專(zhuān)利名稱(chēng)：具有全新空間構(gòu)象且功效增強(qiáng)的重組干擾素、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種具有全新空間構(gòu)象且功效增強(qiáng)、副作用更低可大劑量使用的重組干擾素或其功能等同物，以及含有所述干擾素或其功能等同物的組合物和藥用組合物。本發(fā)明還涉及所述重組干擾素或其功能等同物的生產(chǎn)方法，在制備預(yù)防及治療病毒性疾病和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干擾素是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的可溶性糖蛋白。正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。根據(jù)干擾素的產(chǎn)生細(xì)胞、受體和活性等綜合因素將其分為2種類(lèi)型I型和II型。
I型干擾素的主要誘生劑是病毒及人工合成的雙鏈RNA。I型干擾素又稱(chēng)為抗病毒干擾素，其生物活性以抗病毒為主，共有3種形式IFNα、IFNβ、IFNω。II型干擾素又稱(chēng)為免疫干擾素或IFNγ，主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，其生物活性是參與免疫調(diào)節(jié)，是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。
干擾素的生物活性有較嚴(yán)格的種屬特異性，I型干擾素的抗病毒作用較強(qiáng)，對(duì)多種病毒如DNA病毒、RNA病毒均有抑制作用，但這種效應(yīng)不是直接的，而是通過(guò)對(duì)宿主細(xì)胞的作用引起的。
近年來(lái)，世界上的許多公司都在致力于干擾素的研究，也有這方面的許多報(bào)道。例如，美國(guó)專(zhuān)利4,695,623和4,897,471公開(kāi)了新型人干擾素多肽，所述干擾素的氨基酸序列含有天然產(chǎn)生的α-干擾素亞型多肽每一位點(diǎn)上發(fā)現(xiàn)的共同或占優(yōu)勢(shì)的氨基酸，因此所述干擾素被稱(chēng)之為共有干擾素(IFN-con)。公開(kāi)的氨基酸順序命名為IFN-con1、IFN-con2、及IFN-con3。也公開(kāi)了編碼IFN-con的工程基因的制備及所述基因在大腸桿菌中的表達(dá)。重組IFN-con與或者白細(xì)胞干擾素或其它重組I型干擾素比較的體外研究證實(shí)，IFN-con表現(xiàn)出顯著高的抗病毒、抗增殖及天然殺傷細(xì)胞活性。
美國(guó)專(zhuān)利5,372,808公開(kāi)了應(yīng)用共有人干擾素治療疾病的方法。與先前已批準(zhǔn)上市的α-干擾素如INTRON_A(IFN-α2b，美國(guó)先靈寶雅公司產(chǎn)品)相比，所述共有人干擾素產(chǎn)生較低的副作用。美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)已于1997年底批準(zhǔn)了美國(guó)安進(jìn)公司(Amgen)生產(chǎn)的共有干擾素用于臨床丙肝病人的治療，其商品名為干復(fù)津(interferonalfacon-1)。
對(duì)乙型肝炎病人的診斷，當(dāng)檢測(cè)出表面抗原(HBsAg)陽(yáng)性和e抗原(HBeAg)陽(yáng)性者即可判定為乙型肝炎患者。目前臨床上已采用各種類(lèi)型的人α型干擾素對(duì)慢性乙型肝炎患者進(jìn)行治療，其作用機(jī)理是干擾素與細(xì)胞的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其抗病毒DNA和RNA合成作用，包括對(duì)某些酶誘導(dǎo)作用阻止受病毒感染細(xì)胞中病毒的復(fù)制。但所有的干擾素體外藥效學(xué)顯示均只能抑制病毒DNA和RNA，不能直接抑制HBsAg與HBeAg的分泌。而且由于副作用大而不能大劑量使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種具有全新空間構(gòu)象且功效增強(qiáng)、副作用更低可大劑量使用的重組干擾素(下文將之簡(jiǎn)稱(chēng)為rSIFN-co)或其功能等同物。
本發(fā)明另一目的在于提供此種重組干擾素或其功能等同物的人工編碼基因。
本發(fā)明再一目的在于提供一個(gè)含有本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物的基因的載體。
本發(fā)明再一目的在于提供一個(gè)含有本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物的基因的載體的表達(dá)系統(tǒng)。所述的表達(dá)系統(tǒng)例如可以是適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。該宿主細(xì)胞可以是真核細(xì)胞，也可以是原核細(xì)胞，例如E.Coli。
本發(fā)明再一目的在于提供本發(fā)明重組干擾素的生產(chǎn)方法，其中包括將通過(guò)密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)的人工基因序列插入到適當(dāng)表達(dá)載體中，并引入到合適的宿主，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)表達(dá)并分離純化本發(fā)明重組干擾素的步驟。本發(fā)明還包括提供通過(guò)該方法生產(chǎn)的重組干擾素。
本發(fā)明再一目的在于提供一種含有本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物及適當(dāng)藥用載體的藥物組合物。
本發(fā)明再一目的在于提供本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物在制備預(yù)防及治療病毒性疾病和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種預(yù)防及治療病毒性疾病和治療腫瘤的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種高效力或低副作用的干擾素，其是通過(guò)改變?cè)摳蓴_素的空間構(gòu)象而得到的。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體包括如下幾個(gè)方面在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，并且其具有與干復(fù)津不同的空間構(gòu)象，所述干復(fù)津同樣具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“功能等同物”是指一種基于序列表中序列2所示的氨基酸，根據(jù)給定表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化密碼子重新設(shè)計(jì)的DNA所編碼的蛋白質(zhì)或肽，并且在功能上與本發(fā)明重組干擾素相似的分子。所述給定表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于E.Coli表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、CHO表達(dá)系統(tǒng)。它可以是一種缺失體，替代物或是由原序列突變而成的衍生物。另外，本發(fā)明也試圖涵蓋本發(fā)明重組干擾素的模擬分子。模擬分子可以是一種肽、多肽或小分子化合物。
本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)是通過(guò)基因重組技術(shù)制得的，其氨基酸序列的DNA編碼序列是根據(jù)大腸桿菌(E.Coli)密碼子偏愛(ài)性對(duì)野生型序列進(jìn)行調(diào)整并人工合成cDNA而得的。
本重組干擾素被認(rèn)為具有獨(dú)特的空間三維結(jié)構(gòu)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組干擾素在190-250nm范圍內(nèi)的圓二色譜顯著不同于在同樣條件下測(cè)得的干復(fù)津的圓二色譜。在250-320nm范圍內(nèi)的圓二色譜與文獻(xiàn)所報(bào)道的干復(fù)津的圓二色譜也顯著不同。請(qǐng)參見(jiàn)附圖6。
此外，本發(fā)明的重組干擾素在肌肉注射給體重指數(shù)為20-27范圍內(nèi)的人體后，以采血時(shí)間對(duì)受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶濃度作圖，所得曲線下的峰面積顯著大于在同一條件下注射干復(fù)津所獲得的曲線下的峰面積。所述曲線一般表現(xiàn)為雙峰，雖然該雙峰的形態(tài)、高度、雙峰之間的峰距可能因人的不同而有所差異。有時(shí)，所述雙峰之間的峰距和兩峰的高度差異并不特別顯著，甚至其形態(tài)接近于梯形峰，但是，在肌肉注射給體重指數(shù)為20-27范圍內(nèi)的人體后，以采血時(shí)間對(duì)受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶濃度作圖，所得曲線下的峰面積顯著大于在同一條件下注射干復(fù)津所獲得的曲線下的峰面積。此外，本發(fā)明的干擾素在注射給人體后其在人體內(nèi)的半衰期比干復(fù)津在人體內(nèi)的半衰期更長(zhǎng)。
已進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還證實(shí)，本發(fā)明的重組干擾素具有比目前投入臨床使用的其它任何干擾素(包括，干復(fù)津)更強(qiáng)的效力。所述的效力包括針對(duì)病毒，也包括針對(duì)腫瘤的。
預(yù)期本發(fā)明的重組干擾素對(duì)多數(shù)的病毒均有效。所述病毒包括，但不限于，乙肝病毒、丙肝病毒、野生型HIV或其耐藥株、天花病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、EB病毒、細(xì)胞黑色素病毒、單純性皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、其它皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、痘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、鼻病毒、腺病毒、RNA病毒、I型人T細(xì)胞白血病病毒、II型人T細(xì)胞白血病病毒或III型人T細(xì)胞白血病病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、輪狀病毒、禽流感病毒及其感染人的變異株、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、人合胞體病毒-1、人合胞體病毒-2、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、登革熱、黃熱病、布塔托羅病毒。其中，本發(fā)明的重組干擾素對(duì)于乙肝病毒、丙肝病毒、野生型HIV或其耐藥株、天花病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、單純性皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、流感病毒、禽流感病毒及其感染人的變異株的效力很顯著。例如，對(duì)于乙型肝炎病毒而言，本發(fā)明的重組干擾素不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制而且還能抑制乙肝病毒表面抗原和e抗原的分泌，抑制乙肝病毒核心抗原DNA復(fù)制的效力與干復(fù)津相比提高約一倍。
預(yù)期本發(fā)明的重組干擾素對(duì)多數(shù)的腫瘤均有效。所述腫瘤包括，但不限于，皮膚癌、基底細(xì)胞癌及惡性黑素瘤、腎細(xì)胞癌、肝癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、固狀腫瘤、前列腺癌、胃癌、食道癌、直腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、淺表膀胱癌、血管瘤、表皮樣癌、子宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、毛細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴腺瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡波基肉瘤、紅血球過(guò)多病。其中，實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，本發(fā)明的重組干擾素對(duì)于惡性黑素瘤、腎細(xì)胞癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、慢性骨髓性白血病、毛細(xì)胞白血病等腫瘤表現(xiàn)出顯著的效力。
此外，無(wú)論是用于預(yù)防或治療病毒性疾病還是用于治療腫瘤，已證實(shí)本發(fā)明的重組干擾素與其它任何干擾素(含干復(fù)津)相比具有更高的抗病毒活性和更低的副作用。例如，本發(fā)明的重組干擾素不但具有強(qiáng)于臨床現(xiàn)用干擾素20倍的抗病毒活性，以及明顯強(qiáng)于重組人α型干擾素的抗腫瘤增生作用；其還極大地降低了毒副作用并可安全的大劑量使用(每劑用量可＞1000萬(wàn)IU)，使需要大劑量用藥干擾素的部分病毒性疾病或腫瘤的成功治療成為可能。
本發(fā)明重組干擾素的體外藥效學(xué)顯示它不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制，而且能抑制表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，其細(xì)胞學(xué)毒性僅為臨床現(xiàn)用干擾素的1/8但抗病毒活性卻是臨床現(xiàn)用干擾素的5-20倍，同時(shí)在人體內(nèi)具有更高更廣譜更長(zhǎng)時(shí)間的生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)，可明顯抑制腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移。并且由于極大的降低了毒副作用，使需要大劑量用藥的部分病毒性疾病或腫瘤的成功治療成為可能。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種DNA序列，其包括編碼序列表中序列2所示氨基酸序列的核苷酸序列，該核苷酸序列是根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性對(duì)野生型序列進(jìn)行調(diào)整并人工合成cDNA而得的。為是該核苷酸序列得到表達(dá)，可以將其置于適當(dāng)?shù)膯?dòng)子控制之下。優(yōu)選所述的啟動(dòng)子包括，但不限于PBAD啟動(dòng)子。設(shè)計(jì)人工基因是一種公知的方法。在此之前，對(duì)于合成核苷酸序列及其它分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)有多種方法的描述。如Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning(分子克隆)A laboratory Manual，December 2000，publ ished by Cold Spring HarborLaboratory Press.對(duì)密碼子偏愛(ài)性的詳細(xì)探論可在美國(guó)專(zhuān)利第4695623中的第6欄，第41行-第7欄第35行中讀到。因此，根據(jù)確定的氨基酸序列，利用大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性重新設(shè)計(jì)rSIFN-co的cDNA編碼序列并人工合成。序列表中的序列1和序列3就是根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性而設(shè)計(jì)并人工合成的這種核苷酸序列的具體例子。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，其含有上述本發(fā)明的DNA序列。優(yōu)選該載體為一種表達(dá)載體，更優(yōu)選為一種能在E.Coli中表達(dá)目標(biāo)肽或蛋白的表達(dá)載體。
一個(gè)具體的實(shí)例為圖5中示出的質(zhì)粒pHY-5。該質(zhì)粒pHY-5是使用基因重組技術(shù)將rSIFN-co的cDNA序列克隆入大腸桿菌的高效表達(dá)載體pBAD18中而得的。質(zhì)粒pHY-5是通過(guò)L-阿拉伯糖誘導(dǎo)/活化表達(dá)調(diào)控機(jī)制，激活載體中的強(qiáng)PBAD啟動(dòng)子，導(dǎo)致下游的rS1FN-co基因高效表達(dá)。
這一阿拉伯糖誘導(dǎo)/活化表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)比通常遺傳工程生產(chǎn)中所采用的溫控、pH調(diào)控、IPTG誘導(dǎo)等系統(tǒng)有明顯的優(yōu)點(diǎn)(1)通常采用的幾種調(diào)控系統(tǒng)都是以“去阻遇”的形式解除對(duì)功能啟動(dòng)子的抑制作用，從而啟動(dòng)子可介導(dǎo)下游基因的表達(dá)。改變溫度、pH值本身以及加入IPTG誘導(dǎo)物等都對(duì)啟動(dòng)子無(wú)直接激活作用。在我們采用的系統(tǒng)中，阿拉伯糖與阻遏蛋白(AraC)結(jié)合后，不僅解除了對(duì)PBAD啟動(dòng)子的抑制作用，同時(shí)“阿拉伯糖-AraC復(fù)合物”又可直接激活PBAD啟動(dòng)子介導(dǎo)下游基因的表達(dá)。所以阿拉伯糖誘導(dǎo)/活化調(diào)控系統(tǒng)是一種比其它幾種系統(tǒng)更有效的大腸桿菌高效表達(dá)系統(tǒng)；(2)PBAD啟動(dòng)子活化的程度與加入的L-阿拉伯糖劑量成線性關(guān)系。這樣可以直接通過(guò)改變阿拉伯糖濃度而調(diào)節(jié)外源基因產(chǎn)物的表達(dá)量。這一特性對(duì)改變包涵體的形成等非常有意義。加入阿拉伯糖比改變溫度/pH等更容易直接控制外源基因產(chǎn)物在大腸桿菌中的表達(dá)；(3)L-阿拉伯糖來(lái)源豐富，價(jià)廉、無(wú)毒性，這克服其它誘導(dǎo)物如IPTG在這方面的缺點(diǎn)。(Guzman，L.M et alTight regulation，modulation，and high-level express-ion by vectors containingthe arabinose PBADpromoter.J.Bacteriol.1995，1774121～4130.)。
雖然在本文中詳細(xì)討論的啟動(dòng)子是PBAD，正如本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員所知的其它可誘導(dǎo)啟動(dòng)子如熱休克啟動(dòng)子，也可能被用于本發(fā)明。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種含有上述本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。該宿主細(xì)胞例如為E.Coli。
在發(fā)明的第五方面，提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的重組干擾素或其功能等同物以及任何可藥用的載體。在本文中使用的術(shù)語(yǔ)“可藥用的載體”是指任何標(biāo)準(zhǔn)的藥用載體。例如公知的適當(dāng)?shù)妮d體包括但不僅限于磷酸鹽緩沖液及各種潤(rùn)濕劑。其它載體可能包括用于片劑、顆粒劑及膠囊等的添加劑。典型的載體常含有如淀粉、乳液、糖、某種類(lèi)型的粘土、明膠、硬脂酸及其鹽類(lèi)如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物油脂、樹(shù)膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。這些載體中的成分可用公知的傳統(tǒng)方法調(diào)制。
相應(yīng)地，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成各種劑型。例如，可將本發(fā)明重組干擾素制備成常見(jiàn)的制劑形式，諸如注射劑、噴霧劑、凍干劑、緩釋劑、長(zhǎng)效制劑、片劑、膠囊、口服液、貼劑、栓劑、溶液制劑，推薦的劑型為注射劑、噴霧劑、凍干劑，給藥方式可皮下、肌肉或靜脈注射，或噴霧給藥如鼻腔噴霧或用呼吸機(jī)給藥。
在本發(fā)明的第六方面，提供了一種治療疾病的方法，該方法包括給需要治療的患者施用有效量的本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物。所述干擾素可以通過(guò)噴霧設(shè)備給予，例如通過(guò)圖15所示的用于鼻腔給藥的噴霧器給藥，也可以通過(guò)呼吸機(jī)給藥或通過(guò)通過(guò)粘膜給予。其它推薦的給藥方式包括注射方式，例如通過(guò)靜脈注射、肌肉內(nèi)注射或皮下注射給藥。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指在本發(fā)明的重組干擾素本身或含有該重組干擾素的藥物組合物施用給被治療的個(gè)體后，該個(gè)體產(chǎn)生癥狀的減輕、緩解或好轉(zhuǎn)所需要的最小的干擾素量。該有效量可能因被治療患者的年齡、體重、疾病的種類(lèi)、疾病的嚴(yán)重程度、患病時(shí)間的長(zhǎng)短、體質(zhì)狀況等因素而有所不同。臨床醫(yī)生或藥劑師可以結(jié)合本文公開(kāi)的內(nèi)容并根據(jù)實(shí)際的情況合理確定該有效量的范圍。例如，對(duì)于以注射方式對(duì)成人給藥而言，如果用于治療病毒性疾病，該有效劑量一般為每次注射5μg-30μg，優(yōu)選9μg-15μg，一周3次，24周一個(gè)療程；如果用于治療腫瘤，該有效劑量一般為每次注射9μg-50μg，優(yōu)選9μg-30μg，一周3次，24周一個(gè)療程。
在本發(fā)明的治療方法中，所述的干擾素或其功能等同物還可與其它抗腫瘤藥物或抗病毒藥物聯(lián)合使用。也可以與其它各種治療疾病的方法聯(lián)合使用。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種生產(chǎn)本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物的方法，包括下列步驟(a)將編碼序列表中序列2所示氨基酸序列的核苷酸序列引入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中并使所述的核苷酸序列置于適當(dāng)啟動(dòng)子的控制之下；(b)將步驟(a)構(gòu)建的載體引入宿主，并在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)條件下進(jìn)行表達(dá)，得到包涵體；(c)收集并純化步驟(b)得到的包涵體；(d)對(duì)步驟(c)獲得的包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性；以及(e)對(duì)復(fù)性后的產(chǎn)物依次進(jìn)行透析和離子層析。
在本發(fā)明制備重組干擾素的方法中，優(yōu)選所述的離子層析步驟依次包括HS陽(yáng)離子層析和銅離子層析。
如上文所述，在步驟(a)中使用的核苷酸序列是根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性對(duì)野生型序列進(jìn)行調(diào)整并人工合成cDNA而得的，優(yōu)選該序列是序列表中序列3所示的核苷酸序列。所述適當(dāng)?shù)膯?dòng)子包括但不限于PBAD。作為一個(gè)實(shí)例，本發(fā)明構(gòu)建的一個(gè)表達(dá)載體是pHY-5，該載體的宿主是大腸桿菌，其表達(dá)誘導(dǎo)劑是阿拉伯糖。通過(guò)對(duì)該菌株在適宜的條件下的培養(yǎng)發(fā)酵，收獲菌體，超聲波破菌并反復(fù)洗滌得包涵體，通過(guò)包涵體的變性、復(fù)性及分離純化工藝，獲得了大量高純度的與所有已知干擾素相比具有獨(dú)特空間構(gòu)象且功效增強(qiáng)、副作用更低可大劑量使用的rSIFN-co用于本發(fā)明的研究和臨床治療。
根據(jù)需要，在所述離子層析步驟之后，還可進(jìn)一步包括將已純化的干擾素凍干的步驟。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明的重組干擾素或其功能等同物在制備用于預(yù)防及治療病毒性疾病和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。具體而言，包括在制備治療乙型肝炎、腫瘤、嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥(SARS)或由病毒感染引起的上呼吸道疾病、流感病毒引起的疾病、埃博拉(Ebola)病毒引起的疾病、艾滋病和治療其他目標(biāo)個(gè)體病毒性疾病的藥物中的應(yīng)用。所述的其他目標(biāo)個(gè)體病毒性疾病包括甲型肝炎、丙型肝炎、其它類(lèi)型的肝炎。
預(yù)期本發(fā)明的重組干擾素還可以制備用于預(yù)防及治療下列病毒引起的疾病的藥物EB病毒、細(xì)胞黑色素病毒、單純性皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、其它皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、痘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、鼻病毒、腺病毒、RNA病毒、I型人T細(xì)胞白血病病毒、II型人T細(xì)胞白血病病毒或III型人T細(xì)胞白血病病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、輪狀病毒、副流感病毒、麻疹病毒、人合胞體病毒-1、人合胞體病毒-2、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、登革熱、黃熱病、布塔托羅病毒。
本發(fā)明提供的上述應(yīng)用中所針對(duì)的腫瘤包括


