專利名稱:鏈球菌C5a肽酶疫苗的制作方法
本申請是申請日為1999年12月3日提交的發(fā)明名稱為“鏈球菌C5a肽酶疫苗”,申請?zhí)枮?9814192.5的分案申請。
本發(fā)明是1996年1月22日遞交的美國專利申請?zhí)枮?8/589,756的部分繼續(xù)申請(continuation-in-part)。同時參閱USSN 08/589,756并將部分內(nèi)容加入本發(fā)明。
背景技術(shù):
有數(shù)種不同的β-溶血性鏈球菌屬已經(jīng)被鑒定。釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene),也稱為A群鏈球菌,是人體一種常見的細(xì)菌性病原體。它基本上是一種兒童疾病,在人體中引發(fā)許多感染性疾病,包括咽炎、膿皰病和敗血癥。感染之后,在人體中可能發(fā)生自身免疫性并發(fā)癥,例如風(fēng)濕病和急性腎小球性腎炎。該病原體還能引起嚴(yán)重的急性疾病例如猩紅熱,壞死性筋膜炎以及中毒性休克。
由A群鏈球菌引起的咽喉痛,通常稱為鏈球菌咽炎(strep throat),一般在醫(yī)療實踐中至少占全部門診的16%,這取決于季節(jié)因素。參閱Hope-Simpson,E.,“小人群中的一項研究,咽喉中的釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene),1962-1975”,劍橋衛(wèi)生學(xué)雜志(J.Hyg.Camb.),87109-129(1981)。此屬鏈球菌還是壞死性筋膜炎相關(guān)性中毒性休克最近在北美洲和其它四大洲重現(xiàn)的原因。參閱Stevens,D.L.,“侵入性A群鏈球菌感染”,臨床傳染病學(xué)(Clin.Infect.Dis.),142-13(1992)。同時也暗示C群和G群鏈球菌還引起鏈球菌咽炎(strep throat)并偶爾引起中毒性休克。Hope-Simpson,E.,“小人群中的一項研究,咽喉中的釀膿鏈球菌,1962-1975”,劍橋衛(wèi)生學(xué)雜志(J.Hyg.Camb.),87109-129(1981)。
B群鏈球菌,又稱為無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae),引起新生兒敗血癥和腦膜炎。參閱T.R.Martin等,“類型特異性多糖包膜對于B群鏈球菌從幼兒期及成年期大鼠的肺中清除的效應(yīng)”,傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.),165306-314(1992)。通常成年雌性陰道粘膜菌群的成員在分娩期間感染以后,有0.1-0.5/1000的新生兒發(fā)展成嚴(yán)重的疾病。盡管B群鏈球菌感染有高死亡率,但對致病機制卻懂得很少。參閱Martin,T.R.,等,“類型特異性多糖包膜對于B群鏈球菌從幼兒期及成年期大鼠肺中被清除的效應(yīng)”,傳染病學(xué)雜志(J.Infect.Dis.),165306-314(1992)。
鏈球菌感染目前用抗體療法治療。然而,25-30%的接受治療者有復(fù)發(fā)可能和/或在粘膜分泌液中流出此生物體,到目前為止還沒有方法可以預(yù)防鏈球菌感染。歷史上,鏈球菌疫苗開發(fā)的熱點是細(xì)菌細(xì)胞表面M蛋白。參閱Bessen,D.,等“用對應(yīng)于M蛋白保守性表位的合成肽進行鼻內(nèi)免疫對A群鏈球菌在粘膜的集群的影響”,感染與免疫(Infect.Immun.),562666-2672(1988)和Bronze,M.S.,等,“小鼠局部給藥A群鏈球菌疫苗引起的保護性免疫”,免疫學(xué)雜志(Journal of Immunology),1412767-2770(1988)。
兩個主要的問題將會限制M蛋白疫苗的使用、銷售,也可能限制美國食品與藥品監(jiān)督局的批準(zhǔn)。首先,釀膿鏈球菌存在超過80種不同的M血清型,并不斷出現(xiàn)新的血清型。參閱Fischetti,V.A.,等,“鏈球菌M蛋白分子設(shè)計和生物行為”,臨床微生物學(xué)評論(Clin.Microbiol.Rev.),2285-314(1989)。因此,用一種血清型特異性M蛋白接種將不能有效地防御其它的血清型。第二個問題涉及M蛋白疫苗的安全性。M蛋白有20多個區(qū)域含有與人體組織特別是心臟組織具有免疫交叉反應(yīng)性的抗原表位。M蛋白的N-末端在序列和抗原特異性方面高度可變。為了獲得廣泛的抗A群鏈球菌感染的保護作用,在疫苗中必須包括代表該可變序列的超過80種不同的肽。新的M蛋白突變體將繼續(xù)產(chǎn)生,這就必須進行鏈球菌性疾病的監(jiān)測并改變疫苗組成。相反地,M蛋白的羧基端在序列上是保守的。然而,M蛋白的這個區(qū)域含有與人心臟組織具有免疫交叉反應(yīng)性的氨基酸序列。M蛋白的這個性質(zhì)被認(rèn)為能解釋風(fēng)濕熱相關(guān)性心臟瓣膜損傷。參閱P.Fenderson等,“原肌球蛋白與A群鏈球菌M蛋白共有的免疫表位”,免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)1422475-248(1989)。在早期的一項試驗當(dāng)中,1979年接種過M蛋白的兒童,其風(fēng)濕熱及相關(guān)的心臟瓣膜損傷的發(fā)病率升高了10倍。參閱Massell,B.F.,等,“鏈球菌免疫接種后的風(fēng)濕熱”,美國醫(yī)學(xué)會雜志(JAMA),2071115-1119(1969)。
被考慮用于開發(fā)疫苗的其它蛋白是紅斑毒素、釀膿鏈球菌外毒素A和釀膿鏈球菌外毒素B。參閱Lee,P.K.,等,“A群釀膿鏈球菌外毒素在中毒性休克綜合癥樣疾病動物模型中的定量及毒性”,臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microb.),271890-1892(1989)。針對這些蛋白質(zhì)的免疫力能夠預(yù)防致死性的中毒性休克癥狀,但也許不能預(yù)防鏈球菌在宿主體內(nèi)集群。
因此,仍然不斷需要一種預(yù)防或改善鏈球菌感染的有效手段。更明確地,存在開發(fā)對于預(yù)防或改善鏈球菌在宿主組織內(nèi)集群從而降低strepthroat及膿包病發(fā)病率的疫苗有用的組合物的需要。后遺癥例如風(fēng)濕熱、急性腎小球性腎炎、膿血癥、中毒性休克和壞死性筋膜炎的消除,將是減少此生物體急性感染和攜帶的一個直接結(jié)果;還存在開發(fā)對于預(yù)防或改善由各種β-溶血性鏈球菌即A、B、C和G群所引起的感染的疫苗有用的組合物的需要。
本發(fā)明概述本發(fā)明提供免疫易感哺乳動物抗β-溶血性鏈球菌有效的一種疫苗和數(shù)種免疫方法。易感哺乳動物可能是人或家蓄,例如狗、奶牛、豬或馬。這種免疫能夠預(yù)防、改善或減輕β-溶血性鏈球菌在哺乳動物體內(nèi)集群的發(fā)病率。此疫苗含有一個具有免疫性的量的鏈球菌C5a肽酶(SCP),其中SCP是一種與生理上可以接受的、無毒性的賦形劑組合的、野生型SCP的突變體。
SCP的“突變體”是一條與天然SCP不完全相同的多肽或寡肽SCP。這樣一種SCP突變體可以通過插入、缺失或取代一個或多個氨基酸從而改變氨基酸序列而獲得。此蛋白的氨基酸序列經(jīng)過修飾,例如取代,產(chǎn)生一條多肽,其性質(zhì)與天然多肽比較基本相同或得到改善。這種取代可能是一種保守取代?!氨J厝〈笔侵赣昧硪环N具有相似的側(cè)鏈的氨基酸取代一種氨基酸。保守取代是利用氨基酸在電荷或側(cè)鏈的大小這些方面(選擇地,在側(cè)鏈內(nèi)化學(xué)基團的大小、電荷或種類這些方面)變化最小的氨基酸所進行的,從而使整個肽保留其空間構(gòu)象而其生物活性被改變的取代。例如,常見的保守取代可能是Asp取代Glu、Asn或Gln;His取代Lys、Arg或Phe;Asn取代Gln、Asp或Glu和Ser取代Cys、Thr或Gly。常用丙氨酸來取代其它氨基酸。20種必需氨基酸可以做如下分類具有非極性側(cè)鏈的氨基酸,如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸,如甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;帶有酸性側(cè)鏈的天冬氨酸和谷氨酸;帶有堿性側(cè)鏈的賴氨酸、精氨酸和組氨酸。參閱L.Stryer,生物化學(xué),第2版(Biochemistry,2nd ed.)14-15頁;Lehninger,生物化學(xué)(Biochemistry),73-75頁。
氨基酸的改變是通過改變對應(yīng)的核酸序列的密碼子來實現(xiàn)的。已知為了修飾或改進抗原性或免疫原性,在利用特定氨基酸取代多肽結(jié)構(gòu)中其它的氨基酸的基礎(chǔ)上,可以獲得這樣的肽。例如,通過選擇氨基酸的取代,可以給予多肽一個小的構(gòu)象變化,這引起活性增加或免疫應(yīng)答增強。選擇地,特定多肽的氨基酸取代可被用來提供隨后又被連接到其它分子上從而提供保留了對其它目的有用的足夠的啟始肽抗原性質(zhì)的肽-分子接合物的殘基。
人們在賦予多肽30種相互作用的生物功能時可利用氨基酸的水療指數(shù),其中,發(fā)現(xiàn)特定的氨基酸可被取代為其它具有相似水療指數(shù)的氨基酸并仍然保留相似的生物活性。選擇地,相似氨基酸的取代可在親水性基礎(chǔ)上進行,特別在計劃將所要產(chǎn)生的多肽的預(yù)期的生物功能用于免疫實施方案的地方?!暗鞍住钡淖畲缶植科骄H水性受其鄰近氨基酸的親水性的支配,與其免疫原性相關(guān)。參閱美國專利4,554,101號。因此,可以注意到取代可在分配給各氨基酸親水性的基礎(chǔ)上進行。
無論是使用親水性指數(shù)還是使用水療指數(shù),它們都是給每一個氨基酸分配一個數(shù)值,都優(yōu)選在這些數(shù)值為±2時進行氨基酸的取代,特別優(yōu)選數(shù)值為±1,那些數(shù)值在±0.5以內(nèi)的取代是最優(yōu)選的取代。
