對處方中各味藥材的提取生產(chǎn)工藝條件進行了預(yù)試和設(shè)計。即采用正交設(shè)計試驗，通過直觀與方差分析，確立最佳生產(chǎn)工藝條件。本研究分別以積雪草苷、黃芪甲苷含量為指標(biāo)，考察溶劑回流法提取積雪草、黃芪、脫脂桃仁，以及大孔樹脂對提取物提純的最佳生產(chǎn)工藝條件；以大黃素、大黃酸含量為指標(biāo)，考察最佳滲漉生產(chǎn)工藝條件；以揮發(fā)油得率、阿魏酸含量及薄層層析熒光斑點為指標(biāo)，考察超臨界流體萃取當(dāng)歸揮發(fā)油及加夾帶劑萃取阿魏酸的最佳生產(chǎn)工藝條件。
1、儀器、設(shè)備、試劑與藥材(1)儀器 島津LC-10AT高效液相色譜儀(日本)；HS英譜色譜工作站。
(2)設(shè)備 多功能提取罐(60kg)；分離柱(22cm×100cm上海精科實業(yè)有限公司)；旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器(10L，R-2002上海申勝生物技術(shù)有限公司)；滲漉筒(口徑50cm×200cm)；超臨界流體萃取器(1L-HA 231-50-2.5、10L-HA220-40-48，江蘇南通華安超臨界萃取有限公司)；冷凍干燥機。
(3)試劑與藥材 甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。
2、積雪草、黃芪、脫脂桃仁最佳提取生產(chǎn)工藝條件選擇試驗研究(1)正交試驗因素水平的確立根據(jù)預(yù)試結(jié)果，以溶劑回流法提取積雪草、黃芪、脫脂桃仁，影響其有效成分提取率的主要因素為醇的濃度(A)、提取時間(B)、溶媒量(C)、提取次數(shù)(D)。故采用四因素三水平正交設(shè)計，按L9(34)正交表安排試驗(n＝2)，見表9。
表9因素水平設(shè)計
(2)L9(34)正交試驗按L9(34)條件安排試驗，每份試驗取積雪草、黃芪各50g，脫脂桃仁16g，回流提取。由于無空白列，故作了重復(fù)試驗(n＝2)，使試驗分析結(jié)果更加精確可靠。以積雪草苷、黃芪甲苷為考核指標(biāo)，進行最佳生產(chǎn)工藝條件優(yōu)選。
(3)考核指標(biāo)的測定方法①積雪草苷測定方法 照藥典附錄VI高效液相色譜法。
I.試藥與儀器試藥 積雪草購于浙江昌化藥材公司(浙江臨安產(chǎn))，經(jīng)杭州市藥品檢驗所鑒定為傘形科植物積雪草Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草。對照品積雪草苷(批號8779901)由中國藥品生物制品檢定所提供。甲醇為色譜純。
儀器 LC-10AT高效液相色譜儀(日本島津)，SPD-10A檢測器，HS英譜工作站；265紫外分光光度儀(日本島津)。
II.色譜條件 色譜柱為SUPELCOSILTMLC-18-DB(15cm×4.5mm，5μm)，柱溫為室溫，流動相為甲醇-水(55∶45)，流速為1ml/min，檢測波長為204nm。在此條件下，樣品中積雪草苷峰與其他峰能達(dá)到基線分離，積雪草苷色譜峰的保留時間為5.9min。
III.對照品溶液制備 精確稱取積雪草苷對照品2.4mg，置5ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1ml含積雪草苷0.48mg)。
IV.藥材及提取物供試品溶液的制備 取積雪草藥材粗粉0.5g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加甲醇50ml，超聲提取2h，提取液濾過，濾液濃縮至干，殘渣用50％甲醇4ml溶解，微孔濾膜濾過，濾液作為藥材供試品溶液。另取提取液適量，蒸干，精密稱定，甲醇溶解，定容，濾過，濾液作為提取物供試品溶液。
V.檢測波長的選擇 取積雪草苷對照品溶液適量，經(jīng)紫外分光光度儀在190～300nm波長下掃描，結(jié)果積雪草苷在204nm處波長有最大的吸收，故選擇204nm作為檢測波長。
VI.線性關(guān)系考察 精密吸取上述對照品溶液1、5、10、15、20μl，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以進樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程A＝95404.4C-4721.6，r＝0.9992；表明積雪草苷進樣量在0.48～9.6μg呈良好的線性關(guān)系，見圖3VII.缺味空白試驗 在與對照品相同保留時間未呈現(xiàn)色譜峰，說明空白無干擾。
VIII.精密度試驗 取同一份供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次，結(jié)果以峰面積計算RSD為2.1％。