通過(guò)以下例子將有助于更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該知道，下文討論的具體方法和結(jié)果僅僅是對(duì)本發(fā)明的例證，本發(fā)明的保護(hù)范圍由權(quán)利要求書(shū)確定，而不受具體實(shí)例的限制。


圖1是根據(jù)rSIFN-co的氨基酸序列及大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性設(shè)計(jì)的rSIFN-co編碼cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖2是本發(fā)明rSIFN-co的另一種編碼cDNA序列。
圖3是pLac T7克隆載體質(zhì)粒圖。
圖4是pBAD18表達(dá)載體質(zhì)粒圖。
圖5是表達(dá)質(zhì)粒pHY-5的構(gòu)建程序圖。
圖6-A是干復(fù)津(interferon alfacon-1)的波長(zhǎng)范圍為250nm-190nm的圓二色譜圖。
圖6-B是參考文獻(xiàn)“Journal of Interferon and Cytokine Research.16489-499(1996)”記載的干復(fù)津(interferon alfacon-1)的圓二色譜圖。
圖6-C是本發(fā)明rSIFN-co的波長(zhǎng)范圍為320nm-250nm的圓二色譜圖。
圖6-D是本發(fā)明rSIFN-co的波長(zhǎng)范圍為250nm-190nm的圓二色譜圖。
圖7顯示的是本發(fā)明rSIFN-co晶體I。
圖8顯示的是本發(fā)明rSIFN-co晶體II。
圖9顯示的是本發(fā)明rSIFN-co晶體I的X-射線衍射圖譜。
圖10顯示的是不同干擾素對(duì)乙肝病毒基因表達(dá)及核心抗原基因抑制的比較。
圖11是注射本發(fā)明rSIFN-co與干復(fù)津(interferon alfacon-1)不同采血時(shí)間比較寡聚核苷酸酶濃度(2-5A濃度)所作的曲線圖。
圖12A是顯示給藥本發(fā)明rSIFN-co后，受試者體溫變化曲線。實(shí)驗(yàn)A分為兩組，A1組(結(jié)果顯示在圖12A1)和A2組(結(jié)果顯示在圖12A2)。該圖的結(jié)果顯示在A1組和A2組之間的結(jié)果沒(méi)有顯著性差異。
圖12B是顯示給藥干復(fù)津后，受試者體溫變化曲線。實(shí)驗(yàn)B也分為兩組，B1組(結(jié)果顯示在圖12B1)和B2組(結(jié)果顯示在圖12B2)。該圖的結(jié)果顯示在B1組和B2組之間的結(jié)果沒(méi)有顯著性差異。但是，將圖12A和圖12B顯示的結(jié)果進(jìn)行比較，實(shí)驗(yàn)A和實(shí)驗(yàn)B的結(jié)果之間差異顯著，實(shí)驗(yàn)A組比實(shí)驗(yàn)B組的體溫低約0.5攝氏度。
圖13顯示的是本發(fā)明rSIFN-co對(duì)流感病毒傳染性抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖14-A顯示的是本發(fā)明rSIFN-co對(duì)野生性HIV傳染性抑制實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。
圖14-B顯示的是本發(fā)明rSIFN-co對(duì)變異耐藥性HIV傳染性抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖15顯示的是一種用于鼻腔給藥本發(fā)明rSIFN-co噴霧劑的設(shè)備以及該噴霧劑設(shè)備使用說(shuō)明。
圖16A-圖16H顯示的是下文給出的例十五中將詳細(xì)描述的患者1的診斷報(bào)告書(shū)。該圖顯示了本發(fā)明干擾素結(jié)合手術(shù)和化療手段對(duì)癌癥患者的顯著療效。
具體實(shí)施例方式
例一根據(jù)已發(fā)表的干復(fù)津(interferon alfacon-1)編碼DNA序列及推斷的氨基酸序列資料(Klein ML，Bartley TD，Lai PH，et al.，Structural characterizationof recombinant consensus interferon-alpha.Journal of Chromatography，1988；454205-215)，見(jiàn)圖1，我們利用大腸桿菌優(yōu)先表達(dá)密碼子(The Wisconsin Package，byGenetics Computer Group，Inc.Copyright 1992，Medison，Wisconsin，USA)，在保證氨基酸序列不變的情況下，對(duì)其DNA編碼序列進(jìn)行了分子設(shè)計(jì)，然后人工合成其rSIFN-co全長(zhǎng)cDNA編碼基因。
為了獲得大量高純度的rSIFN-co蛋白用于研究和臨床治療，我們采用重組DNA技術(shù)將rSIFN-co全長(zhǎng)cDNA序列克隆到大腸桿菌高效表達(dá)載體中去，然后利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)/活化表達(dá)調(diào)控機(jī)制激活載體中的強(qiáng)PBAD啟動(dòng)子介導(dǎo)下游的rSIFN-co基因高效表達(dá)。
大腸桿菌cDNA序列的合成rSIFN-co cDNA序列的重新設(shè)計(jì)為了在大腸桿菌中得到高效表達(dá)，根據(jù)已發(fā)表的干復(fù)津的氨基酸序列采用大腸桿菌優(yōu)先密碼子對(duì)全長(zhǎng)rSIFN-co核苷酸編碼序列進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，由新設(shè)計(jì)的rSIFN-co cDNA序列推斷其編碼氨基酸序列與干復(fù)津氨基酸序列完全-致，見(jiàn)圖1。
合成rSIFN-co cDNA序列rSIFN-co cDNA 5′-端和3′-端半分子的合成用PCR方法直接合成rSIFN-co cDNA 5′-端280bp(I片段)和3′-端268bp(II片段)兩個(gè)cDNA半分子。片段I的3′-端與片段II的5′-端有41bp的核苷酸序列重疊互補(bǔ)。
化學(xué)合成如下寡聚脫氧核苷酸片段Oligomer A5’ATGTGCGACCTGCCGCAGACCCACTCCCTGGGTAACCGTCGTGCTCTGATCCTGCTGGCTCAGATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGAC3’Oligomer B5’CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGAAAGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3’Oligomer C5’GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCCAGCAGGGATTCGTCCCAAGCAGCGGAGGAGTCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3’Oligomer D5’ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCGTTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGCTGATGAAC3’Oligomer E5’GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTATCACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3’Oligomer F5’TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTTCAGCACGAACAACTTCCCAAGCGCACGGGGAGTATTTTTTTTCGGTCAGG3’(2)PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)I合成rSIFN-co 5′-端半分子用寡聚脫氧核苷酸片段B作為模板，A和C兩個(gè)寡聚脫氧核苷酸片段作為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)合成長(zhǎng)度為280bp的rSIFN-co 5′-端半分子產(chǎn)物。
PCRI反應(yīng)混合物(單位μl)


(總體積 50μl)PCR I反應(yīng)周期95℃ 2′→(95℃ 45″→65℃ 1′→72℃ 1′)×25周期→72℃ 10′→4℃PCR反應(yīng)II合成rSIFN-co 3′-端半分子用寡聚脫氧核苷酸片段E作為模板，D和F兩個(gè)寡聚脫氧核苷酸片段作為引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)合成長(zhǎng)度為268bp的rSIFN-co 3′-端半分子產(chǎn)物。
PCRII反應(yīng)混合物 (單位μl)

(總體積 50μl)PCRII反應(yīng)條件和周期同PCRIrSIFN-co全長(zhǎng)cDNA分子的組裝采用“重疊-延伸PCR”方法將上述PCR合成的I和II片段組裝在一起從而得到完整的rSIFN-co cDNA全長(zhǎng)分子序列。并且在其5′-端和3′-端分別引入NdeI和PstI限制性酶切位點(diǎn)，以便于將rSIFN-co cDNA序列克隆到質(zhì)粒載體中去。
(1)化學(xué)合成引物Oligomer G5’ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3’Oligomer H5’ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3’(2)“重疊-延伸PCR”反應(yīng)
PCR反應(yīng)混合物 單位(μl)