SCP突變體包括至少7個氨基酸殘基,優(yōu)選地大約100-1500個殘基,更加優(yōu)選大約300-1200個殘基,甚至更加優(yōu)選大約500-1180個殘基。其中,SCP突變體與對應(yīng)的天然SCP氨基酸序列比較至少具有50%,優(yōu)選至少約80%,更加優(yōu)選至少90%,但是小于100%的毗鄰氨基酸序列同源性或一致性。
突變體SCP多肽的氨基酸序列基本上對應(yīng)于天然SCP多肽的氨基酸序列。正如這里所使用的“基本上對應(yīng)于”是指一個將引起與天然SCP所產(chǎn)生的應(yīng)答基本相同的保護性免疫應(yīng)答的多肽序列。這樣一種應(yīng)答可能是天然SCP所產(chǎn)生的應(yīng)答水平的至少60%,甚至可能是天然SCP所產(chǎn)生的應(yīng)答水平的至少80%。對一種組合物或疫苗的免疫應(yīng)答是指在宿主內(nèi)細(xì)胞和/或抗體介導(dǎo)的對于感興趣多肽或疫苗的免疫應(yīng)答的形成。通常,這樣一種應(yīng)答包括產(chǎn)生抗體的個體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制性T細(xì)胞和/或明確針對被包括在感興趣的組合物或疫苗內(nèi)的抗原或各種抗原的細(xì)胞毒性T細(xì)胞。
此SCP可能是A群鏈球菌(SCPA)、B群鏈球菌(SCPB)、C群鏈球菌(SCPC)或G群鏈球菌(SCPG)SCP的突變體。
本發(fā)明的突變體可以包括沒有出現(xiàn)在對應(yīng)的天然SCP中的氨基酸殘基或與對應(yīng)的天然SCP有關(guān)的缺失。突變體還可以是與相應(yīng)的天然SCP比較,被截短了的長蛋白“片段”,也就是說,僅僅是全長蛋白質(zhì)的一部分。例如,突變體SCP與天然SCP的差別可能在于它沒有細(xì)胞壁插入。SCP突變體還包括含有至少一個D-型氨基酸的肽。
疫苗的SCP突變體可以表達自一種分離的編碼突變體SCP的DNA序列。例如,突變體SCP天然SCP的差異可能在于其不含有信號序列或細(xì)胞壁插入。DNA可編碼特異性縫隙或催化結(jié)構(gòu)域。特別是DNA可編碼催化結(jié)構(gòu)域的130、193、295或512位氨基酸殘基,或特異性縫隙的260、261、262、415、416或417位氨基酸殘基或者在這些殘基上編碼修飾。特別是DNA可編碼SCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPAIN295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512A或ΔSCPA49。對于以上清單,SCPA49H193A是指A群鏈球菌血清型49的一種SCP,其中,第193位殘基處His殘基被Ala代替。此疫苗的SCP可缺乏酶的C5ase或肽酶活性。此疫苗可能還含有一種免疫佐劑。此疫苗可以用來預(yù)防A群鏈球菌、B群鏈球菌、C群鏈球菌或G群鏈球菌的感染。此疫苗還包括一種具有免疫原性的被接合或連接到一種有免疫原性的肽上或有免疫原性的多糖上的重組鏈球菌C5ase肽酶?!爸亟M”定義為一種利用遺傳工程的方法產(chǎn)生的肽或核酸。術(shù)語“蛋白質(zhì)”,“肽”或者“多肽”在此可以相互交換地使用。
鏈球菌C5a肽酶疫苗能通過皮下或肌肉注射給藥。選擇地,此疫苗可以口服或鼻內(nèi)接種給藥。
本發(fā)明進一步提供分離和純化的SCP肽,其中,SCP是野生型SCP的突變體及被分離、純化的編碼突變體SCP的多聚核苷酸。例如,SCP可包括催化結(jié)構(gòu)域的130、193、295或512位氨基酸殘基,或特異性縫隙的260、261、262、415、416或417位氨基酸殘基。此SCP可以是SCPA49D130A、SCPA49H193A、SCPA49N295A、SCPA49S512A、SCPA1D130A、SCPA1H193A、SCPA1N295A、SCPA1S512A、SCPBD130A、SCPBH193A、SCPBN295A、SCPBS512A或ΔSCPA49。
附圖簡述
圖1.β-溶血性鏈球菌C5a肽酶的結(jié)構(gòu)。D表示天冬氨酸殘基;H表示組氨酸;S表示絲氨酸;L表示亮氨酸;P表示脯氨酸;T表示蘇氨酸;而N表示天冬酰胺。R1、R-2、R3和R4表示重復(fù)序列。數(shù)字表示氨基酸殘基在肽酶中的位置。
圖2.A群鏈球菌血清型49的SCP的氨基酸序列(序列號1)、A群鏈球菌血清型12的SCP的氨基酸序列(第2號序列)、B群鏈球菌的SCP的氨基酸序列(第3號序列)和A群鏈球菌血清型1的SCP的氨基酸序列(序列號23)的成線法(比較)。除了所指出的氨基酸位點以外,這些序列完全相同。三角形()表示預(yù)測的信號肽酶切割位點。預(yù)測位于酶活性位點的氨基酸用星號標(biāo)記。氨基酸序列的缺失用點表示,并框起來。星號(*)表示催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基。
圖3.SCP插入和缺失突變體的構(gòu)建。黑框表示被缺失區(qū)域。
圖4.單色熒光激活細(xì)胞分選儀分析。熒光數(shù)據(jù)通過在多型核白細(xì)胞上(PMNs)的閥門控制行分析。設(shè)定第二種閥門來計數(shù)由第一個閥門定義的高染色細(xì)胞。氣囊用1×106CFU接種。
圖5.鼻內(nèi)感染后野生型和SCPA血清型M49鏈球菌的持留。
圖6.鼻內(nèi)感染后A群鏈球菌血清型M6各種SCPA突變體在小鼠體內(nèi)集群的能力的比較。比較接種了2×107CFUM6鏈球菌的BALB/c小鼠(每試驗組十只)。每天在含有鏈霉素的血瓊脂平板上培養(yǎng)喉拭子。如果平板含有一個β-溶血性菌落,就認(rèn)定小鼠為陽性。數(shù)據(jù)利用β2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。
圖7.ΔSCPA49的構(gòu)建和免疫程序。
圖8.兔抗體中和與不同血清型相關(guān)的SPCA活性。第1條是一個陽性對照,且含有rhC5a,在接觸PMNs之前rhC5a不預(yù)先溫育。第10條是缺乏rhC5a的一個對照。完整而無損傷的細(xì)菌,預(yù)先與正常的兔血清完整溫育(第2條,M190-131;第4條,M6UAB200;第6條,M12CS24;第8條,M49CS101)或者預(yù)先與兔抗-SCPA49血清溫育(第3條,M190-131;第5條,M6 UAB200;第7條,M12 CS24;第9條,M49 CS101)后,與20β15βMrhG5a溫育45分鐘。殘留rhC5a利用其活化PMNs粘附到被BSA包被的微量滴定板的小孔上的能力來測定。粘著的PMNs用結(jié)晶紫染色。
圖9.用純化的ΔSCPA49蛋白鼻內(nèi)免疫小鼠以后的血清IgG和分泌型IgA應(yīng)答。血清和唾液的SCPA49特異性IgG水平利用間接酶聯(lián)免役法測定。將每只小鼠血清用PBS稀釋到1∶2,560;唾液用PBS稀釋到1∶2。圖9A顯示sIgA試驗結(jié)果;圖9B顯示IgG試驗結(jié)果。
圖10.鏈球菌血清型M49在免疫和未免疫過的CD1雌性小鼠體內(nèi)集群的能力的比較。每一試驗組含有13只鼻內(nèi)感染2×108CFU(i.n.)的小鼠。數(shù)據(jù)利用β2檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。圖10A和圖10B顯示重復(fù)試驗的結(jié)果。
圖11.野生型和突變體SCP結(jié)合多克隆抗體的競爭性ELISA比較。鋪板的抗原是重組的野生型SCPA49(100ng/孔)。競爭的抗原用圖例顯示。
圖12.SCPA1、SCPA49和SCPB結(jié)合多克隆抗體的競爭性ELISA比較。平板抗原是重組的野生型SCPA49(100ng/孔)。競爭性抗原用圖例顯示。本圖所描述的在試驗中使用的SCPA1和SCPA49包括Asn32到His1139。根據(jù)Chmouryguina,I等,“A群和B群鏈球菌C5a肽酶基因的保守性”,傳染與免疫(Infect.Immun.),642387-2390(1996),制備在本圖中被描述的實驗中所用的SCPB。
本發(fā)明詳述第一條重要的抗病原體感染的防線是吞噬性多型核白細(xì)胞(PMNs)和單核細(xì)胞在感染部位的聚積。這些細(xì)胞的吸引作用是由趨化性攻擊例如宿主因子或由侵入的生物體所分泌的因子所介導(dǎo)。在哺乳動物上,C5a化學(xué)引誘劑對于炎癥應(yīng)答的刺激是關(guān)鍵的。C5a是一種74個殘基的、由第5補體成分?jǐn)嗔旬a(chǎn)生的的糖肽。吞噬細(xì)胞直接對C5a梯度應(yīng)答,并在感染部位聚積。C5a可能是炎癥期間最直接的吞噬細(xì)胞引誘劑。正如PMNs浸潤炎癥性壞死一樣,它們分泌其它的趨化因子例如IL8,這些因子進一步強化炎癥應(yīng)答。
正如C5a是在局部所產(chǎn)生的一樣,鏈球菌C5a肽酶(SCP)是一種定位于致病性鏈球菌細(xì)胞表面并在此處破壞C5a的蛋白水解酶。SCP在PMN結(jié)合位點處(位于C5aHis67-Lys68殘基之間)特異性地切割C5a趨化因子,去除C5a最靠近C-末端的7個殘基。PMN結(jié)合位點的切割將會消除趨化性信號。參閱Cleary,P.,等,“鏈球菌C5a肽酶是一種高度特異的內(nèi)肽酶”,傳染與免疫(Infect.Immun.),6052 19-5223(1992);Wexler,D.E.,等,“A群鏈球菌C5a活化劑的作用機制”,美國國家科學(xué)院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci USA),828144-8148(1985)。