IX.重現(xiàn)性試驗 精密稱取同一樣品五份，各吸取供試品溶液10μl，注入色譜儀中，結(jié)果以峰面積計算RSD為1.6％。
X.回收率試驗 精密稱取已知積雪草苷含量的同一批樣品，平行5份，分別加入積雪草苷對照品0.2mg，按含量測定方法操作，計算回收率。平均回收率為99.8％，RSD為2.41％。
XI.樣品測定 取3批樣品，照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，按上述色譜條件測定。
結(jié)果 三批積雪草藥材中積雪草苷分別為0.48、0.59、0.55％，平均含量為0.54％。提取液積雪草苷含量見表10。
②黃芪甲苷測定 照藥典附錄VI高效液相色譜法。
I.色譜條件 色譜柱為SHIMADZU VP-ODS(150L×4.6)，柱溫為室溫，流動相為乙腈-水(1∶2)，流速為1ml/min，檢測波長為200nm。在此條件下，樣品中黃芪甲苷與其他峰能達(dá)到基線分離，黃芪甲苷色譜峰的保留時間為6.2min(見圖4)。
II.檢測波長的選擇 取黃芪甲苷對照品溶液，經(jīng)紫外分光光度儀在190～300nm波長下掃描，結(jié)果黃芪甲苷在200nm處波長有最大的吸收，故選擇200nm作為檢測波長(見圖5)。
III.線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品2.2mg，加甲醇制成每毫升含0.44mg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液1，5，10，15，20μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程為A＝19794.37C+734.84，r＝0.9996，表明黃芪甲苷進樣量在0.44～8.80μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系(見圖6)。
IV.樣品處理方法 供試品溶液的制備同測定積雪草項下。
V.缺味空白試驗 在與對照品相同保留時間無色譜峰，說明無干擾。
VI.精密度試驗 取供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次，結(jié)果以峰面積計RSD為0.55％。
VII.重現(xiàn)性試驗 按樣品測定法，對同一批樣品依法測定5次，結(jié)果以峰面積計RSD為0.83％。
VIII.回收率試驗 取已測知黃芪甲苷含量的樣品，平行5份，分別精密加入黃芪甲苷對照品0.25mg，按含量測定方法操作，計算5次平均回收率為98.2％，RSD為2.34％。
(4)正交試驗結(jié)果與方差分析，見表10、11、12。
表10 L9(34)正交試驗結(jié)果分析
表11方差分析表(以積雪草苷為指標(biāo))
F0.05(2，9)＝4.26 F0.01(2，9)＝8.02表12方差分析表(以黃芪甲苷為指標(biāo))
F0.05(2，9)＝4.26 F0.01(2，9)＝8.02結(jié)果 表10直觀分析結(jié)果表明，以積雪草苷為評價指標(biāo)，影響因素的大小順序為A＞B＞C＞D；以黃芪甲苷為評價指標(biāo)，影響因素的大小順序為A＞C＞B＞D。表11、12方差分析結(jié)果表明，以積雪草苷、黃芪甲苷為考察指標(biāo)，因素A、B、C、D均有顯著性差異。
(5)結(jié)論 以積雪草苷為考察指標(biāo)，最佳工藝條件為A2B3C2D2；以黃芪甲苷為考察指標(biāo)，最佳工藝條件為A3B1C3D2。鑒于積雪草為處方中君藥，對試驗結(jié)果綜合考慮結(jié)果，以A2B3C3D2，即加10倍量的60％的乙醇，提取二次，每次3h為最佳提取工藝。
(6)最佳生產(chǎn)工藝條件驗證試驗①方法 取積雪草、黃芪各100g、脫脂桃仁28g，按最佳工藝條件進行提取(n＝3)，提取液濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至100ml，分別精密吸取2ml，稀釋至10ml，0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。分別用HPLC法按前述色譜條件測定黃芪甲苷含量，計算轉(zhuǎn)移率(％)。
②結(jié)果 黃芪藥材的黃芪甲苷含量為0.14％，黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率為51.43％。
③結(jié)論 藥材的最佳生產(chǎn)工藝條件合理、可行。
3.大孔樹脂法提純積雪草、黃芪、桃仁提取液的最佳生產(chǎn)工藝試驗研究(1)樹脂型號的考察 不同類型大孔吸附樹脂對總皂苷類化合物的飽和吸附容量及解吸率也不同。