(總體積 50μl)注用美國(guó)Stratagen公司生產(chǎn)的StrataPrep PCR純化試劑盒將PCR產(chǎn)物先進(jìn)行分離純化，然后溶于消毒蒸餾水中。
PCR反應(yīng)條件及周期同前述PCRI。
rSIFN-co基因的克隆及序列分析選用pLac T7質(zhì)粒作為rSIFN-co cDNA基因克隆的載體。pLac T7質(zhì)粒是經(jīng)pBluescript IIKS(+)質(zhì)粒(美國(guó)Stratagen公司生產(chǎn))改造而成，其質(zhì)粒圖譜見(jiàn)圖3。
用StrataPrep PCR純化試劑盒(美國(guó)Stratagen公司生產(chǎn))將含rSIFN-c0全長(zhǎng)cDNA PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，然后用NdeI和PstI進(jìn)行酶切；同時(shí)將pLac T7質(zhì)粒進(jìn)行NdeI和PstI雙重酶切。將這二種酶切DNA片段在1％瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳分離，然后用美國(guó)Promoga公司的Winzard DNA純化試劑盒從膠中回收，純化507bp長(zhǎng)的rSIFN-co DNA片段和2.9kb的質(zhì)粒酶切DNA片段。將二者經(jīng)T4DNA連接酶催化連接成重組質(zhì)粒。將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞(美國(guó)Gibco公司生產(chǎn))。經(jīng)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選陽(yáng)性重組菌落，命名為pHY-1。
按DNA序列分析試劑盒(SequiThermTM Cycle Sequencing Kit，購(gòu)自美國(guó)Epicentre Technologi es公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA序列測(cè)定反應(yīng)，其中引物為通用T7和T3引物，DNA測(cè)序結(jié)果顯示其與理論設(shè)計(jì)相符。
純化的重組rSIFN-co蛋白進(jìn)行N-末端16個(gè)氨基酸序列測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與圖1N-末端氨基酸理論序列結(jié)果一致。其結(jié)果為N端Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-其N(xiāo)-末端的甲硫氨酸(Met)在成熟蛋白中被切除。
表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、酶切鑒定及其遺傳穩(wěn)定性表達(dá)載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化將大腸桿菌表達(dá)載體pBAD18質(zhì)粒，見(jiàn)圖4，先經(jīng)Nde I酶解，使質(zhì)粒線性化(Linearized)，然后用Xba I進(jìn)行充分酶解。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，再用德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAEXII試劑盒純化，得到pBAD18經(jīng)NdeI和XbaI消化的4.8kb片段。
與此同時(shí)將pHY-1質(zhì)粒進(jìn)行Nde I和Xba I雙酶切，同樣經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，純化出715bp大小的序列片段。將上述4.8kb的pBAD18片段與715bp的rSIFN-co和pBAD18酶切片段在T4DNA連接酶催化下連接成重組質(zhì)粒，其構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖5。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂于LB-Amp瓊脂平板，置37℃培養(yǎng)過(guò)夜。
陽(yáng)性克隆菌株的篩選隨機(jī)從上述LB平板中挑起單個(gè)細(xì)菌菌落，用核酸內(nèi)切酶酶解，PCR分析的方法篩選含rSIFN-co全長(zhǎng)編碼序列的重組質(zhì)粒菌株。將其中一個(gè)PCR陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pHY-5。將含有pHY-5質(zhì)粒的菌株命名為PVIII，擴(kuò)增后加入甘油凍存液凍存于-80℃?zhèn)溆谩?br> rSIFN-co基因在E.coli中的高效表達(dá)在pHY-5質(zhì)粒中，rSIFN-co基因處于強(qiáng)啟動(dòng)子PBAD的調(diào)控之中，而PBAD又受Ara C蛋白的調(diào)控。Ara C是由位于同一質(zhì)粒中的ara C基因編碼的蛋白質(zhì)。在沒(méi)有阿拉伯糖存在的情況下，Ara C二聚體與O2及I2結(jié)合形成一個(gè)210bp的環(huán)。這一結(jié)構(gòu)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的完全抑制。當(dāng)加入阿拉伯糖時(shí)，Ara C二聚體與O2脫離，并轉(zhuǎn)而與I1和I2結(jié)合，解除對(duì)轉(zhuǎn)錄的抑制。阿拉伯糖結(jié)合失活、抑制、及激活PBAD啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而刺激PBAD介導(dǎo)高水平的rSIFN-co表達(dá)。rSIFN-co表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的50％。
例二重組干擾素(rSIFN-co)的分離純化工程菌的發(fā)酵將工程菌種接種在LB培養(yǎng)基中，37℃，搖瓶振蕩(200rpm)培養(yǎng)過(guò)夜(約18小時(shí))，細(xì)菌培養(yǎng)液中加入50％濃度為30％的甘油混勻分裝成1ml每支，-20℃保存，作為生產(chǎn)菌種。
生產(chǎn)菌種按1％的比例接入LB培養(yǎng)基(1L中含有蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化鈉10g)，37℃，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜，作為I級(jí)種子菌。I級(jí)種子菌再按10％的比例加入RM培養(yǎng)基(1L中含有酪蛋白20g，氯化鎂1mmol/L(0.203g)，磷酸氫二鈉4g，磷酸二氫鉀3g，氯化鈉0.5g，氯化胺1g)中，37℃，pH 7.0，發(fā)酵至OD600值2.0左右加入阿拉伯糖(20％)至終濃度0.02％誘導(dǎo)，4小時(shí)后收菌，離心。菌體沉淀用適量緩沖液A(100mmol/L Tri s鹽酸pH7.5-10mmol/L EDTA-100mmol/L氯化鈉)重混懸，置-20℃冷凍過(guò)夜，取出融化后，勻漿機(jī)破菌，離心，再用緩沖液B(50mmol/L Tris鹽酸pH 7.5-1mol/L尿素-10mmol/L EDTA-0.5％Triton X-100)、緩沖液C(50mmol/LTris鹽酸pH 7.5-2mol/L尿素-10mmol/L EDTA-0.5％Triton X-100)分別洗滌沉淀兩次，再用蒸餾水洗滌一次，得到包涵體。
變性及復(fù)性用6mol/L鹽酸胍(或尿素)溶解包涵體得到稍渾濁的變性液，10000rpm高速離心，取上清測(cè)定變性液的蛋白濃度。按終蛋白濃度0.3mg/ml，分三次將變性液加入已配制好的復(fù)性液(0.5mol/L精氨酸-150mmol/L Tris鹽酸pH 7.5-0.2mmol/L EDTA)中，并在4℃連續(xù)攪拌過(guò)夜(約18小時(shí))。然后，依次用10倍體積的10mol/L、5mol/L的PB緩沖液及蒸餾水透析。透析完畢，用2mol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)調(diào)pH，靜置，過(guò)濾。
純化HS陽(yáng)離子層析首先，柱體先用20mmol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)平衡，以30ml/min的速度上樣，用20個(gè)柱體積的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)，洗脫雜蛋白。接著，用5個(gè)柱體積含0.15mol/L氯化鈉的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)，洗脫雜蛋白。然后，再用3個(gè)柱體積含0.18mol/L氯化鈉的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)，洗脫雜蛋白。最后，用含0.25mol/L氯化鈉的20mmol/L醋酸-醋酸鈉(pH 5.0)解離目標(biāo)蛋白。
銅離子親和層析(chelating sepharoseTMfast flow)將HS解離蛋白液加入0.2mol/L、pH 6.6的PB緩沖液及4mol/L的氯化鈉調(diào)到含1mol/L氯化鈉，pH 6.0后，備上樣。柱體用含1mol/L氯化鈉的50mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.5)平衡，以1ml/min的速度上樣。接著，用50mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液(pH 5.0)，洗脫雜蛋白；再用50mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0)，洗脫雜蛋白；然后，再用50mmol/L磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3.6)，解離目標(biāo)蛋白。
樣品濃縮將螯合柱解離目標(biāo)蛋白液稀釋30倍，并調(diào)pH 5.0上HS，以含0.5mol/L氯化鈉的PB緩沖液(pH 7.0)解離，收集即得本發(fā)明重組干擾素原液。其物化參數(shù)如下表所列。
在某些情況下，如果要求樣品純度更高可通過(guò)分子篩(sephacryl S-100)進(jìn)一步純化。
所得蛋白質(zhì)原液的一些物化參數(shù)

注“生物制品化學(xué)及其他檢定方法”、“生物制品熱原質(zhì)試驗(yàn)規(guī)程”、“生物制品細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)規(guī)程”皆可在《中國(guó)生物制品規(guī)程》，潘正安、張興輝、段志兵等；中國(guó)生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)；化學(xué)工業(yè)出版社；2000年版中找到。
例三本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與干復(fù)津(interferon alfacon-1)的空間構(gòu)象差別利用圓二色譜法比較本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與干復(fù)津(interferonalfacon-1)的空間構(gòu)象差別。
采用圓二色譜儀J-500C，設(shè)定測(cè)定靈敏度為2m°/cm，光程為0.20cm，測(cè)定干復(fù)津樣品在波長(zhǎng)范圍為190nm-250nm內(nèi)的圓二色譜；所述干復(fù)津樣品含30μg/ml干復(fù)津，5.9mg/ml NaCl，3.8mg/ml Na2PO4，pH 7.0。其結(jié)果如圖6A所示。
采用圓二色譜儀J-500C，設(shè)定測(cè)定靈敏度為2m°/cm，光程為2cm，測(cè)定本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)樣品在波長(zhǎng)范圍為250nm-320nm內(nèi)的圓二色譜；所述干擾素樣品含0.5mg/ml rSIFN-co，5.9mg/ml NaCl，3.8mg/mlNa2PO4，pH 7.0。其結(jié)果如圖6C所示。
采用圓二色譜儀J-500C，設(shè)定測(cè)定靈敏度為2m°/cm，光程為0.20cm，測(cè)定本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)樣品在波長(zhǎng)范圍為190nm-250nm內(nèi)的圓二色譜；所述干擾素樣品含30μg/ml rSIFN-co，5.9mg/ml NaCl，3.8mg/mlNa2PO4，pH 7.0。其結(jié)果如圖6D所示。
比較圖A-圖D，可以看出，本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與干復(fù)津(interferon alfacon-1)具有不同空間三維結(jié)構(gòu)。
例四重組干擾素(rSIFN-co)晶體生長(zhǎng)及晶體學(xué)參數(shù)測(cè)定本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)的晶體研究。經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的摸索與實(shí)驗(yàn)，目前已獲得兩種晶體，見(jiàn)附圖7，附圖8。
1、晶體生長(zhǎng)rSIFN-co蛋白用純水溶解至終濃度3mg/ml。最初的結(jié)晶條件搜索使用Hampton公司的Hampton Research Crystal Screen I and II。采用氣象懸滴擴(kuò)散法，池液500μl，液滴1μl蛋白+1μl池液，溫度為293K。最初搜索得到兩種不同類(lèi)型的小晶體，通過(guò)優(yōu)化后的晶體條件列于下表。
rSIFN-co蛋白結(jié)晶條件