A群鏈球菌的SCP是一種枯草桿菌蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶,分子量為124,814道爾頓,具有許多革蘭氏陽性細(xì)菌的常見表面蛋白的細(xì)胞壁鉚定基序。C5a肽酶的結(jié)構(gòu)在圖1給出。釀膿鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列已經(jīng)被公開。參閱Chen,C.和Cleary,P.,“釀膿鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),2653161-3167(1990)。與枯草桿菌蛋白酶相反,SCP的底物特異性非常窄??紤]到其催化結(jié)構(gòu)域的顯著的相似性,這樣的窄的底物特異性是令人驚訝的。參閱Cleary,P.,等,“鏈球菌C5a肽酶是一種高度特異性的內(nèi)肽酶”,傳染與免疫(Infect.Immun.),6052 19-5223(1992)。與電荷轉(zhuǎn)移有關(guān)的殘基是位于結(jié)合口袋兩邊的殘基是保守的(殘基)。然而,SCP的其余的氨基酸序列與枯草桿菌蛋白酶的(其余氨基酸序列)無關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)A群鏈球菌有超過40種血清型產(chǎn)生SCP蛋白或者具有該基因。參閱Cleary,P.,等,“趨化作用的一種鏈球菌性滅活劑A群鏈球菌特異的一個新毒性因子”,鏈球菌和鏈球菌性疾病的新進展(RecentAdvances in Streptococci and Streptococcal Disease)179-180頁(S.Kotamiand Y.Shiokawa編著;Reedbooks Ltd.,Berkshire,England;1984);Podbielski,A.,等,“A群鏈球菌virR49基因控制四個vir調(diào)節(jié)子結(jié)構(gòu)基因的表達”,傳染與免疫(Infect.Immun.),639-20(1995)。
SCP催化結(jié)構(gòu)域,或者說活性位點包括電荷轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和特異性縫隙。電荷轉(zhuǎn)移系統(tǒng),也稱為催化結(jié)構(gòu)域,含有Asp130、His193、Asn295及Ser512殘基(圖1和2)。修飾,也就是說,缺失、插入或取代這些氨基酸中的任何一個,將使此酶失活。在另一方面,預(yù)測特異性縫隙是由Ser260、Phe261、Gly262、Ile415、Tyr416和Asp417形成的。通過取代這些氨基酸而進行的修飾可能改變此酶的底物特異性或完全消除蛋白水解活性。通過刪除這些氨基酸而進行的修飾可能也會使此酶失活。催化結(jié)構(gòu)域依賴于蛋白質(zhì)在成熟的酶折疊成活性狀態(tài)時所產(chǎn)生的三級結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)不是由氨基酸殘基的連續(xù)線性排列所形成的。選擇地,修飾還可能減少SCP突變體和底物的結(jié)合。結(jié)合可能減少50%,70%或者甚至80%。
與B群鏈球菌相關(guān)的C5a肽酶也己被鑒定。參閱Hill,H.R.,等,“B群鏈球菌抑制第五補體成分的趨化活性”,免疫學(xué)雜志(J.Immunol.),1413551-3556(1988)。ScpB的限制性圖譜和核苷酸序列的完成顯示scpB與scpB的相似性為97-98%。請參見圖2。A群鏈球菌血清型49、A群鏈球菌血清型12、B群鏈球菌和A群鏈球菌血清型1(分別為序列號1,序列號2,序列號3,序列號23)的SCP的氨基酸序列的比較。代表B群鏈球菌的全部血清型的超過30種的菌株,都攜帶scpB基因。參閱Cleary P.P.,等“B群和A群鏈球菌C5a肽酶基因之間的相似性”,傳染與免疫(Infect.Immun.),604239-4244(1992);SuvorovA.N.,等,“B群鏈球菌C5a肽酶基因”,鏈球菌、乳球菌和腸球菌的遺傳學(xué)與分子生物學(xué)(Genetics and Molecular Biology of Streptococci Lactococciand Enterococci)230-232頁(G.Dunny,P.Cleary and L.McKay(ed.);American Society for Microbiology,Washington,D.C.;1991)。
G群和C群鏈球菌的人體分離物還具有scpA-樣基因。已經(jīng)顯示一些G群菌株在它們的表面表達C5a特異性蛋白酶活性。參閱Cleary,P.P.,等,“人的有毒性的G群鏈球菌菌株表達一種與A群鏈球菌所產(chǎn)生的酶相似的C5a肽酶”,傳染與免疫(Infect.Immun.),592305-2310(1991)。所以,A群、B群、C群和G群鏈球菌的全部血清型(>80)都產(chǎn)生SCP酶。
SCP通過抑制吞噬性白細(xì)胞流入感染部位來幫助鏈球菌在一個潛在的感染部位例如鼻咽粘膜集群。這阻礙宿主對鏈球菌最初的清除。利用蛋白酶結(jié)構(gòu)基因上具有明確突變的菌株,檢查了SCP對炎癥、C5a白細(xì)胞趨化作用以及鏈球菌的毒性的影響。利用靶向質(zhì)粒插入以及利用含有明確確定的內(nèi)部缺失的scpA取代野生型基因,構(gòu)建了SCP突變體。各突變體缺乏C5a蛋白酶活性,并且不抑制人或小鼠的PMNs對C5a的體外趨化應(yīng)答。
小鼠結(jié)締組織氣囊模型被用來確定SCP阻礙吞噬細(xì)胞的流入和鏈球菌從感染部位清除。通過用一個25-規(guī)格的針頭在小鼠背部皮下注射小量的空氣和PBS(其中含有鏈球菌或不含有鏈球菌)來產(chǎn)生小鼠結(jié)締組織氣囊模型。參閱Boyle,M.D.P.等,“體內(nèi)白細(xì)胞趨化作用的測量”,酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.),162101115(1988)。在實驗結(jié)束后,小鼠被脫頸處死。從動物切取氣囊,在緩沖液中使氣囊勻漿。氣囊模型的一個好處就是氣囊可維持膨脹數(shù)天且不會發(fā)炎,除非注射一種激發(fā)劑。因而,注射的細(xì)菌和因此發(fā)生的炎癥應(yīng)答在感染的短時期間是局部性的。
修飾氣囊模型與野生型SCP+和SCP-鏈球菌(也就是說,攜帶一個突變的無功能形式的SCP的A群鏈球菌),并且分析感染早期的細(xì)胞浸潤。在血瓊脂平板上化驗組織懸液的活鏈球菌,并利用熒光細(xì)胞分選技術(shù)(FACS)分析細(xì)胞浸潤。在FACS分析中,懸液中各單細(xì)胞用特異性熒光單克隆抗體標(biāo)記。將部分被標(biāo)記的細(xì)胞注射到FAC-Scan流式細(xì)胞計數(shù)器上或熒光細(xì)胞分選儀上,基于它們特有的熒光計數(shù)細(xì)胞。使用氣囊模型進行的實驗顯示SCP+鏈球菌比SCP-鏈球菌的毒性更高。
進行一項研究測量人的血清和唾液中抗-SCP的人源抗體包括IgG和IgA的產(chǎn)生。參閱O′Connor,SP,等,“人對鏈球菌C5a肽酶的抗體應(yīng)答”,傳染病雜志(J.Infect.Dis.),163109-16(1991)。通常,未感染的年幼兒童缺乏SCP抗體。相反地,健康的成年人的多數(shù)血清和唾液標(biāo)本具有可測量的抗-SCP的IgG和SCP-特異性分泌型IgA(抗-SCP的sIgA)水平。鏈球菌性咽炎患者的急性期及康復(fù)期成對血清,擁有顯著高于健康個體血清的抗-SCP IgG水平。含有高濃度抗-SCP免疫球蛋白的血清能夠中和SCP活性。從最近患過鏈球菌性咽炎的兒童所采集的>90%的唾液標(biāo)本的抗體檢測,表明兒童能產(chǎn)生抗體應(yīng)答。
即使是通過在天然鏈球菌的感染應(yīng)答中產(chǎn)生抗-SCP IgG和IgA抗體的人類受試者,仍然不知道抗-SCP的免疫球蛋白是否能提供任何抗感染保護。更進一步地,不知道SCP蛋白是否能作為一種抗β-溶血性鏈球菌集群或者感染的疫苗。首先,進行一項研究檢查在鼻咽部位集群中的SCP作用。用活的A群鏈球菌鼻內(nèi)感染后,每日取咽喉培養(yǎng)物達10天。比較野生型和等基因的SCP-缺陷型突變體在此10天期間在咽喉部位持留的能力。正如預(yù)測的一樣,鏈球菌的SCP-缺陷型突變體被更快地從鼻咽部位清除。
相同的鼻內(nèi)小鼠模型被用來試驗SCP誘導(dǎo)預(yù)防集群的免疫力的能力。一個突變體形式的在編碼Thr63的核苷酸處開始的重組的scpA19基因被克隆。此突變體被稱為ΔSCPA49,長度為2908bp(見下面的實施例4)。利用親和層析從E.coli重組體純化突變體的SCP蛋白。皮內(nèi)免疫此蛋白制劑(所產(chǎn)生)的兔血清體外中和SCP活性。在5周時期內(nèi),給小鼠鼻內(nèi)給藥此純化蛋白(40μg)。免疫的小鼠在1-2天內(nèi)清除鏈球菌;然而,未免疫小鼠的咽喉培養(yǎng)物維持陽性達10天。在三組用三個獨立的SCP蛋白制劑接種的小鼠中重復(fù)此試驗。
進行進一步的試驗確定用單一抗原免疫動物是否能預(yù)防數(shù)種血清型的集群。ΔSCPA49被克隆到一個表達載體上,并在E.coli中表達。親和純化的突變體ΔSCPA49蛋白在小鼠和兔中證明是高度免疫原性的。雖然純化的突變體ΔSCPA49免疫原缺乏酶的活性,但它誘導(dǎo)高滴度的能體外中和與M1、M6、M12及M49鏈球菌相關(guān)的肽酶活性的兔抗體。這證明抗-肽酶的抗體缺乏血清型特異性。然后用純化的突變體ΔSCPA49鼻內(nèi)免疫四組小鼠,而且各組均用一種不同血清型的A群鏈球菌攻擊。用ΔSCPA49蛋白免疫小鼠攻擊了顯著水平的特異性唾液sIgA和血清IgG抗體,并且降低野生型M1、M2、M6、M11和M49鏈球菌集群的潛力。這些試驗確定用C5a肽酶疫苗免疫有效預(yù)防在鼻咽部位的集群。
還進行試驗從M1 OF-菌株和OF+菌株開發(fā)突變體SCPs。因為有活性的SCP可能對身體有害,所以突變體蛋白缺乏酶活性是重要的。用那些預(yù)期將使此酶失活的氨基酸取代催化活性所必需的氨基酸。