①原理 一般非極性化合物在水中可以被非極性樹脂吸附，極性樹脂則在水中吸附極性物質(zhì)。積雪草苷、黃芪甲苷既有極性部分葡萄糖基，又有非極性部分三萜母核，這樣的結(jié)構(gòu)使其在水中有著一定的溶解度，同時非極性部分三萜母核的存在使其在非極性大孔樹脂上能較好地吸附。而極性較大的葡萄糖則在非極性大孔樹脂上難以吸附，因此皂苷類化合物分離提純應(yīng)采用非極性或弱極性樹脂，故選擇D101、AB-8、HPD100，比較其對皂苷類化合物的吸附容量及解吸率。
②結(jié)果(見表13)表13不同樹脂類型吸附、解吸測定結(jié)果
③結(jié)論 D101大孔樹脂對皂苷類化合物吸附量大，解吸快，適于該提取液的分離提純。
(2)藥材-樹脂比例的預(yù)試①試驗方法 取D101 20g，按不同的藥材-樹脂比，將積雪草、黃芪、脫脂桃仁的60％EtOH回流提取液濃縮至無醇味，靜置過夜，濾過，上樣。用水洗至洗脫液無色為止，水洗液蒸干，殘渣用10ml甲醇溶解，作為TLC點樣用的供試液。以積雪草苷、黃芪甲苷為考察指標(biāo)，將其對照品溶液與水洗液分別點于同一硅膠G薄層板上，吸取對照品溶液2μl、水洗液20μl，以氯仿-甲醇-水(13∶7∶2)10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴10％硫酸乙醇溶液，100℃加熱至斑點顯色清晰。
②結(jié)果 藥材-樹脂比1∶5、1∶2、1∶1.5的水洗液，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，均未呈現(xiàn)相同的顯色斑點，說明無泄漏。藥材-樹脂比1∶1水洗液，在積雪草苷、黃芪甲苷對照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同的藍(lán)色、紫色斑點，說明藥材-樹脂比1∶1時，水洗液有泄漏，故不可取。以此試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，擬用正交試驗進一步確定藥材-樹脂最佳比例。
(3)洗脫曲線的制備①原理 對非極性大孔吸附樹脂，洗脫極性越小，洗脫能力越強；對中等極性大孔樹脂和極性較大的化合物，則選用極性較大的洗脫劑為佳。
②方法 采用D101大孔樹脂，用水、10、20、40、70、80、95％EtOH進行梯度洗脫，以黃芪甲苷為考察指標(biāo)，考察最佳洗脫的乙醇濃度。
③供試品溶液的制備 取D101大孔樹脂20g，按藥材-樹脂比1∶2，將積雪草、黃芪、脫脂桃仁的提取液濃縮至無醇味，靜置過夜，濾過，上樣，依次用水、10、20、40、70、80、95％EtOH洗脫，分別收集各洗脫液，濃縮至干，殘渣用甲醇溶解并定容至10ml，0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。
④黃芪甲苷測定 HPLC法測定黃芪甲苷含量，測定條件同前，進樣10μl。
⑤測定結(jié)果，見表14。
表14不同濃度乙醇洗脫黃芪甲苷的測定結(jié)果
⑥洗脫曲線圖 以黃芪甲苷峰面積積分值為縱坐標(biāo)，乙醇濃度為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線(見圖7)。
由洗脫曲線可見，積雪草、黃芪總皂苷類的提純，可先用適量水洗滌大孔吸附樹脂柱，除去多糖等雜質(zhì)(用薄層色譜法檢識，防止皂苷洗下)，再用70％EtOH洗脫，收集70％EtOH洗脫液。
(4)洗脫條件的正交試驗①試驗因素與水平的確立以藥材-樹脂比(A)、柱床徑高比(B)、洗脫流速(C)、收集洗脫液量(D)四因素三水平(見表15)，按L9(34)正交表安排試驗。(柱的規(guī)格2.2cm×15.4cm)。
表15因素水平設(shè)計
②L9(34)正交試驗按L9(34)正交表安排試驗，上樣后，先用水洗脫至糖的反應(yīng)呈陰性(無還原糖反應(yīng))，改用70％EtOH洗脫，收集70％EtOH洗脫液，回收乙醇，濃縮，蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至10ml，微膜濾過，作為供試品溶液。由于無空白列，故作了重復(fù)試驗。
③黃芪甲苷含量測定采用HPLC法(HPLC測定條件同前)供試品溶液進樣10μl，按前述色譜條件測定，計算黃芪甲苷含量。
④正交試驗方案與結(jié)果，見表16、17。
表16 L9(34)正交試驗結(jié)果分析
表17方差分析結(jié)果
F0.05(2，9)＝4.26F0.01(2，9)＝8.02結(jié)果 表16直觀分析結(jié)果表明，影響因素大小順序為B＞A＞C＞D，最佳條件A2B1C1D3。表17方差分析結(jié)果表明，因素A、B、C、D均有極顯著差異。
⑤結(jié)論 選擇A2B1C1D3為最佳條件，即最佳條件為藥材-樹脂比1∶2，柱床徑高比1∶3，洗脫流速1BV/h，收集洗脫液量為樹脂用量的20倍。