2、數(shù)據(jù)采集及處理晶體I已用于X-射線衍射數(shù)據(jù)收集和初步晶體學(xué)分析，并完成晶體學(xué)參數(shù)測(cè)定。衍射數(shù)據(jù)收集在常溫進(jìn)行，將晶體I(條件I)封入薄壁石英管中。使用BrukerAXS Smart CCD探測(cè)器，光源采用Nonius FR591旋轉(zhuǎn)陽(yáng)極靶X光發(fā)生器產(chǎn)生的CuKα射線(λ＝1.5418_)。光源功率2千瓦(40kv×50mA)，波長(zhǎng)1.00_，曝光時(shí)間60秒，Δφ＝2°，晶體到探測(cè)器之間的距離為50mm。數(shù)據(jù)處理使用Bruker公司的Proteum程序包。晶體的衍射圖譜(局部)見(jiàn)附圖9。處理結(jié)果見(jiàn)下表。
晶體學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果晶胞參數(shù)a(_) 82.67b(_) 108.04c(_) 135.01α(_)90.00β(_)90.00γ(_)98.35空間群 P2或P21分辨率 5_不對(duì)稱(chēng)單位分子數(shù) 10
溶劑含量 57.6％另外，按照已發(fā)表的十幾種其它干擾素蛋白的結(jié)晶條件，也嘗試了將rSIFN-co進(jìn)行結(jié)晶，但均未有晶體長(zhǎng)出。而與rSIFN-co最為相近的(一級(jí)結(jié)構(gòu)87％同源)huIFN-α2b的結(jié)晶條件非常復(fù)雜，經(jīng)過(guò)三次接種晶體長(zhǎng)到0.5×0.5×0.3mm時(shí)分辨率為2.9_，空間群也為P21，晶胞也很大，一個(gè)不對(duì)稱(chēng)單位有6個(gè)分子，溶劑含量約60％。
例五本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)抑制HBV-DNA的復(fù)制及HBsAg和HbeAg1.試驗(yàn)材料1.1受試藥本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)，凍干制劑，蛋白含量9μg/支，由四川省生物工程研究中心提供。于4℃冰箱保存。
溶劑及配制方法受試藥物配制時(shí)向每支原料瓶?jī)?nèi)加入0.5ml細(xì)胞培養(yǎng)液，溶解后，再根據(jù)所設(shè)不同劑量組濃度差異用MEM培養(yǎng)液調(diào)配。現(xiàn)用現(xiàn)配。
1.2陽(yáng)性對(duì)照藥安進(jìn)公司生產(chǎn)的干復(fù)津(interferon alfacon-1)，9μg/支；先靈保雅公司生產(chǎn)的干擾能(IFN-α2b)，30μg/支。
1.3 2.2.15細(xì)胞乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(Hep G2)的2.2.15細(xì)胞系，美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建。
1.4試劑Eagles MEM干粉、G-418(Geneticin)、酵母t-RNA、蛋白酶K，美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；胎牛血清，美國(guó)Hyclone Lab公司產(chǎn)品；L-谷氨酰胺，京科化學(xué)試劑公司進(jìn)口分裝；HBsAg，HBeAg固相放射免疫測(cè)定盒，購(gòu)自中國(guó)同位素公司北方免疫試劑研究所；卡那霉素，華北制藥廠產(chǎn)品；聚乙二醇，瑞典Fluka產(chǎn)品；d-32P-dTCP，北京亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司產(chǎn)品；二氧化碳孵箱，美國(guó)Shel-Lab產(chǎn)品；γ-計(jì)數(shù)儀，德國(guó)BECKMAN產(chǎn)品；掃描儀MICROTEK產(chǎn)品；gel-pro analyzer軟件MEDIA Cybemetice_產(chǎn)品；1.5細(xì)胞培養(yǎng)液及試劑配制MEM培養(yǎng)液100ml含胎牛血清10％，谷氨酰胺0.03％，G418 380μg/ml，卡那霉素50U/ml。
2.試驗(yàn)方法2.12.2.15細(xì)胞培養(yǎng)在長(zhǎng)滿2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加0.25％胰酶，37℃消化3分鐘，加培養(yǎng)液吹散，1∶3傳代，10天長(zhǎng)滿。
2.2藥物對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分無(wú)藥物細(xì)胞對(duì)照組和不同藥物濃度藥物組。細(xì)胞消化，配制成每毫升10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，接種培養(yǎng)板，96孔板每孔200μl，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)成單層后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明重組干擾素用培養(yǎng)液配制成18μg/ml溶液，2倍稀釋加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每濃度3孔，每4天換同濃度藥液，以觀察細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，8天顯微鏡下觀察細(xì)胞病變，完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無(wú)病變?yōu)?。計(jì)算每濃度藥液平均細(xì)胞病變程度和抑制％。按ReedMuench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度(TC50)和最大無(wú)毒濃度(TC0)。
TC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝log稀釋倍數(shù)2.3對(duì)HBeAg、HBsAg抑制試驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)HBeAg、HBsAg陽(yáng)性對(duì)照組，陰性對(duì)照組，細(xì)胞對(duì)照組及不同藥物濃度藥物組。2.2.15細(xì)胞每毫升70萬(wàn)個(gè)接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，試驗(yàn)藥液無(wú)毒濃度以下3倍稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度分別為9.0、3.0、1.0、0.33、0.11和0.056μg/ml，每濃度1孔，37℃5％CO2培養(yǎng)，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，第8天時(shí)收獲培養(yǎng)液，-20℃冰凍保存。試驗(yàn)重復(fù)三批，分別測(cè)定HBsAg和HBeAg。HBsAg和HBeAg測(cè)定采用中國(guó)同位素公司北方免疫試劑研究所產(chǎn)品，固相放射免疫測(cè)定盒測(cè)定，方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，用γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔cpm值。
藥物效果計(jì)算計(jì)算細(xì)胞對(duì)照及每濃度cpm均值及標(biāo)準(zhǔn)差，P/N值如抑制百分率(％)，半數(shù)有效濃度(IC50)及選擇指數(shù)(SI)。
②計(jì)算藥物抑制抗原半數(shù)有效濃度(IC50)IC50=Antilog(B+50-BA-B×C)]]>A＝log＞50％藥物濃度B＝log＜50％藥物濃度C＝log稀釋倍數(shù)
③本發(fā)明重組干擾素在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HBsAg和HBeAg的選擇指數(shù)(S1)，按其對(duì)細(xì)胞毒性指標(biāo)細(xì)胞病變(S1)計(jì)算。
④以t檢驗(yàn)法計(jì)算各稀釋度HBsAg、HBeAg和對(duì)照組間cpm的差別的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.4 對(duì)2.2.15細(xì)胞DNA抑制實(shí)驗(yàn)2.2.15細(xì)胞上清中HBV-DNA提取2.2.15細(xì)胞每毫升70萬(wàn)個(gè)接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔3ml，接種后24小時(shí)加入干擾素，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，加藥后培養(yǎng)第8天收取上清液，加入聚乙二醇沉淀，離心去上清，加蛋白酶K裂解細(xì)胞，加入酵母t-RNA，等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇抽取2次，高速10,000g離心，取上清，加無(wú)水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于TE緩沖液中作樣品。
斑點(diǎn)雜交①點(diǎn)樣取20ul(DNA含量25ug)，加變性液變性，用中和液將其中和，并以20X SSC緩沖液對(duì)倍稀釋至1∶128倍稀釋于硝酸纖維素膜上，膜置室溫晾干后放置在80℃烤箱中干烤，以固定DNA。②預(yù)雜交將硝酸纖維素膜裝于塑料袋中加預(yù)雜交液6ml，置水浴中預(yù)雜交2小時(shí)。③雜交加入5×107cpmα-32p-dCTP標(biāo)記的變性HBV-DNA探針，于42℃水浴中雜交14-18小時(shí)。④洗膜以0.1×SSC/0.1％SDS分別在室溫和65℃洗膜。⑤放射放射自顯影吸干膜上流動(dòng)水分，夾片、曝光。以常規(guī)方法沖洗X光片。掃描儀掃描光片，用gel-pro軟件測(cè)定密度，計(jì)算抑制率及IC50。
Southernblot①2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA提取2.2.15細(xì)胞加藥后培養(yǎng)8天，吸除培養(yǎng)液收取細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，裂解細(xì)胞，等體積苯酚氯仿異戊醇抽提2次，高速10,000g離心，取上清，加無(wú)水乙醇沉淀核酸，真空抽干，重溶于20μl TE緩沖液中；②電泳加入6X DNA樣品緩沖液，將樣品加于1.5％瓊脂糖膠上電泳，IV/em，恒壓，14-18小時(shí)；③變性、雜交將膠分別浸于HCl、變性液、中和液中；④轉(zhuǎn)膜按程序?qū)NA轉(zhuǎn)至Hybond-N膜上。同斑點(diǎn)雜交一同進(jìn)行烤膜、雜交、曝光。掃描儀掃描光片，以gel-pro凝膠分析軟件分析相對(duì)密度，計(jì)算抑制率及IC50。
3、統(tǒng)計(jì)與分析各組數(shù)據(jù)以平均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(S)表示，以Student t檢驗(yàn)檢測(cè)各組均數(shù)差異顯著性。細(xì)胞培養(yǎng)毒性按Reed Muench法計(jì)算半數(shù)有毒濃度(TC50)和最大無(wú)毒濃度(TC50)。對(duì)HBV-DNA抑制效果按所列公式計(jì)算，對(duì)HBsAg和HBeAg抑制效果以gel-pro凝膠分析軟件分析光片相對(duì)密度，計(jì)算抑制率及IC50。
4、試驗(yàn)結(jié)果4.1在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞毒性為觀察rSIFN-co對(duì)乙型肝炎病毒基因轉(zhuǎn)染的人肝癌2.2.15細(xì)胞的毒性，在接種2.2.15細(xì)胞后24小時(shí)，加2倍稀釋藥液。試驗(yàn)自18μg/ml開(kāi)始9、4.5、2.25、1.13......μg/ml 7個(gè)稀釋度，4天換一次藥，維持8天，第八天用顯微鏡觀察細(xì)胞病變，鏡檢CPE，TC50的結(jié)果分別為本發(fā)明重組干擾素18μg/ml、干復(fù)津9μg/ml、干擾能3μg/ml。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1本發(fā)明重組干擾素在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞的毒性

二批平均18±0 9±0表2 干復(fù)津在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞的毒性

二批平均 ＞9±0＞9±0表3干擾能在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞的毒性

4.2對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中HBsAg和HBeAg表達(dá)的作用4.2.1本發(fā)明重組干擾素在對(duì)HBsAg和HBeAg的作用本發(fā)明重組干擾素9、3、1、0.33和0.11μg/ml加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)體系中，第8天觀察其對(duì)HBeAg和HBsAg的表達(dá)效果。結(jié)果見(jiàn)表4。
4.2.1.1對(duì)HBeAg的抑制率三批試驗(yàn)rSIFN-co 9、3、1、0.33和0.11μg/ml各濃度組對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清第8天上清液HBeAg的平均抑制率分別為46.0±5.25％、40.57±6.08％、19.8±4.40％、8.85±9.44％、5.73±5.85％。本發(fā)明重組干擾素對(duì)HBeAg的IC50分別為6.02、3.64、3.94μg/ml，平均為4.5±1.32μg/ml。
4.2.1.2對(duì)HBsAg的抑制率三批試驗(yàn)rSIFN-co 9、3、1、0.33和0.11μg/ml各濃度組對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第8天上清液HBsAg的平均抑制率分別為44.8±6.6％、27.9±2.41％、6.30±5.46％、2.57±4.45％、4.23±6.90％。本發(fā)明重組干擾素對(duì)HBsAg的IC50分別為6.42、6.12、6.94μg/ml，平均為6.49±0.42μg/ml。對(duì)2.2.15細(xì)胞TC50為18μg/ml，選擇指數(shù)SI分別為3.96和2.77。
表4本發(fā)明重組干擾素對(duì)HBeAg和HBsAg的作用第一批實(shí)驗(yàn)HBeAg

HBsAg

第二批實(shí)驗(yàn)HBeAg


HBsAg

第三批實(shí)驗(yàn)HBeAg

HBsAg

HBeAg平均IC50為4.54±1.32μg/ml，TC50為18μg/ml，選擇指數(shù)為3.96HBsAg平均IC50為6.49±0.42μg/ml，TC50為18μg/ml，選擇指數(shù)為2.774.2.2干復(fù)津?qū)BeAg和HBsAg的作用干復(fù)津9、3、1、0.33和0.11μg/ml加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)體系中，第8天測(cè)定培養(yǎng)液HBsAg和HBeAg滴度，計(jì)算抑制效果，結(jié)果見(jiàn)表5。
4.2.2.1對(duì)HBeAg的抑制率三批試驗(yàn)干復(fù)津各濃度組對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第8天上清液HBeAg的平均抑制率分別為9μg/ml抑制14.37±4.33％、3μg/ml抑制7.4±4.13％、1μg/ml抑制3.7±2.0％、0.33μg/ml、0.11μg/ml無(wú)抑制。最高濃度9μg/ml僅抑制14.37±4.33％。
4.2.2.2對(duì)HBsAg的抑制率三批試驗(yàn)干復(fù)津各濃度組對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第8天上清液HBsAg的平均抑制率分別為9μg/ml抑制2.0±1.83％、3μg/ml抑制4.5±5.07％、1μg/ml、0.33μg/ml、0.11μg/ml無(wú)抑制。最高濃度9μg/ml僅抑制2.0±1.83％。
表5.干復(fù)津?qū)BeAg和HBsAg的作用第一批實(shí)驗(yàn)HBeAg

HBsAg

第二批實(shí)驗(yàn)HBeAg

HBsAg


第三批實(shí)驗(yàn)HBeAg

HBsAg

4.2.3干擾能對(duì)HBeAg和HBsAg的作用干擾能3倍稀釋1、0.33、0.11和0.037μg/ml加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)，第8天測(cè)定培養(yǎng)液HBeAg和HBsAg滴度，計(jì)算抑制效果。由于樣品不足，僅進(jìn)行一批實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。
4.2.3.1對(duì)HBeAg的抑制率干擾能各濃度組對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第8天上清液HBeAg的平均抑制率只有1μg/ml抑制6.87％、0.33μg/ml、0.11μg/ml和0.037μg/ml無(wú)抑制。說(shuō)明干擾能對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg抑制作用微弱，最高濃度1μg/ml僅抑制6.87％。
4.2.3.2對(duì)HBsAg的抑制率干擾能1、0.33、0.11和0.037μg/ml各濃度組對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)第8天1、0.33μg/ml組上清液HBsAg的平均抑制率分別為17.8％、1.85％。0.11μg/ml、0.037μg/ml無(wú)抑制。表明干擾能對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg抑制作用微弱，最高濃度1μg/ml僅抑制17.8％。
表6.干擾能在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBeAg和HBsAg的作用HBeAg

HBsAg

4.3對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液HBV-DNA的抑制作用4.3.1本發(fā)明重組干擾素在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBV-DNA斑點(diǎn)雜交結(jié)果見(jiàn)表7。
表7.本發(fā)明重組干擾素在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中對(duì)HBV-DNA的作用第一批實(shí)驗(yàn)HBV-DNA斑點(diǎn)密度值


IC50(以稀釋1/2對(duì)HBV-DNA的抑制％計(jì)算)0.789μg/ml第二批實(shí)驗(yàn)HBV-DNA斑點(diǎn)密度值



本發(fā)明重組干擾素對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中對(duì)HBV-DNA的作用，平均IC50為0.766±0.318μg/ml，TC50為18μg，選擇指數(shù)為23.5。
4.3.2干復(fù)津在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)上清液中HBV-DNA的作用見(jiàn)表8。
表8.干復(fù)津在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)上清液中HBV-DNA的作用第一批實(shí)驗(yàn)在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)上清液斑點(diǎn)雜交HBV-DNA密度值


IC50(以稀釋1/2對(duì)HBV-DNA的抑制％計(jì)算)＞9.0μg/ml第二批實(shí)驗(yàn)在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)上清液斑點(diǎn)雜交HBV-DNA密度值



兩批實(shí)驗(yàn)干復(fù)津?qū)?.2.15細(xì)胞上清液內(nèi)HBV-DNA無(wú)明顯抑制作用，IC50為＞9±0μg/ml。選擇指數(shù)為＜1。
4.3.3干擾能在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)上清液中HBV-DNA的作用見(jiàn)表9。
表9.干擾能在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)上清液中HBV-DNA的作用第一批實(shí)驗(yàn)在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)上清液斑點(diǎn)雜交HBV-DNA密度值


IC50(以稀釋1/2對(duì)HBV-DNA的抑制％計(jì)算)0.0635μg/ml一批實(shí)驗(yàn)干擾能對(duì)2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA有明顯的抑制作用，IC50為0.0635μg/ml。TC50為3μg/ml，選擇指數(shù)為47.2。
4.4受試藥在2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA Southern Blot的抑制作用4.4.1本發(fā)明重組干擾素在2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA的Southern Blot抑制作用，兩批實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表10。
表10.本發(fā)明重組干擾素在2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA Southern Blot的抑制數(shù)據(jù)



結(jié)果表明本發(fā)明重組干擾素接種細(xì)胞內(nèi)總HBV-DNA Southern blot測(cè)定結(jié)果inlane抑制作用平均IC50為0.826±0.294μg/ml，TC50為18μg/ml，SI為21.79。
4.4.2干復(fù)津在2.2.15細(xì)胞內(nèi)對(duì)HBV-DNA的Southern Blot抑制作用，兩批實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表11。
表11.干復(fù)津在2.2.15細(xì)胞內(nèi)對(duì)HBV-DNA的Southern Blot的抑制作用