同時確定了突變體蛋白的兩個性質(zhì)。首先,利用PMN粘附試驗測定了野生型蛋白和突變體蛋白的比活。這些試驗顯示,被取代的氨基酸使得酶的活性降低了超過90%。第二,還比較了突變體蛋白和野生型蛋白結(jié)合針對此野生型酶的抗體的能力。為此目的,使用了競爭性ELISA試驗。結(jié)果顯示氨基酸取代不改變抗體結(jié)合突變體蛋白的能力。
所有早期的保護研究已通過鼻內(nèi)給藥無佐劑的親和純化的ΔSCPA49蛋白來進行。然而,肌肉或皮下(SQ)注射抗原在歷史上是一種優(yōu)選的、更加公認(rèn)的疫苗投藥方法。因此,已進行試驗測試ΔSCPA與單磷脂A(MPL)及明礬(AlPO4)的皮下注射是否誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答,以及當(dāng)A群鏈球菌的攻擊菌株與SCPA疫苗來源不同時此應(yīng)答是否降低集群。利用咽喉培養(yǎng)物或通過被解剖的鼻組織的取樣,測定免疫過的小鼠從口-鼻咽粘膜清除鏈球菌的能力。
與鼻組織相關(guān)的鏈球菌的數(shù)量和預(yù)期的一樣,隨時間的延長而減少,在用SCPA抗原免疫過的小鼠中這種減少更快更完全。這些結(jié)果證明了單一SCPA抗原能夠誘導(dǎo)抗異種血清型的保護作用。保護作用由中和細(xì)菌表面的肽酶活性的抗體提供。這增加了鏈球菌在粘膜組織沉積以后數(shù)小時內(nèi),吞噬細(xì)胞的流入。吞噬細(xì)胞快速清除鏈球菌,這被假定為能夠預(yù)防細(xì)菌此后的增殖和持留。因此,SCPA抗原與佐劑的皮下注射一貫誘導(dǎo)強烈的抗體應(yīng)答。
本發(fā)明提供一種用以保護哺乳動物抗β-溶血性鏈球菌集群或感染的疫苗。在本發(fā)明的一個實施方案中,突變體C5a肽酶可以在一種藥理上接受的賦形劑中投遞給哺乳動物。本發(fā)明中的疫苗還可以包括有效量的已知能增強免疫應(yīng)答的免疫佐劑。
可將SCP接合或連接到另一個肽或多糖上。例如,可以利用本領(lǐng)域公知的又被稱為“載體”的有免疫原性的蛋白。有用的有免疫原性的蛋白包括鑰孔血藍素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白、人血清白蛋白、人丙種球蛋白、雞免疫球蛋白G和牛丙種球蛋白。有用的免疫原性的多糖包括A群鏈球菌的多糖、B群鏈球菌的C-多糖,或者肺炎鏈球菌(Streptococcus pnuemoniae)或B群鏈球菌的莢膜多糖。選擇地,可將其它用做疫苗的病原體的多糖或蛋白接合或連接到SCP上,或者與SCP混合。
本發(fā)明進一步提供了被分離和純化的核酸分子,例如DNA分子,包括一段預(yù)先選擇的編碼鏈球菌C5a肽酶之至少一部分的核酸片段,也就是說,它們編碼SCP或其在此所述的一個突變體,例如SCPA49S512A、SCPA49D130A、SCPA49N295A、SCPA1S512A、SCPA1D130A、SCPA1N295A、ΔSCPA49、SCPBS512A、SCPBD130A、SCPBH193A或SCPBN295A,或這些突變體之任何組合。例如,本發(fā)明還提供一種表達盒,這種表達盒包括了一段預(yù)先選擇的編碼RNA分子的DNA片段,所編碼的RNA分子與內(nèi)源的或天然的SCPmRNA一的全部或一部分基本相同(意義)。此表達盒中預(yù)先選擇的DNA片段在操作上被連接到一個啟動子上。正如這里所使用的一樣,序列“基本相同”的意思是兩個核酸序列彼此之間擁有至少約65%,優(yōu)選約70%,更優(yōu)選約90%,甚至更優(yōu)選約98%的毗鄰核酸序列一致性。優(yōu)選地,預(yù)先選擇的DNA片段在雜交條件下,優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下,與編碼對應(yīng)的天然SCP的核酸分子雜交。
正如這里所使用的一樣,“基本上純”的意思是目的物質(zhì)是存在的主要物質(zhì)(也就是說,按摩爾計算,目的物質(zhì)比組合物中其它任何物質(zhì)存在的量都要大),而且優(yōu)選地,一種基本上被純化了的部分是一種組合物,其中,目的物質(zhì)至少占存在的全部大分子物質(zhì)的50%(按摩爾計算)。通常,一種基本上純的組合物占存在于此組合物的全部大分子物質(zhì)的約80%以上,更加優(yōu)選超過約85%,約90%,約95%,以及約99%。最優(yōu)選地,目的物質(zhì)被純化到真正的同質(zhì)性(利用常規(guī)的檢測方法在此組合物中檢測不到),其中,組合物主要包括單一大分子物質(zhì)。
正如這里所使用的一樣,術(shù)語“重組核酸”或“預(yù)先選擇的核酸”,例如“重組DNA序列或片段”或“預(yù)先選擇的DNA序列或片段”,指一種從任何合適來源衍生或分離而來的,隨后可發(fā)生體外化學(xué)改變,從而使其序列不是天然存在的、或者與天然存在的序列一致但是其所處的位置與其在未轉(zhuǎn)化過外源DNA的基因組內(nèi)所處的位置不同的核酸,例如DNA。一個從一種來源“衍生”而來的預(yù)先選擇的DNA的例子,是一種被鑒定為特定生物體內(nèi)有用片段,隨后化學(xué)合成的基本上純的DNA序列。這種從一種來源“分離”而來的DNA的例子,是一種利用化學(xué)手段,例如利用限制性內(nèi)切核酸酶,從所說的來源切除或去除,從而使其可通過遺傳工程的方法被進一步操作,例如擴增,供本發(fā)明使用的有用的DNA序列。
從限制酶消化產(chǎn)物回收或分離特定DNA片段,包括利用聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳進行消化產(chǎn)物的分離、通過將其遷移率與具有已知分子量的DNA片段標(biāo)記物的遷移率做比較對感興趣的片段進行的鑒定、切除含有預(yù)期片段的凝膠部分,以及凝膠與DNA的分離。請參見Lawn等,核酸研究(Nucleic Acids Res.),9,6103(1981)及Goeddel等,核酸研究(Nucleic Acids Res.),8,4057(1980)。因此,“預(yù)先選擇的DNA”包括全合成的DNA序列、半合成的DNA序列、從生物來源分離的DNA序列,和從RNA衍生而來的DNA序列,以及它們的混合物。
正如這里所使用的,談到與RNA分子相關(guān)的術(shù)語“衍生的”指此RNA分子與特定的DNA分子具有互補的序列一致性。
編碼SCP的氨基酸序列突變體的核酸分子,通過本領(lǐng)域中公知的多種方法來制備。這些方法包括,但是不限定在從天然來源分離(對于天然存在的氨基酸序列突變體而言)或者通過寡聚核苷酸介導(dǎo)的(定點)突變、PCR突變,以及早期制備的SCP突變體或非突變體形式SCP的盒式突變來制備。
腸胃外給藥突變體SCP免疫個體,通常是用一種合適的賦形劑經(jīng)肌肉或皮下注射(給藥)。然而,其它的給藥方式,例如口腔投遞或鼻內(nèi)投遞,也是可以接受的。疫苗配方在賦形劑中含有一個有效量的活性成分。此有效量足以預(yù)防、改善或減少β-溶血性鏈球菌在靶哺乳動物中集群的發(fā)病率。此有效量可由本領(lǐng)域中的熟練人員很容易地確定。活性成分,典型地,占此組合物的大約1%到大約95%(w/w),如果合適的話或者甚至更高或更低。將要給藥的量取決于各種因素,例如考慮免疫的動物或人的個體年齡、體重和身體狀況。這個量還取決于此動物的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力以及所期望的保護程度。有效的劑量,可由本領(lǐng)域中具有普通技能的人員,通過確定劑量應(yīng)答曲線的常規(guī)試驗很容易地確定。通過單次或多次給藥SCP免疫個體。維持對于鏈球菌的免疫狀態(tài)可能必須多次給藥。
鼻內(nèi)用藥配方可以包括既不引起對鼻粘膜的刺激也不妨礙纖毛功能的賦形劑。稀釋液,例如水、鹽水溶液或能夠用于本發(fā)明目的的其它公知物質(zhì)。鼻內(nèi)用藥配方還可含有防腐劑例如,氯代丁醇及氯化芐烷銨,但是不限定于。可以有一種表面活性劑來提高膩粘膜對所研究的蛋白的吸收。
口服液體制劑可以是這樣的形式,例如水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑,或者是以干燥的在使用之前需要用水或其它合適的賦形劑重新組合的片劑或產(chǎn)品給出。這樣的液體制劑可含有常規(guī)的添加劑,例如懸浮劑、乳化劑、非水賦形劑(可包括食用油)或防腐劑。
為了制備疫苗,被純化的SCP可以被分離、凍干及穩(wěn)定化。然后可將此SCP肽調(diào)整到一個合適的濃度,選擇性地與一種合適的疫苗佐劑組合,并包裝供使用。合適的佐劑,包括但是不限定于表面活性劑,例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基二十八烷基銨、N,N-二十八烷基-N′-N-雙(2-羥乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六-甘油,復(fù)合多元醇及聚陰離子,例如吡喃、硫酸右旋糖酐、多聚肌苷酸多聚胞苷酸、聚丙烯酸、卡巴浦爾;肽,例如胞壁?;?、單磷脂、二甲基甘油(aimethylglycine)、特夫素、油類乳劑、明礬和它們的混合物。其它潛在的佐劑包括E.coli熱不穩(wěn)定毒素的或霍亂毒素的B肽亞基。參閱McGhee,J.R.,等,“論疫苗開發(fā)”,血液學(xué)研究(Sem.Hematol.),303-15(1993)。最后,可把有免疫原性的產(chǎn)物摻入到脂質(zhì)體用于疫苗配方,或接合到各種蛋白上,例如匙孔血藍蛋白(KLH)或人血清白蛋白(HSA)或其它聚合物。
SCP用來免疫哺乳動物抗集群的用途,提供了超過其它疫苗候選者的優(yōu)勢。通過接種單一蛋白進行的集群或感染的預(yù)防,將不僅減少極其常見的鏈球菌咽炎(strep throat)及膿皰病問題的發(fā)病率,而且還將消除其后遺癥,例如風(fēng)濕熱、腎小球性腎炎、膿毒病、中毒性休克和壞死性筋膜炎。用下面的實施例旨在說明本發(fā)明,而不是來限定本發(fā)明。