(5)大孔樹脂最佳提純工藝條件驗證試驗①提純工藝條件考察方法 取100g D101用去離子水充分溶脹，倒入交換柱內(nèi)，先用相當(dāng)于樹脂體積2～4倍的去離子水以16BV/h洗至柱內(nèi)的水沉沒樹脂頂部2.5cm以上為止，以除去大孔樹脂中的水溶性雜質(zhì)，再以相當(dāng)于樹脂體積5倍的95％乙醇以同樣的流速洗脫至流出的乙醇液與水按1∶5混合時不顯白色渾濁即可，以去除樹脂中的油溶性雜質(zhì)。最后仍用2～5倍的去離子水洗凈后，按最佳提純工藝進行試驗(n＝3)，先水洗至Molisch反應(yīng)陰性，改用70％EtOH洗脫，收集70％EtOH洗脫液，回收乙醇，濃縮，蒸干，殘渣用甲醇溶解，定容至50ml容量瓶中，微膜濾過，濾液按前述HPLC條件測定其黃芪甲苷含量。
結(jié)果 藥材含量0.19％，上柱后黃芪甲苷平均含量為0.10％，黃芪甲苷轉(zhuǎn)移率為52.63％。
②洗脫率考察方法 照最佳工藝條件試驗，以黃芪甲苷為指標(biāo)，考察上柱前樣品和上柱后洗脫液的黃芪甲苷含量，計算洗脫率。
結(jié)果 上柱前黃芪甲苷含量為0.101％，上柱后洗脫液黃芪甲苷含量為0.0959％，洗脫率為94.95％。表明黃芪甲苷基本洗脫完全。
③結(jié)論 采用D 101大孔樹脂提純的生產(chǎn)工藝合理、可行。
4.大黃最佳滲漉生產(chǎn)工藝條件選擇試驗研究影響大黃滲漉提取率的主要因素有粒度、潤濕時間、流速、乙醇濃度、浸漬時間、滲漉液量等。故本研究進行二次正交試驗，分別以大黃素、大黃酸為考察指標(biāo)，選擇最佳滲漉工藝條件。
(1)因素水平表設(shè)計(見表18)考察粒度(A)、潤濕時間(B)、流速(C)，對大黃有效成分滲漉提取率的影響。其中滲漉條件乙醇濃度、浸漬時間、收集滲漉液量一致。
表18因素水平表
(2)按L9(34)正交表安排試驗①方法 稱取不同粒度藥材各100g，以藥材量的80％溶劑，按設(shè)計的不同潤濕時間濕潤，上柱，用乙醇浸漬24h后，收集不同流速的乙醇滲漉液，滲漉液量均為干藥材量的6倍。
②大黃素、大黃酸測定 照藥典附錄VI高效液相色譜法。
I.色譜條件 島津10-AVP高效液相色譜儀，色譜柱SUPELCOSILTmLC-18-DB15cm×4.6mm，5μm；參照中國藥典大黃含量測定項下，由于增加了大黃酸作為含量指標(biāo)，在藥典的流動相條件下大黃酸無法達(dá)到基線分離，結(jié)合試驗，將流動相調(diào)整為甲醇-0.2％磷酸溶液(75∶25)時，大黃酸、大黃素、及大黃酚分離良好且保留時間適宜。流速1.2ml/min；波長225nm；柱溫25℃。
表19穩(wěn)定性試驗結(jié)果
結(jié)果表明 大黃酸的RSD為2.92％，大黃素的RSD為2.24％，說明對照品溶液在8小時內(nèi)穩(wěn)定。
VIII.精密度試驗 每次吸取4μl對照品溶液(大黃酸每1ml含11μg，大黃素每1ml含14μg)，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣5次，測定二種對照品的峰面積，結(jié)果見表20。
表20精密度試驗結(jié)果
II.波長選擇 對大黃酸、大黃素對照品溶液分別進行了紫外吸收掃描，發(fā)現(xiàn)二種對照品分別在210～230nm、250～260nm都有一個明顯的吸收峰，其中以210～230nm處的為最大吸收峰，峰形較尖銳。比較同一對照品相同進樣量的峰面積，以及缺味樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)以225nm為檢測波長，二種對照品的峰面積都最大，說明靈敏度最高，并且缺味樣品無干擾，因此最終確定檢測波長為225nm。
III.對照品溶液制備 精密稱取大黃酸對照品3mg、大黃素對照品2.8mg，分別置50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得大黃酸對照品溶液(60μg/ml)、大黃素對照品溶液(56μg/ml)；分別精密吸取上述溶液各2.5ml，置10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(大黃酸每1ml中含15μg、大黃素每1ml中含14μg)。
IV.供試品溶液制備 分別精密吸取各份滲漉液0.5ml，蒸干，殘渣用甲醇溶解至25ml容量瓶中，0.45μm微膜濾過，濾液作為供試品溶液。
V.對照品純度試驗 精密吸取上述大黃酸對照品溶液1μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算純度為99.01％；精密吸取大黃素對照品溶液20μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算純度為99.42％。