結(jié)果表明干復(fù)津接種細(xì)胞內(nèi)總HBV-DNA Southern Blot測(cè)定in lane，抑制作用，IC505.63±0.012μg/ml，TC50為＞9μg/ml，SI為1.60。
4.4.3先靈葆雅干擾能在2.2.15細(xì)胞內(nèi)對(duì)HBV-DNA的Southern Blot抑制作用，一批實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表12。
表12.先靈葆雅干擾能在2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA Southern Blot的抑制作用

結(jié)果表明先靈葆雅干擾能接種細(xì)胞內(nèi)總HBV-DNA Southern Blot測(cè)定in lane計(jì)算的抑制作用平均為IC500.095μg/ml，TC50為3μg/ml，SI為31.58。
5結(jié)論本試驗(yàn)觀察了受試藥在乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞2.2.15細(xì)胞系培養(yǎng)中對(duì)細(xì)胞的毒性，對(duì)HBeAg和HBsAg分泌以及對(duì)HBV-DNA的抑制作用。結(jié)論如下5.1對(duì)2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)的毒性不同給藥濃度的本發(fā)明重組干擾素，分別加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，以細(xì)胞病變?yōu)橹笜?biāo)，與干復(fù)津及干擾能相比，本發(fā)明重組干擾素半數(shù)毒性濃度(TC50)為18±0μg/ml，最大無(wú)毒濃度(TC0)為9±0μg ml。干復(fù)津的最大濃度9±0μg/ml無(wú)毒性，半數(shù)毒性濃度(TC50)和最大無(wú)毒濃度(TC0)都為＞9±μg/ml。干擾能半數(shù)毒性濃度(TC50)為3±0μg/ml，最大無(wú)毒濃度(TC0)為1.5±0μg/ml。
5.2在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HBeAg和HBsAg的分泌的抑制作用各樣品以最大無(wú)毒濃度加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，本發(fā)明重組干擾素9±0μg/ml對(duì)HBeAg的抑制率為46.0±5.25％(P＜0.001)，IC50為4.54±1.32μg/ml，選擇指數(shù)SI為3.96，有明顯抑制作用，最大無(wú)毒濃度9μg/ml對(duì)HBsAg的抑制率為44.8±6.6％，IC50為6.49±0.42μg/ml，選擇指數(shù)SI為2.77。干復(fù)津和干擾能對(duì)HBeAg和HBsAg抑制作用弱，最高濃度僅抑制20％以下。
5.3在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)HBV-DNA抑制作用各樣品以最大無(wú)毒濃度加入2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)8天，本發(fā)明重組干擾素斑點(diǎn)雜交和Southern Blot測(cè)定HBV-DNA結(jié)果分別為IC50為0.766±0.318μg/ml，SI為23.5；Southern BlotA結(jié)果平均IC50為0.826±0.294μg/ml，SI為21.79。干復(fù)津二批實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)雜交IC50為＞9±0μg/ml，SI為＜1。Southern Blot結(jié)果平均IC50為5.63±0.12μg/ml，SI為1.60；干擾能一批實(shí)驗(yàn)斑點(diǎn)雜交IC50為0.0635±0.294μg/ml，SI為47.2，Southern Blot結(jié)果平均IC50為0.095±0μg/ml，SI為31.58。
表13.總結(jié)表

本發(fā)明重組干擾素對(duì)細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA也有明顯抑制作用，但與其他干擾素不同，高濃度9μg/ml在2.2.15細(xì)胞中可抑制HBeAg和HBsAg的分泌。美國(guó)安進(jìn)公司生產(chǎn)的干復(fù)津和美國(guó)先靈葆雅公司生產(chǎn)的干擾能在2.2.15細(xì)胞中不能抑制HBeAg和HBsAg的分泌。
例六本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)乙肝病毒基因表達(dá)及核心抗原表達(dá)的抑制實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選取本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)、干復(fù)津(interferon alfacon-1)及干擾能(IFN-α2b)對(duì)乙肝病毒基因表達(dá)及核心抗原基因進(jìn)行抑制實(shí)驗(yàn)。
乙型肝炎病毒(HBV)DNA包含了反式激活蛋白的保守結(jié)合序列，這種蛋白的結(jié)合活性是受干擾素調(diào)控的。用干擾素處理HBV轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞導(dǎo)致HBV基因表達(dá)的抑制。本研究的目的是研究不同的干擾素對(duì)HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。用含HBV增強(qiáng)子EnH I、EnH II和核心啟動(dòng)子的控制下的熒光素酶基因的報(bào)道質(zhì)粒(reporter plasmid)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人類(lèi)肝細(xì)胞癌細(xì)胞。
一、材料和方法1.干擾素本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)、干復(fù)津(IFN-conl)及干擾能(IFN-α2b)。
2.報(bào)道質(zhì)粒PCR擴(kuò)增包含了EnH I、EnH II和核心啟動(dòng)子的DNA切片，末端切平，克隆到pGL3-Basic(Promega，WI，USA)的無(wú)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子的熒光素酶基因前的Smal I位點(diǎn)，產(chǎn)生的報(bào)告質(zhì)粒命名為pGL3-HBV-Luc。
3.細(xì)胞培養(yǎng)和DNA轉(zhuǎn)變感染將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補(bǔ)加10％FBS，100U/ml的青霉素和100ug/ml鏈霉素。將細(xì)胞放置于溫度30℃，含5％的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。使用Boehringer的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒將pGL3-HBV-Luc報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。經(jīng)過(guò)18小時(shí)，移走含有轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，注入含有或不含有干擾素的新鮮培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時(shí)。
4.熒光素酶測(cè)定注入干擾素48小時(shí)后，收集并破碎細(xì)胞。該細(xì)胞溶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)濃度由Bio-Rad蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)，熒光素酶活性測(cè)定使用Promega的熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)，按照制造商提供的指南進(jìn)行。
二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖10。由附圖10所示可知，干擾能抑制率為27％，干復(fù)津抑制率為35％，rSIFN-co抑制率為68％。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)乙型肝炎病毒基因表達(dá)及核心抗原表達(dá)的抑制比美國(guó)安進(jìn)公司的干復(fù)津和先靈葆雅公司的干擾能對(duì)乙型肝炎病毒基因表達(dá)及核心抗原表達(dá)的抑制率高出兩倍左右。
例七本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)制劑實(shí)例配方注射用

噴霧劑

例八本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)制劑凍干注射劑的制備本發(fā)明重組干擾素原液 34.5μg/ml
pH7.0的磷酸鹽緩沖液10mmol/L甘氨酸 0.4mol/L制備工藝按處方稱(chēng)料，無(wú)菌無(wú)熱原注射水溶解，0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌，于6-10℃保存，取樣作無(wú)菌和熱原檢查合格后分裝西林瓶中，單劑量0.3/瓶或0.5/瓶。分裝后放置至凍干機(jī)中冷凍干燥。
水溶液注射劑的制備本發(fā)明重組干擾素原液 34.5μg/mlpH7.0的磷酸鹽緩沖液25mmol/L氯化鈉 0.1mol/L制備工藝按處方稱(chēng)料，無(wú)菌無(wú)熱原注射水溶解，0.22μm孔徑濾膜過(guò)濾除菌，于6-10℃保存，取樣作無(wú)菌和熱原檢查合格后分裝于密閉容器中，單劑量0.3/瓶或0.5/瓶，分裝后成品置2-10℃暗處保存。
例九本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)注射用凍干粉針劑的穩(wěn)定性我們將本發(fā)明重組干擾素凍干粉針劑三批各兩種規(guī)格樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)起始時(shí)間2000年4月。
一、樣品來(lái)源本發(fā)明重組干擾素連續(xù)三批各兩種規(guī)格凍干粉針劑由四川省生物工程研究中心制備，中試樣品批號(hào)分別為990101、990102、990103，各兩個(gè)亞批。
二、樣品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的各樣品試驗(yàn)前應(yīng)符合下表要求
試驗(yàn)前樣品指標(biāo)

三、試驗(yàn)內(nèi)容1、2～8℃留樣考察將待考察樣品置于2～8℃冰箱中，分別設(shè)定在第1、3、6、9、12、18、24、30、36月取樣，測(cè)定上述指標(biāo)，并作好記錄。
2、25℃留樣考察將待考察樣品置于25℃恒溫箱中，分別設(shè)定在第1、3、6、9、12、18、24、30月取樣，測(cè)定上述指標(biāo)，并作好記錄。
3、37℃留樣考察將待考察樣品置于37℃恒溫箱中，分別設(shè)定在第1、3、6、9、12、18、24月取樣，測(cè)定上述指標(biāo)，并作好記錄。
四、結(jié)果與討論1、凍干 rSIFN-co三批(990101、990102、990103)各兩個(gè)規(guī)格樣品在37℃留樣觀察，在不同時(shí)期取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，與試驗(yàn)前比較，第6個(gè)月開(kāi)始效價(jià)呈下降趨勢(shì)，三批樣品效價(jià)變化相仿，其余檢測(cè)指標(biāo)符合要求。
2、凍干 rSIFN-co三批(990101、990102、990103)各兩個(gè)規(guī)格樣品在25℃留樣觀察，在不同時(shí)期取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，與試驗(yàn)前比較，9個(gè)月內(nèi)，效價(jià)變化不大，其余檢測(cè)指標(biāo)符號(hào)要求。
3、凍干 rSIFN-co三批(990101、990102、990103)各兩個(gè)規(guī)格樣品在2~8℃留樣觀察，在不同時(shí)期取樣檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，與試驗(yàn)前比較，9個(gè)月內(nèi)效價(jià)穩(wěn)定，無(wú)明顯變化，各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)符合要求。
因此，我們建議本發(fā)明重組干擾素的凍干的貯藏、運(yùn)輸應(yīng)以低溫為妥，達(dá)不到低溫條件的情況下，短時(shí)間內(nèi)(3個(gè)月)可室溫放置。
例十本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)噴霧劑
rSIFN-co具有廣譜抗病毒作用，其體外抗病毒活性是現(xiàn)有其他干擾素的5-20倍。體外試驗(yàn)顯示本發(fā)明重組干擾素具有顯著的抗SARS病毒活性，本發(fā)明重組干擾素對(duì)10000和1000TCID50SARS病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.92和0.18μg/ml，治療指數(shù)相應(yīng)為151.28和773.32。詳見(jiàn)實(shí)例十六。
本發(fā)明重組干擾素噴霧劑，主要活性成分即為rSIFN-co，性狀為無(wú)色液體，無(wú)肉眼可見(jiàn)不溶物。其抗病毒機(jī)制主要通過(guò)干擾素同靶細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合，誘導(dǎo)靶細(xì)胞內(nèi)2’5’一A合成酶、蛋白激酶等多種抗病毒蛋白，阻止病毒蛋白質(zhì)的合成。并通過(guò)誘生多種抗病毒蛋白，抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制增強(qiáng)NK細(xì)胞活性及其他免疫調(diào)節(jié)作用，有效地遏制病毒侵襲和感染的發(fā)生。在本發(fā)明重組干擾素噴霧劑的毒理試驗(yàn)中，最大劑量靜脈或肌肉注射小鼠全部健存，無(wú)死亡，未測(cè)出LD50。通過(guò)rSIFN-co噴霧劑的藥理、毒理研究，證明本發(fā)明重組干擾素噴霧劑適用于預(yù)防或治療嚴(yán)重急性呼吸道綜合癥或由病毒感染引起的上呼吸道疾病。
本發(fā)明重組干擾素噴霧劑的不良反應(yīng)研究目前世界上尚未見(jiàn)重組干擾素噴霧劑不良反應(yīng)的報(bào)道，一般不會(huì)引起刺激、過(guò)敏以及全身反應(yīng)。用藥期間個(gè)別人員偶爾出現(xiàn)輕度刺激以及胃腸反應(yīng)，若無(wú)其他明顯反應(yīng)，無(wú)須終止給藥rSIFN-co噴霧劑，可自行緩解。
本發(fā)明重組干擾素噴霧劑在4-8℃冷藏避光條件下保存，勿冷凍。使用圖15所示的噴霧器，其按照以下方法和使用量給藥每日早、中、晚每個(gè)鼻孔各噴一次，咽喉一次。每次給藥時(shí)，取掉藥瓶塑料噴頭罩，擠壓，噴射一次(見(jiàn)附圖15)。每撳噴量為0.1ml，霧化度為15.60-30.51μm(由定量噴頭霧化噴出)。所述噴霧器高90mm，底寬25mm，頂寬6mm，重9g，每噴體積0.1ml。
例十一本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)急性毒性試驗(yàn)本試驗(yàn)采用一次給小鼠肌肉注射本發(fā)明重組干擾素150μg/kg(相當(dāng)于成人每公斤體重用量的1000倍)。觀察給藥后2周內(nèi)動(dòng)物急性毒性反應(yīng)及死亡情況。結(jié)果表明一次肌注給藥后，24小時(shí)內(nèi)動(dòng)物未見(jiàn)異常情況，處死部分動(dòng)物并尸解經(jīng)肉眼觀察各主要臟器未見(jiàn)肉眼可見(jiàn)的病變。余下的小鼠2周內(nèi)亦未見(jiàn)異常反應(yīng)，亦無(wú)一只死亡，于第14天稱(chēng)重發(fā)現(xiàn)，給藥組與對(duì)照組小鼠體重均有所增加，且兩組體重增加值無(wú)明顯差異(P＞0.05)。處死小鼠尸解各主要臟器無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變。
一、實(shí)驗(yàn)材料1、試驗(yàn)動(dòng)物成年健康KM小鼠40只，體重18～22g，雌雄各半，SPF級(jí)，質(zhì)量合格證川實(shí)動(dòng)管質(zhì)第6號(hào)，1998年合格，使用實(shí)施合格證川實(shí)動(dòng)管第99-5號(hào)，合格，醫(yī)動(dòng)學(xué)第24A00003號(hào)，合格。
2、試驗(yàn)藥品本發(fā)明重組干擾素由四川省生物工程研究中心提供，無(wú)菌液體，0.15mg/ml，批號(hào)981201用注射用生理鹽水配成所需濃度即用。
二、實(shí)驗(yàn)方法將40只小鼠按體重、性別隨機(jī)分為2組，分別為生理鹽水陰性對(duì)照組和本發(fā)明重組干擾素組(150μg/kg)，每組20只小鼠，雌雄各半，分別給每只小鼠肌注生理鹽水和相應(yīng)藥物，給藥容積均為0.1ml/10g，一次給藥后，觀察各小鼠急性毒性反應(yīng)。于給藥后24小時(shí)將各組動(dòng)物處死一半(雌雄各半)，尸解觀察小鼠心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胃、十二指腸等主要臟器有無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變，如有則做病理組織學(xué)檢查。余下的動(dòng)物繼續(xù)觀察，于給藥后第14天，稱(chēng)重后處死動(dòng)物并尸解，觀察各小鼠主要臟器有無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變，如有則做病理組織學(xué)檢查，并將給藥組小鼠體重變化值與陰性對(duì)照組小鼠體重值進(jìn)行t檢驗(yàn)，判斷有無(wú)顯著性差異。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，小鼠肌注一次給予本發(fā)明重組干擾素150μg/kg，相當(dāng)于人用劑量的1000倍，小鼠未出現(xiàn)毒性反應(yīng)，給藥后的14天內(nèi)，各小鼠攝食、飲水、活動(dòng)、毛發(fā)、大小便等未見(jiàn)異常，亦無(wú)一只小鼠死亡。肉眼觀察給藥后24小時(shí)處死并尸解的小鼠，結(jié)果表明小鼠各臟器無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變。于給藥后第14天稱(chēng)體重后處死并尸解的小鼠，其各主要臟器也均無(wú)肉眼可見(jiàn)的病變，且給藥組與陰性對(duì)照組小鼠體重均有所增加，其體重增加值與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，結(jié)果見(jiàn)下表。
本發(fā)明重組干擾素一次給藥后對(duì)小鼠體重的影響(X±SD)