實施例1scpA49和scpA6的插入和缺失突變體的構(gòu)建和體外分析a)細(xì)菌的菌株和培養(yǎng)條件。釀膿鏈球菌(S.pyogenes)菌株CS101是血清型M49和血清不透明性陽性(OF+)的菌株。CS159是一種具有一個貫穿M基因簇和scpA的缺失的臨床分離物。從菌株CS101自然產(chǎn)生的鏈霉素抗性的衍生菌株,被命名為CS101sm,將固相培養(yǎng)的鏈球菌在含有鏈霉素(200ìg/ml)的tryptose血瓊脂上鋪平板以進行選擇。鏈球菌菌株CS210和CS463分別是OF+、II類、血清型M2和M11菌株自然產(chǎn)生的鏈霉素抗性菌株。鏈球菌菌株90-131和UAB200分別是A群鏈球菌的OF-、I類、血清型M1和M6的人類的分離物。
CS101∷pG+host5是具有被整合到染色體中位于scpA和emm基因簇之外的一個未知位點的pG+host5的菌株CS101。大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株ERl821(購自New England Biolabs,Inc.Beverly,MA)被用做自殺性載體質(zhì)粒pG+host5的接受者。質(zhì)粒pG+host5獲自Appligene,Inc.Pleasanton,CA。鏈球菌培養(yǎng)于添加了2%新蛋白胨或1%酵母提取物的Todd-Hewitt肉湯或在含有5%羊血的tryptose瓊脂上鋪平板。E.coli菌株ER1821,含有質(zhì)粒pG+host5,在含有紅霉素(300μg/ml)的LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)。含有質(zhì)粒pG+host5的鏈球菌在含有1%酵母提取物(THY)、1μg/ml紅霉素(Erm)的Todd-Hewitt肉湯中培養(yǎng)。
SCP泛指β-溶血性鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶。SCPA1、SCPA12、SCPA49、SCPA6分別是從A群鏈球菌M血清型1、12、49和6菌株得到的特異性肽酶。術(shù)語scpA指編碼A群鏈球菌SCP的基因。ScpA1、
scpA12、scpA6和scpA49是編碼SCPA1、SCPA12、SCPA49和SCPA6肽酶的基因。SCPB和scpB指B群鏈球菌的肽酶和基因。SCPA49(第1序列號),SCPA12(第2序列號),SCPA1(第23序列號)和SCPB(第3序列號)的氨基酸序列在圖2中給出。
b)scpA49插入突變體的構(gòu)建。利用質(zhì)粒插入和基因替換方法構(gòu)建ScpA49的定義明確的插入突變體。一個內(nèi)部scpA49BglII和BamHI片段,既插入的靶,被連接到熱敏感性穿梭載體pG+host5上形成質(zhì)粒pG∷scpA1.2并且轉(zhuǎn)化進E.coli ER1821(圖3)。pG+host5載體含有在39℃有活性的E.coli復(fù)制啟動子,這是一種溫度敏感型革蘭氏陽性菌復(fù)制啟動子(在鏈球菌中在30℃下有活性,在39℃下失去活性),此載體還含有一個供選擇用的紅霉素抗性基因。高溫迫使質(zhì)粒通過同源重組以102-103的頻率整合到A群鏈球菌的染色體DNA中。
重組的質(zhì)粒DNA pG∷scpA1.2經(jīng)電穿孔導(dǎo)入CS101受體細(xì)胞。在30℃下在含有1μg/ml紅霉素繁榮THY-瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。由質(zhì)粒插入物和染色體scpA49之間重組引起的染色體整合體,在39℃下利用紅霉素抗性來選擇。分析了兩個插入突變體M14和M16。菌株M14和M16的EmrS回復(fù)突變體通過在無抗生素的THY中在30℃下傳代,最后在無Erm選擇的條件下于37℃鋪平板來獲得。丟失此質(zhì)粒的克隆被分離出來,從而證明突變的表型是由此質(zhì)粒插入到scpA49中所產(chǎn)生的,而不是由自然產(chǎn)生的無關(guān)突變所產(chǎn)生的。
c)scpA6插入突變體的構(gòu)建。如用上在(b)部分所描述的方法,構(gòu)建scpA6插入突變體AK1.4。重組的質(zhì)粒DNA,pG∷scpA1.2,含有scpA基因的一個內(nèi)部BglII-HindIII片段。此質(zhì)粒經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化進UAB200受體細(xì)胞,轉(zhuǎn)化體在37℃下在含有紅霉素的THY瓊脂上選擇。由質(zhì)粒插入物和染色體scpA6之間的重組所產(chǎn)生的pG∷scpA1.2的一個染色體整合體,菌株AK1.4,通過在39℃下在含有紅霉素的瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)來進行選擇。通過用scpA做探針進行Surthern印跡以及用對此質(zhì)粒特異的一個M13通用引物(5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)(第6號序列)和對GAS的染色體scpA6特異的一個scpA For835引物(5′-AAGGACGACACATTGCGTA-3′)(第7號序列),來證明此插入。
d)將一個明確缺失導(dǎo)入scpA(圖3)。構(gòu)建一個在scpA49內(nèi)部含有明確缺失的突變菌株,從而消除scpA49內(nèi)的插入所具有的極性并減少下游基因表達的可能性,這些未知的基因可能也有助于此生物體的毒性。首先,scpA BglII-HindIII片段中的明確的缺失是利用內(nèi)外(inside-out)PCR產(chǎn)生,所用的引物1為(5′-GGGGGGGAATTCGTAGCGGGTATCATGGGAC-3′)第4號序列及所用引物2為(5′-GGGGGGGAATTCGGGTGCTGCAATATCTGGC-3′)第5號序列。下面劃線的核苷酸分別對應(yīng)于坐標(biāo)2398和2322的scpA序列,而粗體的核苷酸對應(yīng)于一個EcoRI限制性識別位點。選擇引物,在scpA基因中產(chǎn)生符合閱讀框的缺失。這些引物按相反的方向復(fù)制質(zhì)粒DNA,并且限定缺失的邊界。參閱Innis,M.A.,等,eds.,PCR操作規(guī)程方法和應(yīng)用指導(dǎo)(PCR Protocols A Guideto Methods and Applications),Academic Press,1990。質(zhì)粒pG∷scpA1.2DNA被用做模板。
擴增產(chǎn)物用EcoRI消化并連接到質(zhì)粒pG+host5上。所產(chǎn)生的質(zhì)粒pG∷ΔscpA1.1在scpA內(nèi)部含有一個76bp的缺失。這個符合閱讀框的缺失去除了25個氨基酸,包括形成預(yù)測的絲氨酸蛋白酶催化中心之部分的絲氨酸。參閱Chen,C.,和Cleary,P.,“釀膿鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),2653161-3167(1990)。在缺失位點產(chǎn)生了一個EcoRV位點。測定與此缺失重疊的DNA的序列,以確認(rèn)缺失的邊界。
含有缺失的質(zhì)粒pG∷ΔscpA1.1被轉(zhuǎn)化進E.coli ER1821中。選擇ErmR克隆,此后利用小量制備的EcoRI限制酶消化的質(zhì)粒DNA篩選合適的scpA缺失。缺失的精確邊界用DNA測序確定。質(zhì)粒pG∷ΔscpA1.1如上所述經(jīng)電穿孔導(dǎo)入菌株CS101sm,此后在39℃下在Erm中培養(yǎng)以篩選整合體。利用高溫選擇,將此質(zhì)粒整合入M49菌株CS101sm。利用PCR確定插入位置。CS101sm(pG∷ΔscpA1.1)在低溫下不加紅霉素選擇的條件下,高頻率地引起由于插入所產(chǎn)生的重復(fù)的scpA序列之間的重組所導(dǎo)致的通過隨機缺失或者甚至通過切除而丟失了此質(zhì)粒所產(chǎn)生的回復(fù)突變體的分離。鑒定了兩個缺失突變體,MJ2-5和MJ3-15,并對其做進一步研究。通過質(zhì)粒pG∷ΔscpA1.1的重組性切除而留下的染色體缺失,利用PCR以及與EcoRV消化過的DNA之間的Southern雜交確定。
e)突變對SCP的體外效應(yīng)。利用Western印跡和PMNs粘附試驗確定插入和缺失對于SCP抗原的表達和肽酶活性的所發(fā)揮的效應(yīng)。鏈球菌在100ml THY中在37℃下溫育過夜。培養(yǎng)小團用5ml冷的0.2M乙酸鈉(pH5.2)洗滌2次,然后用TE-蔗糖緩沖液(20%蔗糖10mM Tris,1mM EDTA,pH7.0)和40ìl溶變菌素懸浮。此混合物在37℃下轉(zhuǎn)動培養(yǎng)2小時,然后4500rpm離心5分鐘。上清中含有蛋白酶抑制劑,即100mM苯甲基磺酰氯(PMSF)。如同Laemmli,U.K.,“T4噬菌體頭部組裝期間結(jié)構(gòu)蛋白的切割”,自然(Nature)227680-685(1970)所描述的一樣,進行電泳和Western印跡。用于在Western印跡和菌落印跡上檢測SCP蛋白的初次應(yīng)答抗血清,通過給兔免疫被純化的重組SCP蛋白來制備。這種結(jié)合,利用抗兔抗體堿性磷酸酶接合物來檢測。
C5a肽酶活性利用PMN粘附試驗來測量。參閱Booth,S.A.等,“氨苯砜抑制整合素-介導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞粘附功能”,皮膚病學(xué)研究雜志(J.Invest Dermatol.)98135-140(1992)。將C5a(Sigma,St.Louis,MO)和鏈球菌提取物或純化的酶溫育后,殘留的C5a能夠激活PMNs使其變得粘附到BSA包被的小孔上。第一,微量滴定板小孔用含有0.5%BSA的PBS包被,并在37℃下溫育1小時。人的PMNs通過在Ficoll Hypaque(Sigma,St.Louis,MO)上面離心來分離。40μl完好無損的鏈球菌或蛋白提取物與20μl濃度為5μM C5a、1%葡萄糖和0.1%CaCl的340μPBS在37℃下溫育45分鐘。用PBS洗滌被BSA包被的孔,并將懸浮好的PMNs和殘留的C5a加入各孔。在37℃和7%CO2下將此混合物溫育45分鐘。最后,洗滌各孔去除不粘附的PMNs。粘附的PMNs用結(jié)晶紫染色,并在ELISA讀數(shù)器上讀取OD570nm。光密度與殘留C5a的量成比例,或相反地與SCP活性的量成比例。