VI.線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8、10μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，分別以峰面積積分值為縱座標(biāo)，對照品進樣量(μg)為橫座標(biāo)，進行線性回歸，得大黃酸的回歸方A＝-12721.22+3068902.20C，r＝0.9996；大黃素的回歸方程為A＝-14090.90+3158251.40C，r＝0.9998。結(jié)果表明，大黃酸在0.015～0.15μg范圍內(nèi)呈線性；大黃素在0.014～0.14μg范圍內(nèi)呈線性(標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖8)。
VII.穩(wěn)定性試驗 分別吸取新配制的對照品溶液(大黃酸每1ml含11μg，大黃素每1ml含14μg)4μl，在0、2、4、6、8小時，注入液相色譜儀，測定三種對照品的峰面積，結(jié)果見表19。
結(jié)果表明 大黃酸的RSD為1.98％，大黃素的RSD為1.48％，說明精密度良好。
IX.重現(xiàn)性試驗 取樣品(批號030902)五份，精密稱定，照供試品溶液制備方法操作，精密吸取樣品溶液3μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，計算含量，結(jié)果見表21。
表21重現(xiàn)性試驗結(jié)果
結(jié)果表明 RSD分別為2.98％、1.94％，說明重現(xiàn)性良好。
X.回收率試驗 取已知含量的樣品五份，每份約0.5g，在每一份中加入混合對照品溶液1ml(大黃酸每1ml含0.06mg、大黃素每1ml含0.056mg)照供試品溶液制備方法操作，精密吸取2μl，注入液相色譜儀中，測定峰面積，計算，結(jié)果見表22、23。
表22大黃酸回收率試驗結(jié)果
結(jié)果 大黃酸平均回收率為98.36％，RSD為2.18％。
表23大黃素回收率試驗結(jié)果
結(jié)果 大黃素平均回收率為100.09％，RSD為2.9％。
XI.樣品—藥材(制大黃)含量測定 按藥典含量測定方法對三批藥材進行測定，吸取10μl，結(jié)果見表24表24三批藥材(制大黃)含量測定結(jié)果(n＝3)
①正交試驗結(jié)果，見表25、26、27。
表25粒度、潤濕時間、流速正交試驗結(jié)果分析
表26方差分析表(以大黃素為指標(biāo))
F0.05(2，2)＝19.00 F0.01(2，2)＝99.00表27方差分析表(以大黃酸為指標(biāo))
F0.05(2，4)＝6.9F0.01(2，4)＝18.00結(jié)果 表25直觀分析結(jié)果表明，以大黃素為考察指標(biāo)，影響因素大小為A＞B＞C，因素A3B3C3為最佳；以大黃酸為考察指標(biāo)，影響因素大小為A＞B＞C，因素A3B3C1為最佳。表26、27方差分析結(jié)果表明，以大黃素為考察指標(biāo)，因素A有顯著影響；以大黃酸為考察指標(biāo)，因素A、B均有顯著影響。
④結(jié)論 綜上分析，選擇A3B3C3為最佳條件。即藥材為中粉，潤濕5h，流速為3ml/min。考慮大生產(chǎn)的需要，藥材粒度以粗粉為宜。
(2)考察乙醇濃度(A)、浸漬時間(B)、滲漉液量(C)，對大黃滲漉提取率的影響。其中滲漉條件粒度、潤濕時間、流速一致。
因素水平表設(shè)計(見表28)表28 因素水平表
②按L9(34)正交表安排試驗I.方法取藥材100g(粗粉)，潤濕5h，流速3ml/min，考察最佳浸漬時間、乙醇濃度、收集滲漉液量。
II.大黃素、大黃酸測定照藥典附錄VI高效液相色譜法。色譜條件、供試品制備、測定方法同(1)。
①正交試驗結(jié)果，見表29、30、31。
表29乙醇濃度、浸漬時間、收集滲漉液量正交試驗結(jié)果分析
表30方差分析表(以大黃素為指標(biāo))
F0.05(2，2)＝19.00F0.01(2，2)＝99.00表31方差分析表(以大黃酸為指標(biāo))
F0.05(2，4)＝6.9F0.01(2，4)＝18.00結(jié)果 表29直觀分析結(jié)果表明，以大黃素為考察指標(biāo)，影響因素大小為A＞B＞C＞D，因素A3B1C3為最佳；以大黃酸為考察指標(biāo)，影響因素大小為A＞B＞C＞D，因素A2B1C3為最佳。表30、31方差分析結(jié)果表明，以大黃素、大黃酸為考察指標(biāo)，因素A有顯著影響，因素B、C均無顯著差異。
④結(jié)論 綜上分析，選擇A2B1C2為最佳條件。即70％乙醇滲漉，浸漬24h，收集滲漉液量為干藥材量的6倍。
(3)大黃最佳滲漉生產(chǎn)工藝條件的驗證試驗①方法 取大黃粗粉100g，照最佳滲漉工藝條件進行試驗。并按(1)的色譜條件、供試品制備方法，測定大黃素、大黃酸含量，計算其轉(zhuǎn)移率％。
②結(jié)果 藥材大黃素含量為0.13％，大黃素的轉(zhuǎn)移率為60.5％；藥材大黃酸含量為0.31％，大黃酸的轉(zhuǎn)移率為62.2％。