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論在本試驗(yàn)條件下，一次肌注本發(fā)明重組干擾素150μg/kg小鼠均未見(jiàn)毒性反應(yīng)。因此，本發(fā)明重組干擾素肌肉注射小鼠的最大耐受劑量大于150μg/kg，相當(dāng)于人用劑量的1000倍。
例十二本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)為了考察人體對(duì)本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)在人體的吸收及代謝情況，同時(shí)為了向臨床使用本品提供藥代動(dòng)力學(xué)方面的參考資料，四川省生物工程研究中心于2003年在四川大學(xué)華西醫(yī)院進(jìn)行了本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。
一、入選標(biāo)準(zhǔn)1、簽署知情同意書(shū)；2、一般體格檢查正常，病史及用藥史符合試驗(yàn)要求；3、年齡20～30歲男性；4、體重指數(shù)在20～27范圍內(nèi)(體重指數(shù)＝體重(公斤)/身高(米)2)；5、血、尿、糞便常規(guī)化驗(yàn)和心、肝、腎功能檢查，均屬正常。
二、排除標(biāo)準(zhǔn)1、有藥物、食物過(guò)敏史者；2、試驗(yàn)前患過(guò)重病者；3、經(jīng)常用藥、嗜煙酒者；4、精神病患者5、3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其它藥物臨床試驗(yàn)者；6、3個(gè)月內(nèi)用過(guò)已知對(duì)某臟器有損害的藥物或目前正在使用藥物者；7、有其它影響藥物吸收、分布、代謝和排泄等因素者。
三、試驗(yàn)藥物本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)，由四川省生物工程研究中心提供；美國(guó)安進(jìn)(Amgen)公司生產(chǎn)的干復(fù)津(interferon alfacon-1)。
四、研究方法將受試者分為2組。2組受試者試驗(yàn)當(dāng)天在I期臨床試驗(yàn)病房?jī)?nèi)分別接受本發(fā)明重組干擾素9μg和干復(fù)津9μg皮下注射，并在注射受試藥物前及注射藥物后預(yù)定的采血時(shí)點(diǎn)采血3ml，共采血14次。同時(shí)，醫(yī)師將進(jìn)行48小時(shí)連續(xù)觀察，于用藥前及用藥后第48小時(shí)進(jìn)行多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室檢查、心電圖檢查。
五、研究結(jié)果注射本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與干復(fù)津不同采血時(shí)間比較寡聚核苷酸濃度(2-5A濃度)見(jiàn)附圖11。由附圖11可知，本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與干復(fù)津比較，本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)有兩次血濃度高峰，其曲線下面積大于干復(fù)津的曲線下面積。圖11同時(shí)顯示出本發(fā)明重組干擾素所具有的峰形與干復(fù)津的也不相同。
例十三使用本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)的毒副作用及體溫變化研究現(xiàn)有干擾素類(lèi)藥的副反應(yīng)較多，常見(jiàn)反應(yīng)如惡心、肌肉酸痛、食欲不振、脫發(fā)、白細(xì)胞及血小板減少等。
一、研究方法選取A、B兩組受試者。A組注射9μg本發(fā)明重組干擾素，B組注射9μg干復(fù)津。注射后，臨床觀察48小時(shí)。注射1小時(shí)后進(jìn)行第一次觀察記錄，此后每隔2小時(shí)觀察記錄一次。記錄內(nèi)容主要包括乏力、發(fā)熱、全身疼痛、嗜睡、厭食和受試者體溫等情況。
二、研究結(jié)果注射rSIFN-c0后大多數(shù)不良反應(yīng)的程度為輕微和中等。類(lèi)似流感的癥狀如頭痛、乏力、畏寒、肌痛、多汗、關(guān)節(jié)痛等是副反應(yīng)中最常見(jiàn)的。干復(fù)津不良反應(yīng)及副反應(yīng)高于本發(fā)明重組干擾素。下表列出的是9μg本發(fā)明重組干擾素與9μg干復(fù)津注射后副反應(yīng)對(duì)比記錄。
臨床受試者不良反應(yīng)發(fā)生例數(shù)


三、研究結(jié)論由以上臨床受試者不良反應(yīng)發(fā)生例數(shù)的記錄列表可知，注射干復(fù)津后的副反應(yīng)明顯高于注射本發(fā)明重組干擾素后的副反應(yīng)。
注射本發(fā)明重組干擾素和干復(fù)津后受試者的體溫變化情況見(jiàn)附圖12A-1，12A-2，12B-1，12B-2。
由附圖12A-1、12A-2、12B-1、12B-2，可以觀察到B組受試者的體溫明顯高于A組受試者，證明rSIFN-co比干復(fù)津具有更低的發(fā)熱癥狀及發(fā)熱程度。同時(shí)，本發(fā)明重組干擾素耐受度明顯優(yōu)于干復(fù)津，本發(fā)明重組干擾素有更好的耐受性。
例十四本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)的臨床效果本發(fā)明本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)主要用于病毒性疾病的治療，對(duì)濾泡性口炎病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒、冠狀病毒、EB病毒等都有抑制作用。以WISH細(xì)胞/VSV系統(tǒng)進(jìn)行抗病毒活性檢測(cè)，結(jié)果分別為國(guó)產(chǎn)天然干擾素為0.9×108U/mg，INTRON為2.0×108U/mg，rSIFN-co為9×108U/mg，其抗病毒活性明顯高于前二者。
自2003年2月起，經(jīng)中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)批準(zhǔn)，在四川大學(xué)華西醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院做本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與賽諾金(IFN-α1b)的多中心隨機(jī)對(duì)照研究治療乙型肝炎的臨床試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果如下一、本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)與賽諾金(IFN-α1b)治療慢性活動(dòng)性乙肝的療效比較(一)入選標(biāo)準(zhǔn)使用rSIFN-co(9μg)和賽諾金的入選標(biāo)準(zhǔn)相同，符合1-4條件；使用rSIFN-co(15μg)的入選標(biāo)準(zhǔn)，符合1-5條件。
年齡18～65歲；HBsAg持續(xù)陽(yáng)性至少6個(gè)月以上，HBeAg陽(yáng)性，篩選期內(nèi)至少一次PCR檢測(cè)HBV-DNA≥105拷貝數(shù)/ml；ALT≥2倍正常值上限(ULN)；未曾接受過(guò)干擾素抗HBV治療或3月前接受過(guò)拉米夫定治療但無(wú)效或復(fù)發(fā)者；入選6月前曾采用過(guò)某種干擾素(3MU或5MU)進(jìn)行按SDA規(guī)定療程及劑量抗HBV治療，但無(wú)效或復(fù)發(fā)者。
(二)療效判斷參考2000年第十次全國(guó)病毒性肝炎及肝病學(xué)術(shù)會(huì)議，根據(jù)隨訪結(jié)束時(shí)血清ALT水平是否恢復(fù)正常，HBV-DNA是否轉(zhuǎn)陰，HBeAg是否發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換，將療效分為三級(jí)完全應(yīng)答ALT復(fù)常、HBV-DNA陰轉(zhuǎn)、HBeAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)化部分應(yīng)答ALT復(fù)常、HBV-DNA陰轉(zhuǎn)或HBeAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)化無(wú)應(yīng)答ALT未復(fù)常、HBV-DNA未陰轉(zhuǎn)、HBeAg未陰轉(zhuǎn)其中，完全應(yīng)答和部分應(yīng)答者判斷為顯效病例臨床治療效果比較
rSIFN-co與IFN-α1b(賽諾金)治療慢性活動(dòng)性乙肝的療效比較表

與此試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行的用rSIFN-co治療經(jīng)臨床證實(shí)為慢性活動(dòng)性乙肝且使用過(guò)某種干擾素(3MU或5MU)進(jìn)行按SDA規(guī)定療程及劑量抗HBV治療，但無(wú)效或復(fù)發(fā)的患者13例，每次15μg皮下注射，每48小時(shí)1次，連續(xù)注射24周。治療后截至第十二周，13例中有7例(53.85％)患者臨床顯效，其中0例s抗原轉(zhuǎn)陰(0％)，3例e抗原轉(zhuǎn)陰(23.08％)，3例HBe抗體轉(zhuǎn)為陽(yáng)性(23.08％)，7例HBV-DNA轉(zhuǎn)陰(53.85％)，11例肝功恢復(fù)正常(84.62％)。
(三)rSIFN-co與賽諾金的副反應(yīng)比較干擾素類(lèi)藥的副反應(yīng)較多，包括發(fā)熱、惡心、肌肉酸痛、食欲不振、脫發(fā)、白細(xì)胞及血小板減少，IFN-α1b的臨床最大使用劑量為每次5MIU，常規(guī)每次使用3MIU，采用常規(guī)使用劑量時(shí)，臨床約有90％的患者表現(xiàn)出I-II級(jí)(WHO臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn))的副反應(yīng)，包括38℃以下的輕微發(fā)熱、惡心、肌肉酸痛、食欲不振等。采用最大劑量時(shí)，副反應(yīng)的發(fā)生率無(wú)明顯上升，但各種臨床癥狀程度明顯加重。
rSIFN-co的臨床最大使用劑量為每次24μg，常規(guī)每次使用9μg，采用常規(guī)劑量時(shí)臨床約有不足50％的患者表現(xiàn)出I-II級(jí)(WHO臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn))的副反應(yīng)，包括38℃以下的輕微發(fā)熱、惡心、肌肉酸痛、食欲不振、白細(xì)胞及血小板輕度降低等。使用最大劑量(＞2000萬(wàn)IU)時(shí)約有50％的患者在用藥15天后出現(xiàn)白細(xì)胞及血小板輕度降低，但停藥1周后白細(xì)胞及血小板恢復(fù)正常，可安全地繼續(xù)用藥。
二、本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)治療丙型肝炎的療效觀察
(一)入選標(biāo)準(zhǔn)1.年齡18～65歲；2.HCV抗體持續(xù)陽(yáng)性；3.ALT≥1.5倍正常值上限(ULN)，且持續(xù)6個(gè)月以上。
(二)療效判斷參考干復(fù)津治療丙型肝炎的判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)隨訪結(jié)束時(shí)血清ALT水平是否恢復(fù)正常，HCV-RNA是否轉(zhuǎn)陰，將療效分為三級(jí)完全應(yīng)答ALT復(fù)常、HCV-RNA陰轉(zhuǎn)部分應(yīng)答ALT復(fù)常、HCV-RNA未陰轉(zhuǎn)無(wú)應(yīng)答ALT未復(fù)常、HCV-RNA未陰轉(zhuǎn)其中，完全應(yīng)答和部分應(yīng)答者判斷為顯效病例。
(三)臨床治療效果與治療乙型肝炎試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行的用rSIFN-co治療丙型肝炎患者46例，每次9μg肌肉注射，每48小時(shí)1次，連續(xù)注射24周。治療后26患者有臨床效果(56.52％)，其中12例HCV-RNA轉(zhuǎn)為陰性(26.09％)，26例肝功恢復(fù)正常(56.52％)。
例十五本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)用于腫瘤臨床治療的實(shí)例患者1根據(jù)華西第二醫(yī)院于2004年7月14日出具的腫瘤類(lèi)檢測(cè)報(bào)告單，一名卵巢半乳腺癌患者的血清CA-125＞600U/ml，CA-153＞250U/ml，并檢測(cè)到2000ml的腹水，7月16日，患者腹水中查見(jiàn)惡性腫瘤細(xì)胞及低分化腺癌細(xì)胞，同時(shí)乳腺查見(jiàn)癌細(xì)胞及壞死物。該患者開(kāi)始接受rSFIN-co肌注治療，于7月14日，7月16日，7月18日，7月20日和7月22日分別注射了15μg的rSFIN-co，并于7月22日接受化療。8月3日，患者接受腹腔手術(shù)，根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，預(yù)計(jì)腹腔中會(huì)有超過(guò)2000ml的腹水，但是僅檢測(cè)到200ml的腹水。8月4日，患者進(jìn)行手術(shù)后組織切片檢查為卵巢漿液性囊腺癌，卵巢左右兩側(cè)和淋巴結(jié)癌變，其他器官正常，術(shù)后以rSFIN-co結(jié)合化療進(jìn)行治療，乳腺未進(jìn)行手術(shù)。12月27日出具的腫瘤類(lèi)檢查報(bào)告單顯示血清CA-125降到5U/ml，而CA-153則降低到13U/ml?；颊哂?005年2月25日在第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院PET中心接受PET檢查，報(bào)告單診斷顯示患者全身及腦FDE-PET顯像未見(jiàn)異常FDG代謝增高或減低區(qū)，乳腺病兆消失，完全恢復(fù)到正常水平，未見(jiàn)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。關(guān)于該患者的詳細(xì)診斷報(bào)告結(jié)果，請(qǐng)參見(jiàn)附圖16A到16H。
由該名卵巢半乳腺癌患者使用rSFIN-co治療前后的腫瘤類(lèi)檢測(cè)報(bào)告單數(shù)據(jù)對(duì)比和病理報(bào)告單的診斷結(jié)果對(duì)比，可證明在施以rSFIN-co進(jìn)行治療后癌細(xì)胞未轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。
患者2一名患者被確診為腎癌后半個(gè)月內(nèi)，接受了3次9μg的rSFIN-co注射和3次15μg的rSFIN-co注射。此半個(gè)月后，他每天接受24μg的rSFIN-co注射，共持續(xù)45天。經(jīng)過(guò)該療程的治療后，腎活組織檢查顯示癌細(xì)胞沒(méi)有轉(zhuǎn)移?；颊咴偻ㄟ^(guò)手術(shù)等方式進(jìn)行綜合治療康復(fù)后，每隔半年，接受一個(gè)月的rSFIN-co肌肉注射，共注射15次，每次15μg，至今健在，未見(jiàn)復(fù)發(fā)。
例十六一、新型基因本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)體外抗SARS病毒試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料1、藥品新型基因本發(fā)明重組干擾素，每支9μg。四川輝陽(yáng)生命工程股份有限公司提供，批號(hào)20020501；2、細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero E6)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所分子生物學(xué)研究室提供；3、病毒SARS病毒，BJ-01株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室提供；4、細(xì)胞培養(yǎng)液含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。
二、實(shí)驗(yàn)的基本條件病毒測(cè)定在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。
三、實(shí)驗(yàn)方法1、CPE法測(cè)定病毒對(duì)Vero-E6細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TCID50)Vero E6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層，加入10倍稀釋9個(gè)濃度的病毒培養(yǎng)液，每濃度4孔，37℃，5％CO2溫箱培養(yǎng)。每天用顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)。細(xì)胞病變?cè)?5％以下為+，26-50％病變?yōu)?+，51-75％病變?yōu)?++，76-100％病變?yōu)?+++。記錄細(xì)胞病變程度(CPE)。用Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量(TCID50)。
2、藥物對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定Vero E6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。藥物設(shè)5個(gè)濃度即36、18、9、4.5、2.259μg/ml(終濃度)，每濃度4孔。設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照。每天觀察給藥組細(xì)胞病變，觀察到5天，確定藥物的無(wú)毒濃度。
3、CPE法測(cè)定藥物抗病毒活性Vero E6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。將最大無(wú)毒濃度以下的藥物對(duì)倍稀釋5個(gè)濃度，分別加入細(xì)胞板中，每孔100μl，37℃，5％CO2溫箱培養(yǎng)24h后，再分別加入不同稀釋度的病毒(10-3、10-4、10-5)，共同培養(yǎng)48-72h，觀察細(xì)胞病變CPE(細(xì)胞病變?cè)?5％以下為+，26-50％為++，51-75％為+++，76-100％為++++，正常細(xì)胞為-)，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、藥物對(duì)照和不同稀釋度(10-3、10-4、10-5)的病毒對(duì)照，每天觀察，待病毒對(duì)照出現(xiàn)細(xì)胞明顯病變時(shí)，判定干擾素抗病毒的效應(yīng)。試驗(yàn)重復(fù)1次。用Reed-Muench法計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度IC50。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、病毒毒力測(cè)定病毒的TCID50是10-8。
2、藥物對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定本發(fā)明重組干擾素對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度為18g/ml，在此濃度下細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照相同，沒(méi)有出現(xiàn)病變。
3、藥物的抗病毒作用試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。
表1、本發(fā)明重組干擾素對(duì)SARS病毒的作用(實(shí)驗(yàn)一)