利用SCPA特異的血清進行Westen印跡來分析來源于親本及突變體培養(yǎng)物細(xì)胞表面蛋白的變?nèi)芫靥崛∥铩WC明突變體缺乏SCPA。突變體AK1.4和MJ3-15的提取物不與抗-SCPA血清反應(yīng)。在來自野生型菌株CS101和UAB2000的提取物中沒有觀察到預(yù)期大小的SCPA蛋白。通過比較突變體菌株AK1.4和MJ3-15破壞rhC5a的能力,證明它們不能產(chǎn)生C5a肽酶活性。將被分離的PMNs暴露于rhC5a,誘導(dǎo)它們使其變得粘附被BSA包被的微量滴定板。與鏈球菌或被純化的SCPA溫育,特異地切割rhC5a,并改變其活化PMNs的潛力。應(yīng)答了殘留rhC5a并結(jié)合到被BSA包被的小孔上的PMNs被染色,然后用分光光度法測量。rhC5a與親本培養(yǎng)物UAB200和CS101溫育,破壞了rhC5a,這分別使PMNs粘附被抑制了58.8%和54.5%。與SCPA突變體相反,AK1.4和MJ3-15,不改變rhC5a或PMNs對BSA包被孔的粘附(表1)。這個試驗證明了Western印跡,并顯示SCPA-培養(yǎng)物缺乏其它可能降解rhC5a的蛋白酶。
表1.野生型及突變體菌株的吞噬試驗和PMN粘附試驗
*抑制百分?jǐn)?shù)=1[(C5a單獨活化的PMN的OD570nm一預(yù)先與細(xì)菌溫育過的C5a活化的PMN的OD570nm)/C5a單獨活化的PMN的OD570nm]×100%。
雖然并不預(yù)期M蛋白表達會受scpA突變的影響,但仍然進行試驗以評估SCPA的突變體鏈球菌是否仍然表達M蛋白并具有抗吞噬作用的能力。在3小時溫育期間,鏈球菌在新鮮的人血液中的生長,表明了其表面具有抗吞噬作用的M蛋白。參閱R.C.Lancefield,“具有共同的R抗原的A群鏈球菌分化成三種血清型,與殺菌試驗特別有關(guān)”,實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.),106,525-685頁(1957)。正如所期望的一樣,親本鏈球菌UAB200和CS101分別增加了40和49倍(表1)。M+SCPA-培養(yǎng)物,菌株AK1.4和MJ3-15,分別增加了37.5和14倍,這證明scpA突變對于M蛋白表達或?qū)τ谠谌巳袑ν淌傻牡挚棺饔脦缀鯖]有影響。兩個突變體在血液中轉(zhuǎn)動培養(yǎng)生長稍微變壞,這是可重現(xiàn)的,也是沒有預(yù)料到的。突變體和親本培養(yǎng)物在人血漿中的生長速率沒有差別。可能是SCPA的失活使得C5a在轉(zhuǎn)動的血液中積聚,而這依次又活化了PMNs?;罨腜MNs的吞噬能力更強,并更能殺死M+鏈球菌。當(dāng)利用抗-M49和抗-M6抗血清進行Western印跡對其進行分析時,表面蛋白提取物含有M6和M49抗原,這證明了SCPA突變不改變M蛋白的表達。
實施例2SCP延遲吞噬細(xì)胞的募集以及鏈球菌從皮下感染部位的清除為了核實SCP能使C5a失活,如上面實施例1中所述的方法,構(gòu)建scpA49的插入和缺失突變體。當(dāng)插入或缺失被導(dǎo)入scpA49時,突變體SCP不能破壞C5a-活化的PMNs對微量滴定板的粘附。
使用一種動物模型測試scpA49的突變對毒性的影響,在這里鏈球菌仍然位于局部,而且炎癥細(xì)胞的流入也能進行分析。為了試驗這個假設(shè),即SCP很早就發(fā)揮功能從而妨礙此生物體的清除,比較了接種結(jié)締組織氣囊之后剛好4小時的時候SCP+和SCP-鏈球菌的命運。而且還確定了在短暫的感染期間直后鏈球菌向淋巴結(jié)和脾的擴散。
從Charles River Breeding Laboratory,Wilmington,MA獲取的CD1雄性遠交系小鼠用于全部試驗。用25-標(biāo)準(zhǔn)尺寸的針頭在小鼠背部注射0.9ml空氣和0.1ml用PBS稀釋的A群鏈球菌,產(chǎn)生一個結(jié)締組織氣囊。在一些試驗中,SCP+CS101∷pG+host5被用做陽性對照。在其它試驗中菌株CS101sm被用做陽性對照。感染后4小時,用斷頸法無痛地處死小鼠。在被指出的地方,從動物切取所有四個腹股溝淋巴結(jié)、脾和氣囊,在PBS中勻漿。在含有1μg/ml紅霉素或200μg/ml鏈霉素的血瓊脂平板上分析了組織懸液的活細(xì)胞克隆形成單位(CFU)。
在一項預(yù)備試驗中,將氣囊固定在載玻片上,用賴特染劑(Wright’sstain)染色,并進行顯微鏡檢查。雖然用本方法來計數(shù)粒細(xì)胞是不可靠的,但是在被固定的組織中,殘留的SCP-鏈球菌似乎顯著地小于野生型鏈球菌。為了測量這個差異,進行了附加試驗。在PBS中研磨氣囊,并使其通過單絲網(wǎng)(TETKO Co.New York),來制備分散的氣囊細(xì)胞群。
300×g離心5分鐘使細(xì)胞形成小團,用FACS緩沖液(Hank’s平衡鹽溶液,無酚紅,0.1%NaN3,1.0%BSA第V組分)重新懸浮為5×106/ml。細(xì)胞(1.0×106)直接用1μgFITC抗-小鼠Mac-I染色,或者間接地用1μg連接有抗-小鼠Gr-1的生物素,然后又用1μg用熒光素或FITC標(biāo)記的鏈親和素染色。單克隆抗體,Mac-I和Gr-I,獲自Pharmingen,Inc.CA.。將被標(biāo)記的細(xì)胞固定在1.0%多聚甲醛中。使用FAC-SCAN流式細(xì)胞計數(shù)器和Consort32軟件(Becton Dickinson)生成熒光曲線。用FicollHypaque密度梯度離心從全血中純化小鼠PMNs,并以此作為標(biāo)準(zhǔn)來確定混合(細(xì)胞)群中的PMNs。為了測量被特異性標(biāo)記的細(xì)胞,測定了每一種抗體標(biāo)記的平均熒光,并且設(shè)定好閘門從而強烈地反映被標(biāo)記的細(xì)胞。對照,包括了沒有被標(biāo)記的細(xì)胞,以及僅對鏈親和素FITC暴露過的細(xì)胞。
下面進行了兩個試驗。第一個比較了scpA49插入突變體M16和SCP+親本培養(yǎng)物,菌株CS 101。第二個比較了scpA49缺失突變體MJ3-15及其親本,菌株CS101sm。在兩個試驗中(表2),被勻漿的接種了SCP-鏈球菌的小鼠氣囊在4小時后都比接種了野生型鏈球菌的氣囊含有更少數(shù)量的鏈球菌。第一個試驗顯示出兩倍的降低,而第二個試驗顯示四倍的降低。利用非成對t檢驗,分別在P<0.05 and P<0.001的水平上,這些差異是在統(tǒng)計上是顯著的。還觀察到在8只小鼠中7只小鼠及8只小鼠中6只小鼠的脾臟勻漿中發(fā)現(xiàn)野生型SCP+鏈球菌;但是,SCP-突變體卻很少在脾中發(fā)現(xiàn)。反之對淋巴結(jié)勻漿亦正確。用SCP鏈球菌感染的16只小鼠中有10只小鼠的淋巴結(jié)有鏈球菌定居;但是用野生型鏈球菌感染的16只小鼠中僅有4只小鼠的淋巴結(jié)含有活的鏈球菌。利用Fisher′s exact test證明,這個差異在P<0.05的水平上具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。
表2在氣囊感染4小時之后SCP+和SCP-鏈球菌的分布
a每一之小鼠接種3×108CFU的固相鏈球菌。
b對于每一個試驗,依據(jù)Fisher′s exact test,從脾分離SCP+鏈球菌的頻率的差異相對于SCP-鏈球菌是統(tǒng)計學(xué)顯著的(P<0.05)的。
c依據(jù)unpaired t test,對于每一個試驗,菌株CS101pG(SCP+)及M16(SCP-)及MJ3-15(SCP-)(P<0.05),從勻漿的氣囊(平均值±SEMs)分離的CFU的差異是顯著的。
鏈球菌更快地從氣囊清除引起更強的PMNs募集。所有的細(xì)胞群,Mac-1陽性顆粒細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)(Springer,G.等,“Mac-1利用單克隆抗體鑒定的巨噬細(xì)胞分化抗原”,歐洲免疫學(xué)雜志(Eur J.Immunol.)930 1-306(1979)),及Gr-I陽性多形核嗜中性粒細(xì)胞(PMN)的百分?jǐn)?shù)(通過單色FACS分析,比較了氣囊中“多形核嗜中性粒細(xì)胞殺傷真菌的免疫活化體外測定小鼠細(xì)胞和芽生菌體的研究”,Brummer,F(xiàn).等,白細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.Leuko.Bio.)36505-520(1984))。Clark,J.M.,“一種新的定量小鼠細(xì)胞免疫的方法”,網(wǎng)狀內(nèi)皮組織協(xié)會雜志(J.Reticuloendothel.Soc.)25255-267(1979)。簡單地說,在FACS分析中懸液中的單細(xì)胞被特異性熒光單克隆抗體標(biāo)記。部分被標(biāo)記的細(xì)胞被注射到基于特有的熒光計數(shù)細(xì)胞的FAC-Scan流式細(xì)胞計數(shù)器或流式細(xì)胞分選儀上。
感染了SCP-缺失突變體的氣囊含有兩倍于接種了SCP+鏈球菌的氣囊炎性細(xì)胞(圖4)。接種量增加一百倍沒有改變這種差異。用1×106SCP-細(xì)胞,菌株MJ3-15,感染的氣囊含有的Gr-1陽性細(xì)胞的比接種SCP+培養(yǎng)的氣囊的三倍還多。在用SCP+鏈球菌接種的氣囊中,約6%的細(xì)胞是PMNs,而21%的細(xì)胞是其它種類的Mac-1粒細(xì)胞,包括PMNs。相反地,用SCP-鏈球菌接種的氣囊主要含有PMNs。Gr-1陽性細(xì)胞的數(shù)量等于或大于Mac-1陽性細(xì)胞的數(shù)量。設(shè)定流式細(xì)胞計數(shù)器的閥門,從而僅測量高度染色的粒細(xì)胞。其余沒被任何抗體染色的70-80%的細(xì)胞可能要么是低度染色的粒細(xì)胞、紅細(xì)胞,要么是淋巴細(xì)胞。在賴特氏染色的氣囊的制備物中,用顯微鏡觀察了大量的淋巴細(xì)胞。