③結(jié)論 大黃的生產(chǎn)工藝合理、可行。
5.當(dāng)歸揮發(fā)油SFE-CO2法最佳萃取生產(chǎn)工藝驗證試驗當(dāng)歸揮發(fā)油SFE-CO2萃取方法，經(jīng)過藥材提取方法試驗研究，證明該萃取條件可行。故未再進行最佳工藝條件選擇試驗，而是直接進行驗證試驗。
(1)方法 取當(dāng)歸粗粉500g(n＝3)，萃取條件萃取釜溫度45℃，壓力30MPa；分離釜I溫度65℃，壓力10MPa；分離釜II溫度60℃，壓力8MPa；分離釜III溫度55℃，壓力6MPa；提取時間2h；CO2流量36kg/h。
(2)結(jié)果 當(dāng)歸揮發(fā)油(含油脂)平均得率1.44％。
(3)結(jié)論 進一步證明文獻(xiàn)SFE-CO2的萃取條件合理、可行。
6.當(dāng)歸阿魏酸的SFE-CO2萃取最佳生產(chǎn)工藝條件選擇試驗研究。根據(jù)阿魏酸溶于水、稀醇的理化特性，取當(dāng)歸經(jīng)SFE-CO2法萃取揮發(fā)油后的殘渣，繼續(xù)用SFE-CO2法加夾帶劑萃取阿魏酸，并采用正交設(shè)計試驗，以阿魏酸為考核指標(biāo)，對夾帶劑的濃度、萃取條件進行優(yōu)選。
(1)正交試驗方法①試驗因素水平的設(shè)計根據(jù)預(yù)試結(jié)果，設(shè)定萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、萃取時間(C)夾帶劑濃度(D)四因素三水平(見表32)，以阿魏酸為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進行試驗。
表32因素水平設(shè)計
②L9(34)正交試驗按L9(34)條件安排試驗，每份各取當(dāng)歸提揮發(fā)油后殘渣250g投料，繼續(xù)SFE-CO2法萃取，夾帶劑用量為藥材量的40％(250g×40％＝100g)，分離釜I溫度50℃、壓力15MPa，分離釜II溫度45℃、壓力8MPa，分離釜III溫度40℃、壓力6MPa，CO2流量36kg/h。又由于無空白列，故作了重復(fù)試驗，使試驗結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
③阿魏酸HPLC測定方法I.色譜條件 色譜柱為SUPELCOSILTMLC-18-DB115cm×4.5mm，5μm)，柱溫25℃，流動相甲醇-0.05％冰乙酸(2∶3)，流速0.5ml/min，檢測波長320nm。在此條件下，樣品中阿魏酸色譜峰與其他峰能達(dá)到基線分離，阿魏酸色譜峰的保留時間為10.6min(見圖9)。
II.線性關(guān)系考察 精密稱取阿魏酸對照品0.12mg，加甲醇-1％冰乙酸制成每毫升含0.012mg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液1、5、10、15、20μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)作線性回歸，回歸方程為A＝6798.88965C-1.88942，r＝0.9998，表明阿魏酸進樣量在0.012～0.24μg范圍內(nèi)與峰面積是良好的線性關(guān)系(見圖10)。
III.樣品測定方法 每份提取液分別精密吸取0.5ml，用40％EtOH稀釋100倍(其中正交3號稀釋60倍，正交4號稀釋20倍)，微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液，進樣20μl，含量測定結(jié)果見正交試驗結(jié)果分析表25。
IV.精密度試驗 取同一供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次，結(jié)果以峰面積計RSD為1.2％，表明精密度較好。
V.重現(xiàn)性試驗 取同一批樣品，稱取5份，照上述供試品制備方法制備供試品溶液，分別進樣，結(jié)果以峰面積計RSD為2.8％，表明重復(fù)性較好。
VI.穩(wěn)定性試驗 分別在樣品制備后1，2，4，6，8，16h吸取供試液，測定阿魏酸含量，結(jié)果RSD為1.98％，表明阿魏酸溶液在16h內(nèi)是穩(wěn)定的。
VII.加樣回收率試驗 取已測知阿魏酸含量的樣品5份，分別精密加入阿魏酸對照品0.03mg，按含量測定方法操作，計算5次平均回收率為97.3％，RSD為2.01％。
VIII.三批藥材測試結(jié)果 阿魏酸平均含量為0.44mg/g。
④正交試驗結(jié)果與方差分析(見表33、34)。
表33 L9(34)正交試驗結(jié)果分析
表34方差分析
F0.05(2，9)＝4.26F0.01(2，9)＝8.02結(jié)果 表33直觀分析結(jié)果表明，影響因素大小順序為B＞D＞A＞C。表34方差分析結(jié)果表明，因素A、B、C、D均有顯著性差異。