表2、本發(fā)明重組干擾素對(duì)SARS病毒的作用(實(shí)驗(yàn)二)

五、結(jié)論本發(fā)明重組干擾素對(duì)細(xì)胞的無(wú)毒濃度為18g/ml。當(dāng)病毒濃度為10-5(1000TCID50)、10-4(10000TCID50)和10-3(100000TCID50)時(shí)，干擾素的IC50分別為1.27、2.25和4.04μg/ml(表3)。
表3、干擾素對(duì)不同濃度病毒的半數(shù)有效濃度

二、本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)和注射用干擾素α-2b體外抗SARS病毒試驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)材料藥品本發(fā)明重組干擾素，四川輝陽(yáng)生命工程股份有限公司提供，618μg/ml；安福隆(注射用重組干擾素α-2b)，天津華立達(dá)生物工程有限公司產(chǎn)品，30μg/支(300萬(wàn)單位IU/支)，批號(hào)20030105。
細(xì)胞非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero E6)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所分子生物學(xué)研究室提供；病毒SARS病毒，BJ01株，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病毒室提供；實(shí)驗(yàn)的基本條件病毒測(cè)定在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。
2.實(shí)驗(yàn)方法2.1.CPE法測(cè)定病毒對(duì)Vero E6細(xì)胞半數(shù)感染濃度(TCID50)Vero E6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層，加入10倍稀釋9個(gè)濃度的病毒培養(yǎng)液，每濃度4孔，設(shè)細(xì)胞對(duì)照，37℃，5％CO2溫箱培養(yǎng)。每天用顯微鏡觀察細(xì)胞病變(CPE)。細(xì)胞病變?cè)?5％以下為+，26-50％病變?yōu)?+，51-75％病變?yōu)?++，76-100％病變?yōu)?+++。記錄細(xì)胞病變程度。用Reed-Muench法計(jì)算病毒半數(shù)感染劑量(TCID50)。
2.2.MTT法測(cè)定干擾素對(duì)細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)Vero E6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。吸去上清，分別加入不同稀釋濃度的兩種干擾素，每濃度4孔，設(shè)細(xì)胞對(duì)照。觀察5天后加MTT染色4h，吸去液體加DMSO溶解0.5h，酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定OD570nm吸收值，用Reed-Muench法計(jì)算TC50。
2.3.MTT法測(cè)定干擾素的抗病毒活性Vero E6細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μl，含細(xì)胞2×104個(gè)/孔，37℃培養(yǎng)24h，細(xì)胞長(zhǎng)成單層。藥物從最大無(wú)毒濃度向下5倍稀釋共5個(gè)濃度，每濃度4孔，加入細(xì)胞板中，每孔100μl，37℃，5％CO2溫箱培養(yǎng)24h后，吸去干擾素液，加入不同稀釋度的病毒(10000、1000、100TCID50)，每個(gè)稀釋度加4個(gè)孔，并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、藥物對(duì)照和不同稀釋度(10000、1000、100TCID50)的病毒對(duì)照，37℃，5％CO2培養(yǎng)48～72h，待病毒對(duì)照出現(xiàn)細(xì)胞明顯病變時(shí)，記錄細(xì)胞病變結(jié)果(細(xì)胞病變?cè)?5％以下為+，26～50％為++，51～75％為+++，76～100％為++++，正常細(xì)胞為-)，MTT染色法測(cè)定細(xì)胞活性，判定干擾素抗病毒的效應(yīng)。試驗(yàn)重復(fù)3次，用Reed-Muench法計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度IC50。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.病毒TCID50測(cè)定SARS病毒Vero E6細(xì)胞的TCID50為10-7。
3.2.干擾素對(duì)Vero E6細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TC50)的測(cè)定本發(fā)明重組干擾素的無(wú)毒濃度為100μg/ml，注射用重組干擾素α-2b的無(wú)毒濃度為12.5μg/ml，在此濃度下細(xì)胞形態(tài)與正常對(duì)照相同；本發(fā)明重組干擾素的TC50為139.18μg/ml，注射用重組干擾素α-2b的TC50為17.18μg/ml，結(jié)果見(jiàn)表1。
表1、干擾素對(duì)Vero E6細(xì)胞半數(shù)毒性濃度(TC50)測(cè)定結(jié)果

3.3.干擾素的抗病毒活性測(cè)定兩種干擾素在體外均有保護(hù)細(xì)胞抗SARS病毒活性，三次實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，治療指數(shù)(TI)結(jié)果見(jiàn)表3。
表2、干擾素抗SARS病毒活性測(cè)定結(jié)果

表3、干擾素抗SARS病毒活性測(cè)定結(jié)果


4.結(jié)論體外實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明重組干擾素和注射用重組干擾素α-2b均對(duì)Vero E6細(xì)胞有保護(hù)作用，具有抗SARS病毒活性。三次實(shí)驗(yàn)測(cè)定本發(fā)明重組干擾素對(duì)10000、1000和100 TCID50 SARS病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為0.92、0.18和0.10μg/ml，治療指數(shù)為151.28、773.32和1391.80；注射用重組干擾素α-2b對(duì)10000、1000和100TCID50SARS病毒的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為4.75、1.16和0.28μg/ml，治療指數(shù)為3.62、14.78和61.36。
重要的是，以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)以上例11A及11B)皆證明雖然rSIFN-co的抗SARS使用劑量是臨床上使用的干擾素α-2b的1/5，其治療指數(shù)(TI)卻是干擾素α-2b的50倍。(見(jiàn)本發(fā)明重組干擾素和注射用干擾素α-2b體外抗SARS病毒試驗(yàn)—軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)已有3萬(wàn)支rSIFN-co噴霧劑用于四川省的一線護(hù)士、醫(yī)生及高危人群，結(jié)果四川省無(wú)—名護(hù)士及醫(yī)生感染SARS。
例十七本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)流感病毒抑制作用試驗(yàn)用細(xì)胞病變抑制法檢測(cè)本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)流感病毒的抑制。
一、實(shí)驗(yàn)材料10日齡雞胚尿囊膜細(xì)胞 自備本發(fā)明重組干擾素 四川省生物工程研究中心流感病毒DMEM GIBCO新生小牛血清 蘭州明海生命96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 NUNC
CO2孵箱潔凈工作臺(tái)倒置照相生物顯微鏡二、實(shí)驗(yàn)方法于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的10日齡雞胚尿囊膜細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，苔盼蘭染色計(jì)數(shù)，用DMEM調(diào)細(xì)胞濃度為2.5×105個(gè)/ml備用。
于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入上述細(xì)胞懸液100μl/孔，置37℃、5％CO2培養(yǎng)，次日即生長(zhǎng)為單層。
棄上清，每孔加入經(jīng)預(yù)先稀釋的不同濃度重組高效復(fù)方干擾素100μl/孔，同時(shí)設(shè)無(wú)干擾素對(duì)照及細(xì)胞對(duì)照。置37℃、5％CO2培養(yǎng)約18～20Hr。
實(shí)驗(yàn)孔及無(wú)干擾素對(duì)照孔，每孔均加入經(jīng)預(yù)先稀釋的不同濃度流感病毒液100μl/孔，細(xì)胞對(duì)照孔不加病毒液DMEM 100μl/孔，僅加入置37℃、5％CO2培養(yǎng)約24Hr。
培養(yǎng)24Hr后倒置照相生物顯微鏡觀察照相。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，無(wú)干擾素對(duì)照組孔細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變特征，如園縮、折光性下降、伴脫落現(xiàn)象等；而實(shí)驗(yàn)孔細(xì)胞在重組高效復(fù)方干擾素濃度≥1ong/ml時(shí)，則無(wú)細(xì)胞病變特征；細(xì)胞對(duì)照孔細(xì)胞無(wú)病變特征。見(jiàn)附圖13。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)能抑制流感病毒對(duì)雞胚尿囊膜細(xì)胞感染。rSIFN-co對(duì)流感病毒具有極好的抑制作用。
例十八本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)埃博拉病毒(Ebola)抑制作用試驗(yàn)埃博拉病毒扎伊爾病毒可以引起嚴(yán)重的出血熱，并有著很高的死亡率，目前尚沒(méi)有有效的治療手段。
一、實(shí)驗(yàn)材料1、試驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，60只。
2、試驗(yàn)藥品本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)，由四川省生物工程研究中心提供。
二、實(shí)驗(yàn)方法將60只BALB/c小鼠隨機(jī)分組，每組10只，共6組，分別為病毒感染后當(dāng)天、第1、第2、第3、第4天開(kāi)始給藥本發(fā)明重組干擾素組和對(duì)照組，依次給以上小組編號(hào)為組1，組2，組3，組4，組5，組6。分別給每只小鼠注射埃博拉病毒。在注射埃博拉病毒當(dāng)天及注射病毒后第1、第2、第3、第4天開(kāi)始分別給組1，組2，組3，組4，組5給藥rSIFN-co，給藥方式，皮下注射，劑量，1μg，連續(xù)給藥6天。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，所有對(duì)照組小鼠死于埃博拉病毒感染，而所有于注射病毒后當(dāng)天和第1、第2天給藥rSIFN-co的小鼠都存活，沒(méi)有觀察到毒性反應(yīng)。在注射病毒后第3、第4天才開(kāi)始給藥rSIFN-co的，則藥物起不到完全保護(hù)作用。
例十九本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)艾滋病病毒抑制作用試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料wild-type HIV(野生性HIV病毒)Drug Resistant HIV(變異耐藥性HIV病毒)293-CD4-CCR5細(xì)胞DMEM GIBCO胎牛血清 GIBCO本發(fā)明重組干擾素 四川省生物工程研究中心96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 NUNCCO2孵箱潔凈工作臺(tái)熒光分光光度計(jì)紫外分光光度計(jì)二、實(shí)驗(yàn)方法取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293-CD4-CCR5細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，苔盼蘭染色計(jì)數(shù)，用DMEM調(diào)細(xì)胞濃度為2.0×105個(gè)/ml備用。
于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入上述細(xì)胞懸液100μl/孔，置37℃、5％CO2培養(yǎng)，次日生長(zhǎng)達(dá)孔底面積的70％左右。
棄上清，每孔加入經(jīng)預(yù)先稀釋的不同濃度重組高效復(fù)方干擾素100μl/孔，同時(shí)設(shè)無(wú)干擾素對(duì)照(PBS對(duì)照)。及細(xì)胞對(duì)照(營(yíng)養(yǎng)液對(duì)照)。置37℃、5％CO2培養(yǎng)約18～20Hr。
實(shí)驗(yàn)孔及無(wú)干擾素對(duì)照孔，分別加入經(jīng)預(yù)先稀釋的不同濃度的型野生型HIV及耐藥性HIV病毒液100μl/孔，細(xì)胞對(duì)照孔不加病毒液僅加入DMEM 100μl/孔，置37℃、5％CO2培養(yǎng)約24Hr。
按常規(guī)檢測(cè)相關(guān)蟲(chóng)熒光蛋白酶活性。同時(shí)測(cè)定細(xì)胞破碎上清的蛋白濃度，熒光素酶活性用RLU/mg表示。
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果以所檢測(cè)的熒光素酶活性為縱坐標(biāo)，本發(fā)明重組干擾素濃度為橫坐標(biāo)，用EXCEL軟件作柱形圖分析處理。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明重組干擾素濃度≥4ng/ml時(shí)實(shí)驗(yàn)組熒光素酶活性明顯低于PBS和營(yíng)養(yǎng)液對(duì)照組，且呈劑量依賴(lài)關(guān)系。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖14-A、14-B。
本發(fā)明重組干擾素抗艾滋病病毒活性測(cè)定結(jié)果