從脾臟勻漿出現(xiàn)的鏈球菌SCP+克隆被高度包裹,且與水滴相似。相反地,從淋巴結(jié)產(chǎn)生的少數(shù)SCP-菌落,更象接種物。它們是非粘液樣或中等粘液樣克隆。這些數(shù)據(jù)暗示在感染后4小時內(nèi),M+SCP+的被包膜的鏈球菌能夠適應(yīng)、繁殖和侵入血流。突變體和野生型鏈球菌的不同運輸情況,可能是因為在對SCP-細(xì)菌的應(yīng)答中有更強有力的吞噬細(xì)胞流入。巨噬細(xì)胞和/或皮膚樹突狀細(xì)胞可能更快地吞入SCP-鏈球菌并將它們遞送到淋巴結(jié)。突變體鏈球菌相對于野生型鏈球菌減少,這是一個意外的發(fā)現(xiàn),因為SCP-鏈球菌是M+的、并能在體外抵抗人嗜中性粒細(xì)胞的吞噬。
實施例3SCP是小鼠鼻咽集群所必需的給小鼠鼻內(nèi)接種,從而評價野生型(SCP+)和SCP-鏈球菌集群鼻咽的相對能力。鏈霉素抗性的M49菌株CS101和缺失突變體MJ3-15被用于這些試驗。為了避免可能對小鼠有毒性,培養(yǎng)物不用小鼠來檢查通過,而且變異體的選擇不再依賴M蛋白和/或在動物體中持留的SCP。
攻擊鏈球菌菌株(1×108-9×108CFU)的16小時培養(yǎng)物,在含有20%正常兔血清中培養(yǎng),并用10μlPBS重新懸浮,用其給25g雌性CD1(Charles River Breeding Laboratories,Inc.,Wilmington,M.A.)或Balb/c小鼠(Sasco,Omaha NE)鼻內(nèi)給藥。通過在血瓊脂平板上對培養(yǎng)物的稀釋進行鋪平板,來測定活菌計數(shù)。接種后每天從被麻醉的小鼠采集喉拭子,采集6到10天,并在含有200ug/ml鏈霉素的血瓊脂平板上劃線。37℃溫育過夜后,計數(shù)平板上β-溶血性克隆的數(shù)量。所有的攻擊菌株都用鏈霉素抗性標(biāo)記以與可能持留于正常菌群的β-溶血性鏈球菌相區(qū)分。在含有鏈霉素的血瓊脂平板上培養(yǎng)喉拭子。出現(xiàn)一個β-溶血性克隆即被定為陽性培養(yǎng)物。
給CD1遠交系小鼠鼻內(nèi)接種2×108固相CFU。每日從被麻醉的小鼠的鼻咽取拭子,連續(xù)取8-10天,并在含有鏈霉素的平板上劃線。SCP+和SCP-之間的差異在第一天是明顯的,然而,統(tǒng)計上顯著的差異直到第3和4天才觀察到(圖5)。到第4天9/18的用M+SCP+鏈球菌感染的小鼠產(chǎn)生陽性的喉培養(yǎng)物,盡管用M+SCP+菌株感染的小鼠僅有2/18在其咽喉保留鏈球菌。18只小鼠中有4只死于SCP+鏈球菌感染。沒有小鼠在感染SCP-細(xì)菌后死于感染。血瓊脂平板上克隆的數(shù)量也是與SCP-鏈球菌被更快地清除相一致的。例如,在第3天有7只小鼠的培養(yǎng)含有>100SCP+CFU,盡管只有1只接種了SCP-鏈球菌的小鼠含有100CFU。
因為M49鏈球菌更常與皮膚感染相關(guān),所以用一種M6菌株,一種更常與咽喉感染相關(guān)的血清型,重復(fù)上面的試驗。利用M6菌株UAB200以及先前在實施例1中所述的策略,構(gòu)建一種插入突變體,菌株AK1.4。菌株AK1.4也比野生型M6菌株培養(yǎng)被更快地從鼻咽部清除(圖6)。以上的試驗證明,A群鏈球菌依賴于SCP在小鼠鼻咽中持留。以上試驗中使用的全部SCP-變異體都是M+的,也就是說,它們能抵抗人的新鮮血液的吞噬作用。然而,它們被從鼻咽粘膜清除。
實施例4用純化的重組SCPA49給小鼠鼻內(nèi)免疫阻斷鼻內(nèi)攻擊后的集群a)編碼Thr63到His1031的重組疫苗ΔSCPA49的構(gòu)建(圖2和圖7)。從CS101M49A群鏈球菌(ΔSCPA49)克隆了一個對應(yīng)于截短形式的scpA49基因的PCR片段。利用一個開始于1033位核苷酸的正向引物和一個開始于3941位核苷酸的反向引物擴增此片段(編號對應(yīng)于Chen,C.,和Cleary,P.,“釀膿鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),2653161-3167(1990)中的編號)。將此片段連接到Pharmacia Inc.的pGex-4T-1高表達載體上谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因的凝血酶結(jié)合位點。此質(zhì)粒含有重組的scpA片段,被命名為pJC6,已經(jīng)依據(jù)布達佩斯條約(Budapest Treaty)的規(guī)定在美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection,Rockville,MD)保藏,并且指定了ATCC登記號為98225。
利用一個含有BamHI識別序列(5′-CCCCCCGGATCCACCAAAACCCCACAAACTC-3′)(第8號序列)的scpA49正向引物和一個scpA49反向引物(5′-GAGTGGCCCTCCAATAGC-3′)(第9號序列),擴增ΔSCPA49,即scpA49的一個2908bp長的片段。從所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物中刪除了編碼SCPA蛋白信號肽和膜鉚定區(qū)的序列。PCR產(chǎn)物用BamHI消化,并連接到Pharmacia Inc.(Piscataway,NJ)的pGEX-4T-1高效表達載體中谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因的凝血酶識別位點上BamHI和SmaI限制酶切位點處。重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)化進E.coli.DH5α。在谷胱苷肽Sepharose 4B柱上通過親合層析純化了一個轉(zhuǎn)化體E.coli.(pJC6)的ΔSCPA49融合蛋白。表達來自一個E.coli克隆的轉(zhuǎn)移酶-SCP融合蛋白,并在谷胱苷肽Sepharose 4b柱上進行親合層析將其純化。全部方法均由生產(chǎn)商描述(Pharmacia)。通過凝血酶消化從此雜合蛋白中切除ΔSCPA49。凝血酶通過在苯脒Sepharose 6B柱(Pharrnacia)上層析而從被洗脫的SCP中去除。用凝血酶消化以后,在苯脒Sepharose 6B柱(Pharrnacia)上層析,從而去除凝血酶。表達和純化的方法由生產(chǎn)商描述。利用SDS-PAGE和Western印跡證明,親合純化的蛋白是純的。利用PMN粘附試驗(如上在實施例1中所述)測試時發(fā)現(xiàn),親合純化的截短的ΔSCPA49蛋白缺乏肽酶活性。在兔中制備針對純化的ΔSCPA49的超免疫抗血清。
b)免疫和攻擊方案。給四周齡遠交系CD1雌性小鼠的每一個鼻孔給藥20μg親合純化的溶于10μlPBS的ΔSCPA49而對其進行免疫。小鼠在交替的日子中被免疫3次,并在第3次免疫后三周之內(nèi)再次加強免疫。在休息兩周后,小鼠被再次加強免疫。參閱D.Bessen等,“用對應(yīng)于M蛋白保守表位的合成肽鼻內(nèi)免疫對A群鏈球菌粘膜集群的影響”,傳染與免疫(Infect.Immun.),56,2666-2672頁(1988)。對照小鼠僅接受PBS。感染之前,通過酶聯(lián)免疫試驗(ELISA)測定所有用ΔSCPA49蛋白免疫的小鼠,發(fā)現(xiàn)在其血清和唾液中有高滴度的抗ΔSCPA49蛋白的抗體。A群鏈球菌,菌株CS101(2.0×108CFU),CS210(3.6×108CFU),CS463(7.8×108CFU),90-131(3.4×108CFU),及UAB200(9.6×108CFU)被用來在最后一次疫苗激發(fā)劑之后7天攻擊小鼠。依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)的指導(dǎo)方針進行動物研究。
c)樣品采集及ELISA。從免疫后被麻醉的動物采集血液和唾液樣品。如前所述,所有的血清都通過ELISA測試SCPA49抗體的存在。參閱S.P.O′Connor等,“人對鏈球菌C5a肽酶的抗體應(yīng)答”,傳染病雜志(J.Infect.Dis.),161,109-116頁(1990)。通過加入500ng溶于0.05M碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)的SCPA49蛋白,使純化的SCPA49蛋白結(jié)合到微量滴定板的小孔上。在4℃下溫育過夜之后洗滌各孔,然后用溶于PBS的0.5%BSA封閉各孔1小時。通過皮下注射100μl0.1%匹魯卡品(Sigma)溶液刺激唾液分泌。采集唾液樣本,并Eppendorf小型離心機在14,000rpm自旋5分鐘。通過ELISA測試上清抗ΔSCPA49的分泌型IgA的存在。ELISA滴度代表OD405≥0.1的單個血清和唾液的最高稀釋度。
d)對于ΔSCPA49的抗體應(yīng)答的評價。本發(fā)明用純化的ΔSCPA49免疫兔對ΔSCPA49亞基疫苗的免疫原性進行了評價。通過ELISA測定,發(fā)現(xiàn)兔產(chǎn)生了高水平的抗ΔSCPA49蛋白抗體。雖然純化的ΔSCPA49免疫原缺乏有功能的活性,兔超免疫抗血清能夠體外中和純化的野生型SCPA49酶的肽酶活性。而且,沒有稀釋的兔抗ΔSCPA49蛋白抗血清能夠中和與不同血清型相關(guān)的C5a肽酶活性(圖8)。與完整的M1、M6和M12鏈球菌相關(guān)C5a肽酶活性被此抗血清抑制,這證明抗ΔSCPA49蛋白的抗體缺乏血清特異性。