⑤結(jié)論 綜合分析選擇A3B3C2D2為當(dāng)歸提揮發(fā)油后殘渣繼續(xù)SFE-CO2萃取阿魏酸的最佳條件，即其最佳條件為萃取釜溫度65℃、壓力45MPa，萃取時間2.5h，夾帶劑為70％EtOH(用量為藥材量的40％)。
⑥討論 阿魏酸含量測定采用TLC檢測當(dāng)歸加夾帶劑萃取阿魏酸后殘渣是否萃取完全。
I.TLC檢測 精密稱取當(dāng)歸加夾帶劑提阿魏酸后藥渣5.0065g，加200ml50％EtOH超聲處理1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1ml溶解，作為供試品溶液1。另取當(dāng)歸揮發(fā)油10ml，加20ml乙醚后用30ml水萃取三次，收集水層，蒸干，殘渣用1ml甲醇溶解，作為供試品溶液2。再取阿魏酸對照品，加甲醇制成每1ml含2.4mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述三種溶液各20μl，分別點于同一硅膠薄層板上，以苯一氯仿一甲醇(2∶2∶0.6)為展開劑，展開，取出，晾干，105℃加熱約l0min，紫外燈365nm下檢視。
II.結(jié)果 供試品溶液2在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，有一相同的藍(lán)色熒光斑點，而供試品溶液1在此位置上無斑點。由此說明殘渣中的阿魏酸已提取完全。
⑦最佳生產(chǎn)工藝驗證試驗I.方法 取當(dāng)歸粗粉500g按最佳工藝條件萃取揮發(fā)油及阿魏酸。
II.結(jié)果 藥材含油脂揮發(fā)油為1.69％，三批當(dāng)歸萃取揮發(fā)油(含油脂)平均1.44％，含油脂揮發(fā)油轉(zhuǎn)移率為85.2％；藥材含阿魏酸為0.438mg/g，萃取阿魏酸含量為0.345mg/g，轉(zhuǎn)移率為78.8％。
III.結(jié)論 當(dāng)歸先用SFE-CO2萃取揮發(fā)油，后加夾帶劑繼續(xù)萃取阿魏酸的提取生產(chǎn)工藝條件合理、可行。
7.冷凍干燥條件 總過程24小時，溫度為負(fù)30～35℃～正50℃，冷凍4～5h，慢慢升溫至50℃，開始升溫時抽真空至15～20MPa.水分3％以下。
權(quán)利要求
1.一種復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法，其特征在于所中藥組合物主要成分質(zhì)量組成如下積雪草15～45份，制大黃6～10份，桃仁6～10份，黃芪9～45份，當(dāng)歸6～20份；所述的提取方法按如下步驟進行(1)桃仁置于萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，留下脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，靜置，過濾，濾液用大孔樹脂提純，以水、乙醇水溶液梯度洗脫，洗脫液回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)潤濕后的制大黃，進行滲漉，40～95％乙醇水溶液浸漬24～48h，收集滲漉液，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入40～95％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加稀釋劑混勻，過篩，得混懸藥液，即為復(fù)方積雪草中藥有效成分。
2.如權(quán)利要求1所述的復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法，其特征在于所述的中藥組合物質(zhì)量組成如下積雪草20份，制大黃10份，桃仁10份，黃芪20份，當(dāng)歸6份；所述的提取方法按如下步驟進行(1)桃仁置于萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，留下脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，于40～70％乙醇水溶液中回流提取2～3次，合并提取液，靜置，過濾，濾液用大孔樹脂提純，以水、乙醇水溶液梯度洗脫，洗脫液回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)潤濕后的制大黃，進行滲漉，40～95％乙醇水溶液浸漬24～48h，收集滲漉液，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入40～95％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于萃取釜中，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加稀釋劑混勻，過篩，得混懸藥液，即為復(fù)方積雪草中藥有效成分。