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)論本發(fā)明重組干擾素(rSIFN-co)對(duì)野生性HIV病毒和變異耐藥性HIV病毒具有極好的抑制作用。
序列表<110>輝陽(yáng)科技美國(guó)公司四川省生物工程研究中心<120>一種干擾素及其應(yīng)用<130>FI-0500 -59<160>11<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>504<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>編碼一種已知共有干擾素(干復(fù)津)的氨基酸序列的核苷酸序列<400>1atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct60cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg120caggaagaat tcgacggtaa ccagttccag aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa180atgatccagc agaccttcaa cctgttctcc accaaagact cctccgctgc ttgggacgaa240tccctgctgg aaaaattcta caccgaactg taccagcagc tgaacgacct ggaagcttgc300gttatccagg aagttggtgt tgaagaaacc ccgctgatga acgttgactc catcctggct360gttaaaaaat acttccagcg tatcaccctg tacctgaccg aaaaaaaata ctccccgtgc420gcttgggaag ttgttcgtgc tgaaatcatg cgttccttct ccctgtccac caacctgcag480gaacgtctgc gtcgtaaaga ataa 504<210>2<211>167<212>PRT<213>Artificial<220>
<223>一種共有干擾素(干復(fù)津)的氨基酸序列<400>2Met Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu1 5 10 15Ile Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys20 25 30
Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln35 40 45Phe Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln50 55 60Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu65 70 75 80Ser Leu Leu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp85 90 95Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu100 105 110Met Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile115 120 125Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val130 135 140Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn Leu Gln145 150 155 160Glu Arg Leu Arg Arg Lys Glu165<210>3<211>507<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>一種編碼rSIFN-co的核苷酸序列<400>3atgtgtgatt tacctcaaac tcattctctt ggtaaccgtc gcgctctgat tctgctggca60cagatgcgtc gtatttcccc gtttagctgc ctgaaagacc gtcacgactt cggctttccg120caagaagagt tcgatggcaa ccaattccag aaagctcagg caatctctgt actgcacgaa180atgatccaac agaccttcaa cctgttttcc actaaagaca gctctgctgc ttgggacgaa240agcttgctgg agaagttcta cactgaactg tatcagcagc tgaacgacct ggaagcatgc300gtaatccagg aagttggtgt agaagagact ccgctgatga acgtcgactc tattctggca360gttaaaaagt acttccagcg tatcactctg tacctgaccg aaaagaaata ttctccgtgc420gcttgggaag tagttcgcgc tgaaattatg cgttctttct ctctgtctac taacctgcag480gagcgtctgc gccgtaaaga ataatag507
<210>4<211>108<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于PCR合成rSIFN-co的5’-端280bp片段的正向引物<400>4atgtgcgacc tgccgcagac ccactccctg ggtaaccgtc gtgctctgat cctgctggct60cagatgcgtc gtatctcccc gttctcctgc ctgaaagacc gtcacgac 108<210>5<211>108<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于合成rSIFN-co cDNA 5’-端280bp片段的模板<400>5ctgaaagacc gtcacgactt cggtttcccg caggagaggt tcgacggtaa ccagttccag60aaagctcagg ctatctccgt tctgcacgaa atgatccagc agaccttc 108<210>6<211>103<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于PCR合成rSIFN-co的5’-端280bp片段的反向引物<400>6gctgctggta cagttcggtg tagaattttt ccagcaggga ttcgtcccaa gcagcggagg60agtctttggt ggagaacagg ttgaaggtct gctggatcat ttc 103<210>7<211>103<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于PCR合成rSIFN-co的3’-端268bp片段的正向引物<400>7atccctgctg gaaaaattct acaccgaact gtaccagcag ctgaacgacc tggaagcttg60cgttatccag gaagttggtg ttgaagaaac cccgctgatg aac 103<210>8<211>106<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于PCR合成rSIFN-co的3’-端268bp片段的反向引物<400>8gaagaaaccc cgctgatgaa cgttgactcc atcctggctg ttaaaaaata cttccagcgt60atcaccctgt acctgaccga aaaaaaatac tccccgtgcg cttggg 106<210>9<211>112<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于PCR合成rSIFN-co的3’-端268bp片段的模板<400>9ttattcttta cgacgcagac gttcctgcag gttggtggac agggagaagg aacgcatgat60ttcagcacga acaacttccc aagcgcacgg ggagtatttt ttttcggtca gg112<210>10<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于將rSIFN-co 5’-段280bp片段和rSIFN-co 3’-段268bp片段連接起來(lái)的引物
<400>10atcggccata tgtgcgacct gccgcagacc c 31<210>11<211>40<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>用于將rSIFN-co 5’-段280bp片段和rSIFN-co 3’-段268bp片段連接起來(lái)的引物<400>11actgccaggc tgcagttatt ctttacgacg cagacgttcc40。
權(quán)利要求
1.一種干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素具有序列表中序列2所示的氨基酸序列，并且其具有與干復(fù)津不同的空間構(gòu)象，所述干復(fù)津同樣具有序列表中序列2所示的氨基酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素在190-250nm范圍內(nèi)的圓二色譜顯著不同于在同樣條件下測(cè)得的干復(fù)津的圓二色譜。
3.權(quán)利要求2所述的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素在肌肉注射給體重指數(shù)為20-27范圍內(nèi)的人體后，以采血時(shí)間對(duì)受試人體血清中的2-5A寡聚核苷酸酶濃度作圖，所得曲線下的峰面積顯著大于在同一條件下注射干復(fù)津所獲得的曲線下的峰面積。
4.權(quán)利要求3所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素在注射給人體后其在人體內(nèi)的半衰期比干復(fù)津在人體內(nèi)的半衰期長(zhǎng)。
5.權(quán)利要求4所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素的曲線為雙峰曲線。
6.權(quán)利要求4所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素的曲線的峰為近似梯形峰。
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素具有比干復(fù)津及其它干擾素更強(qiáng)的效力。
8.權(quán)利要求7所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述的效力是針對(duì)病毒而言的。
9.權(quán)利要求8所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述的病毒包括乙肝病毒、丙肝病毒、野生型HIV或其耐藥株、天花病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、EB病毒、細(xì)胞黑色素病毒、單純性皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、其它皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、乳頭瘤病毒、痘病毒、細(xì)小核糖核酸病毒、鼻病毒、腺病毒、RNA病毒、I型人T細(xì)胞白血病病毒、II型人T細(xì)胞白血病病毒或III型人T細(xì)胞白血病病毒、西尼羅病毒、黃熱病毒、輪狀病毒、禽流感病毒及其感染人的變異株、流感病毒、副流感病毒、麻疹病毒、人合胞體病毒-1、人合胞體病毒-2、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、登革熱、黃熱病、布塔托羅病毒。
10.權(quán)利要求9所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述的病毒包括乙肝病毒、丙肝病毒、野生型HIV或其耐藥株、天花病毒、SARS病毒、埃博拉病毒、單純性皰疹病毒、水痘帶狀皰疹病毒、流感病毒、禽流感病毒及其感染人的變異株。
11.權(quán)利要求10所述的干擾素或其功能等同物，其中所述的病毒是乙型肝炎病毒。
12.權(quán)利要求11所述的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素的體外藥效學(xué)顯示其不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制而且還能抑制乙肝病毒表面抗原和e抗原的分泌。
13.權(quán)利要求12所述的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素抑制乙肝病毒核心抗原DNA復(fù)制的效力與干復(fù)津相比提高約一倍。
14.權(quán)利要求7所述的干擾素或其功能等同物，其中所述的效力是針對(duì)腫瘤而言的。
15.權(quán)利要求14所述的干擾素或其功能等同物，其中所述的腫瘤包括皮膚癌、基底細(xì)胞癌及惡性黑素瘤、腎細(xì)胞癌、肝癌、甲狀腺癌、鼻咽癌、固狀腫瘤、前列腺癌、胃癌、食道癌、直腸癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌、淺表膀胱癌、血管瘤、表皮樣癌、子宮頸癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、血癌、急性血癌、慢性血癌、毛細(xì)胞白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴腺瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卡波基肉瘤、紅血球過(guò)多病。
16.權(quán)利要求15所述的干擾素或其功能等同物，其中所述的腫瘤包括惡性黑素瘤、腎細(xì)胞癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、慢性骨髓性白血病、毛細(xì)胞白血病。
17.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所說(shuō)的干擾素或其功能等同物，其中所述干擾素與干復(fù)津及其它干擾素相比具有更低的副作用。
18.一種DNA序列，其是根據(jù)大腸桿菌(E.Coli)密碼子偏愛(ài)性對(duì)野生型序列進(jìn)行調(diào)整并人工合成cDNA而得的，該DNA編碼序列表中序列2所示氨基酸序列的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求18所述的DNA序列，其中所述的核苷酸序列被置于PBAD啟動(dòng)子的控制之下。
20.權(quán)利要求19所述的DNA序列，其中所述的核苷酸序列是序列表中序列3所示的核苷酸序列。
21.一種載體，其含有權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的DNA序列。
22.權(quán)利要求21所述的載體，其為表達(dá)載體。
23.權(quán)利要求22所述的載體，該載體的表達(dá)誘導(dǎo)劑為阿拉伯糖。
23.一種含有權(quán)利要求21-22任一項(xiàng)所說(shuō)載體的宿主細(xì)胞。
24.一種藥物組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所說(shuō)干擾素或其功能等同物。
25.權(quán)利要求24所說(shuō)的藥物組合物，其凍干劑型。
26.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其是注射液。
27.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其是噴霧劑。
28.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其是緩釋劑。
29.權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其是長(zhǎng)效制劑。
30.一種治療疾病的方法，其特征在于給需要治療的患者施用有效量的權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所說(shuō)的干擾素或其功能等同物。
31.權(quán)利要求30所說(shuō)的方法，其中所述干擾素或其功能等同物是通過(guò)噴霧設(shè)備給予的。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的噴霧設(shè)備是用于鼻腔給藥的噴霧器。
33.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的噴霧設(shè)備是呼吸機(jī)。
34.權(quán)利要求30所說(shuō)的方法，其中所述干擾素或其功能等同物是通過(guò)注射施予的。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的注射是靜脈注射、肌肉內(nèi)注射或皮下注射。
36.權(quán)利要求35所說(shuō)的方法，其中所述干擾素或其功能等同物的給藥劑量為每次注射9μg-30μg。
37.權(quán)利要求36所說(shuō)的方法，其中所述干擾素或其功能等同物的給藥劑量為每次注射15μg。
38.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的干擾素或其功能等同物是通過(guò)粘膜給予的。
39.權(quán)利要求30-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的干擾素或其功能等同物與其它抗腫瘤藥物或抗病毒藥物聯(lián)合使用。
40.權(quán)利要求30-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述干擾素與其它各種治療疾病的藥物或方法聯(lián)合使用。
41.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述干擾素或其功能等同物的方法，包括下列步驟(a)將編碼序列表中序列2所示氨基酸序列的核苷酸序列引入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中并使所述的核苷酸序列置于適當(dāng)啟動(dòng)子的控制之下；(b)將步驟(a)構(gòu)建的載體引入宿主，并在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)條件下進(jìn)行表達(dá)，得到包涵體；(c)收集并純化步驟(b)得到的包涵體；(d)對(duì)步驟(c)獲得的包涵體進(jìn)行變性和復(fù)性；以及(e)對(duì)復(fù)性后的產(chǎn)物依次進(jìn)行透析和離子層析。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的核苷酸序列是根據(jù)大腸桿菌密碼子偏愛(ài)性對(duì)野生型序列進(jìn)行調(diào)整并人工合成cDNA而得的。
43.權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的核苷酸序列是序列表中序列3所示的核苷酸序列。
44.權(quán)利要求41-43所述的方法，其中所述的載體是pHY-5。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的宿主是大腸桿菌。
46.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述的離子層析步驟依次包括HS陽(yáng)離子層析和銅離子層析。
47.權(quán)利要求46所述的方法，其中還進(jìn)一步包括凍干已純化的干擾素的步驟。
48.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的干擾素或其功能等同物在制備用于預(yù)防及治療病毒性疾病和治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
49.權(quán)利要求1-17任一項(xiàng)所述的干擾素或其功能等同物，其安全使用劑量大于每劑1000萬(wàn)國(guó)際單位。
50.一種高效力或低副作用的干擾素，其是通過(guò)改變?cè)摳蓴_素的空間構(gòu)象而得到的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有全新空間構(gòu)象且功效增強(qiáng)、副作用更低可大劑量使用的重組干擾素(rSIFN－co)或其功能等同物。其特征是其體外藥效學(xué)顯示它不僅能抑制乙型肝炎病毒的DNA復(fù)制，而且能抑制表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，其細(xì)胞學(xué)毒性僅為臨床現(xiàn)用干擾素的1/8但抗病毒活性卻是臨床現(xiàn)用干擾素的5－20倍，同時(shí)在人體內(nèi)具有更高更廣譜更長(zhǎng)時(shí)間的生物學(xué)應(yīng)答反應(yīng)，可明顯抑制腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移。本發(fā)明還提供了此種重組干擾素或其功能等同物的人工基因編碼、基因的載體、人工基因編碼的表達(dá)系統(tǒng)。最后，本發(fā)明還提供了本發(fā)明重組干擾素或其功能等同物的生產(chǎn)方法及所述干擾素的各種應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1740197SQ20051005110
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2005年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月26日
發(fā)明者魏光文 申請(qǐng)人:輝陽(yáng)科技美國(guó)公司, 四川省生物工程研究中心