3.如權(quán)利要求1或2所述的復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法，其特征在于所述的提取方法按如下步驟進行(1)桃仁置于萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，留下脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，加入藥材總質(zhì)量6～12倍的40～70％乙醇水溶液，回流提取2～3次，合并提取液，靜置過夜，過濾，濾液過大孔樹脂，濾液與樹脂質(zhì)量比為1∶1.5～2.5，柱床徑高比1∶3～4，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液進行洗脫，收集70％乙醇洗脫液量為樹脂用量10～20倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)潤濕1～5h后的制大黃，進行滲漉，40～95％乙醇水溶液浸漬24～48h，收集滲漉液量為干藥材質(zhì)量4～8倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入質(zhì)量為藥渣40％的40～95％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于萃取釜中，45～65℃、24～45Mpa下萃取1.5～3.5h，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，制成干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加稀釋劑，混勻，過篩，得混懸藥液，即為所述復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分。
4.如權(quán)利要求3所述的復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法，其特征在于所述的提取方法按如下步驟進行(1)桃仁于SFE-CO2萃取釜內(nèi)萃取，棄去揮發(fā)油，脫脂桃仁與積雪草、黃芪合并，加入藥材總質(zhì)量10倍的60％乙醇水溶液，回流提取2次，每次3h，合并提取液，靜置過夜，過濾，濾液過大孔樹脂，濾液與樹脂質(zhì)量比為1∶2，柱床徑高比1∶3，然后依次用水、20％和70％乙醇水溶液進行洗脫，收集70％乙醇洗脫液量為樹脂用量20倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(2)制大黃潤濕5h后，裝入滲漉筒，70％乙醇水溶液浸漬24h，收集滲漉液量為干藥材質(zhì)量6倍，回收乙醇至無醇味，得提取液；(3)取當(dāng)歸置于SFE-CO2萃取釜內(nèi)萃取揮發(fā)油，得揮發(fā)油與藥渣；往藥渣中加入質(zhì)量為藥渣40％的70％乙醇水溶液作為夾帶劑，置于SFE-CO2萃取釜中，釜溫65℃、壓力45Mpa下萃取2.5h，除乙醇，得萃取液；(4)步驟(1)所得提取液、步驟(2)所得提取液、步驟(3)所得萃取液合并，-35～50℃下冷凍4h后，抽真空至12～20MPa、水分含量小于3％，緩慢升溫至50℃，得凍干粉，粉碎、過篩，藥粉與步驟(3)所得揮發(fā)油加PEG-400，混勻，過篩，得混懸藥液，即為所述復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法，所述組合物主要成分質(zhì)量組成如下積雪草15～45份，制大黃6～10份，桃仁6～10份，黃芪9～45份，當(dāng)歸6～20份；所述方法按如下桃仁脫脂后與積雪草、黃芪合并進行醇提得提取液；制大黃潤濕后進行滲漉，得提取液；取當(dāng)歸萃取揮發(fā)油，得藥渣中加入乙醇水溶液作為夾帶劑，萃取，得萃取液；(4)上述所得提取液、萃取液合并，制成干粉，粉碎、過篩，藥粉與所得揮發(fā)油加稀釋劑混勻，過篩，得混懸藥液，即為復(fù)方積雪草中藥有效成分。本發(fā)明所述的復(fù)方積雪草中藥組合物有效成分的提取方法有效成分提取充分，療效好；所得有效成分安全、穩(wěn)定，可根據(jù)需要制成任何劑型，尤其適用于軟膠囊的制備。
文檔編號A61K9/48GK1772214SQ20051004899
公開日2006年5月17日 申請日期2005年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月24日
發(fā)明者王永鈞, 朱曉玲, 陳洪宇 申請人:王永鈞, 杭州市中醫(yī)院