同樣,從10只免疫小鼠和10只對照小鼠采集血清和唾液樣本,從而評價ΔSCPA49蛋白經(jīng)過鼻內(nèi)途徑不加佐劑給藥時其免疫原性。與用PBS免疫的對照小鼠(圖9)做比較,用純化的ΔSCPA49蛋白免疫的小鼠在其血清中產(chǎn)生了高滴度的ΔSCPA49特異性IgG。針對ΔSCPA49的血清IgG滴度范圍在1∶10,240到1∶20,480。相反地,在血清中沒能檢測到對照小鼠的ΔSCPA49特異的IgG。用純化的ΔSCPA49蛋白免疫的小鼠,相對于對照小鼠,也顯示出ΔSCPA49特異性唾液sIgA的顯著增加。在被免疫過的小鼠的唾液中,特異性sIgA滴度大于1∶16。相反地,在對照小鼠的唾液中,不能檢測到針對ΔSCPA49的sIgA。在分別稀釋1/2560的血清和稀釋1/2的唾液中,IgG和IgA的相對濃度顯示于圖9。這些結(jié)果證明,純化的ΔSCPA49蛋白鼻內(nèi)給藥時是一種有效誘導(dǎo)小鼠特異性全身及分泌型抗體應(yīng)答的免疫原。
e)疫苗ΔSCPA49對于鏈球菌從被感染的小鼠中清除的影響。進行試驗從而確定用C5a肽酶免疫是否會增強鏈球菌從鼻咽清除。含有高水平的抗-SCPA抗體的兔和人超免疫血清都能體外中和SCPA活性。S.P.O′Connor等,“人對鏈球菌C5a肽酶的抗體應(yīng)答”,傳染病雜志(J.Infect.Dis.),161,109-116頁(1990)。SCPA能顯著地幫助口腔粘膜集群的事實暗示,用純化的ΔSCPA49給小鼠免疫能減少鏈球菌在鼻咽colonize的能力。用親合純化的遺傳上被滅活的SCPA免疫小鼠,從而測試這種可能性。截短的蛋白,ΔSCPA49,不加佐劑或載體地鼻內(nèi)給藥。用野生型M+SCPA+鏈球菌接種過的小鼠的咽部集群,與那些使用以純化的ΔSCPA49蛋白的兩種不同制劑接種過的小鼠進行的三個獨立試驗中用PBS免疫過的那些結(jié)果顯著不同(表3及表4;圖10)。接種10天后,13只用ΔSCPA49蛋白免疫過的小鼠中僅有一只是鏈球菌培養(yǎng)陽性的(表4;圖10)。相反地,未接種的對照的30-58%保持培養(yǎng)陽性6天,并且有一些在感染7天后仍然是陽性的。血瓊脂平板上-溶血性、鏈霉素抗性克隆的數(shù)量,也說明了用ΔSCPA49接種的小鼠和對照之間的顯著差異。不同組中被免疫的小鼠從其鼻咽清除血清型M49鏈球菌比未免疫的對照顯著地更快。
表3.用PBS或在E.coliDH5α中表達的SCP鼻內(nèi)接種小鼠,鼻內(nèi)攻擊以后咽喉的鏈球菌培養(yǎng)(接種以后的CFU)
表4.用PBS或在E.coliDH5α中表達的SCP鼻內(nèi)接種小鼠,鼻內(nèi)攻擊以后咽喉的鏈球菌培養(yǎng)(接種以后的CFU)
*小鼠接種兩次,因為第一次接種時細(xì)菌的劑量太低。
最后,檢查了一種血清型的SCP是否會免疫動物抗其它血清型的感染。有超過80種不同的血清型的A群鏈球菌。一種有效的疫苗應(yīng)該預(yù)防不止一種鏈球菌血清型的感染。利用鏈球菌OF+血清型M2和M11與OF-血清型M1和M6,產(chǎn)生抗集群的交叉保護。針對血清型M49鏈球菌的ΔSCPA49蛋白的兔血清,中和與數(shù)種血清型相關(guān)的肽酶活性,這個事實暗示,用單個亞基疫苗免疫可能減少或消除那些血清型的集群。為了探究這種可能性,如上所述,通過用親合純化的ΔSCPA49蛋白鼻內(nèi)接種免疫分成四組的20只小鼠。對照小鼠接受PBS。在用鏈球菌攻擊以前,分析從隨機選擇的免疫及對照小鼠中采集的血清及唾液樣品的抗-SCPA抗體。所有受試的被免疫小鼠,都產(chǎn)生了強烈的血清抗體應(yīng)答以及可以測量的唾液抗體應(yīng)答。用ΔSCPA49蛋白免疫過的小鼠的全部4種血清型的菌株的咽部集群,相對于未免疫的對照得到了降低。接種后第3天和第5天差異最顯著(表5)。
表5.免疫保護性是血清型非依賴型的
+指培養(yǎng)陽性小鼠。
*在免疫或未免疫的小鼠之間的差異在統(tǒng)計上是顯著的(P<0.05).P值通過X2分析來計算在用血清型M2、M11和M1菌株接種的免疫及對照小鼠之間,觀察到統(tǒng)計上顯著的差異。然而,OF+血清型M2和M11更有效地被免疫過的小鼠清除,而不是OF-菌株M1和M6更有效地被免疫過的小鼠清除。被免疫過的小鼠的M1鏈球菌的集群,相對于對照被顯著的降低了。僅有10.5%的被免疫過的小鼠到感染后第5天是培養(yǎng)陽性的。相反地,37%的對照是此種菌株培養(yǎng)陽性的。雖然被免疫過的小鼠似乎更快地清除M6鏈球菌,但是這種差異在統(tǒng)計上是不顯著的。正如以前試驗中一樣,從被接種的小鼠采集的樣品的血瓊脂平板-溶血性鏈球菌克隆的數(shù)量顯著地少于從對照動物采集的樣品的血瓊脂平板-溶血性鏈球菌克隆的數(shù)量。因此,ΔSCPA49蛋白是一種提供抗其它鏈球菌血清型交叉保護的有效疫苗。
實施例5SCPA49的定點突變A群鏈球菌血清型能分為兩個大類,OF+和OF-菌株。后者更常與風(fēng)濕熱及中毒性休克相關(guān),而OF+菌株是膿皰病及急性腎小球性腎炎常見的一種原因。雖然各類SCPA蛋白有95-98%相同,但是對其免疫應(yīng)答可能稍微不同。這種擔(dān)憂促使了平行開發(fā)M1 OF-菌株及M49 OF+菌株的已經(jīng)被確定的變異體SCPAs的努力。使用預(yù)期將使此酶滅活的那些氨基酸,替換催化活性所必需的氨基酸(圖1)。SCPA49的N和C-末端氨基酸邊界,被表達的pGEX-4T-1亞克隆,分別是Asn32和His1139(圖1和8)。SCPA49蛋白的Ser512(SCPA49S512A)、Asn295(SCPA49N295A)及Asp130(SCPA49D130A)被Ala取代,而Asn295(SCPA49N295R)被Arg取代(Deborah Stafslien,Ms.Thesis,University of Minnesota)。
用來將突變導(dǎo)入鏈球菌菌株CS101 scpA49基因的方法,是定點突變“巨型引物(megaprimer)”方法。Bank,S.,“巨型引物PCR體外定點突變”,見分子生物學(xué)方法57卷體外突變程序(Methods in MolecularBiology,Vol.57In Vitro Mutagenesis Protocols),Humana Press,Inc.Totowa,NJ(1996)。使用引物scpFor940(5′-CCCCCCGGATCCAATACTGTGACAGAAGACACTCC-3′),第10號序列,和scpmutrev1883(5′-TTTCTGGAACTAGTATGTCTGCGCC-3′,第11號序列號,擴增一段1450bp雙鏈PCR產(chǎn)物,引進絲氨酸突變。第一個PCR產(chǎn)物,即一個“巨型引物”,使用Qiagen Qiaquick Gel Extraction Kit進行純化,然后用于第二個不對稱PCR反應(yīng)以擴增含有預(yù)期突變的3.3kb scpA49基因。進行5個循環(huán)的變性(93℃,1分鐘)后延長(72℃,5分鐘),加入反向引物scpRev4263,(3′-CCCCCCCTCGAGATGTAAACGATTTGTATCCTTGTCATTAG-3′)第12號序列。72℃下第5次循環(huán)期間,以1mM的濃度加入反向引物。通過25次循環(huán)(94℃1分鐘,58℃2分鐘,72℃2-3.5分鐘)擴增。除了沒加正向引物以及巨型引物以每100μl反應(yīng)4-6μg的濃度加入以外,反應(yīng)物濃度與以前的部分所描述的一樣。此方法產(chǎn)生變異蛋白SCPA49S512A(見下表6)。
用與上述幾乎相同的方式構(gòu)建天冬氨酸和天冬酰胺變異體,分別使用反向引物scpnzutrev717(5′-CAGTGATTGATGCTGGTTTTGATAA-3′),第13號序列號及scpnzutrev1214(5′-AGCTACTATCAGCACCAG-3′),第14號序列號,構(gòu)建311bp和805bp巨型引物。引物scpmnutrev717被用來產(chǎn)生突變蛋白SCPA49D130A,而引物scpmutrev1214被用來產(chǎn)生突變蛋白SCPA49N295A(見下表6)。然而,在Qiaquick純化之后,用0.1U綠豆核酸酶(每4μgDNA)處理巨型引物,并在30℃溫育10分鐘。利用酚/氯仿提取除去核酸酶,利用乙醇沉淀從水相中回收巨型引物。將小團重新懸浮于80μl無菌雙蒸水,并將其中37μl用于每100μl不對稱PCP反應(yīng)。隨后按前所述,將突變的基因克隆到pGEX4T-1中。使用35S-標(biāo)記的dATP及測序酶試劑盒(Sepuenase kit),或者使用自動熒光測序法(automated fluorescent sequencig)在明尼蘇達大學(xué)微化學(xué)中心(University of Minnesota Microchemical Facility)進行突變體測序。
表6突變蛋白的氨基酸序列比較127132 291 297 508514 876883Wild-typeSCPA49AVIDAGTSAGNDSLSGTSGTSTLGSRFSCP S512A49AVIDAGTSAGNDSLSGTAGTSTLGSRFSCP D130A49AVIAAGTSAGNDSLSGTSGTSTLGSRFSCP N295A49AVIDAGTSAGADSLSGTSGTSTLGSRF這項工作以前是利用E.coli表達載體pGEX 4T-1過度表達作為GST融合蛋白的突變體SCPA。根據(jù)GST基因融合系統(tǒng)手冊(GST GeneFusion System Handbook)(Pharmacia)中提供的標(biāo)準(zhǔn)程序純化重組的SCPA。如上所述,SCPA蛋白抗原通過親合層析方法被純化。
實施例6SCPA1及SCPB突變體的構(gòu)建利用PCR按以下的方式從釀膿鏈球菌(菌株90-226)的M1的血清型擴增野生型scpA1基因。設(shè)計引物,使得完整基因僅有一個片段被表達。此片段對應(yīng)于成熟蛋白的起點并恰好在細(xì)胞壁結(jié)合結(jié)構(gòu)域殘基Asn32到Asp1038之前終止(圖2)。正向引物5′-CCCCCCGAATTCTTACTGTGACAGAAGACACTCCTGC-3′(第15號序列)退火開始于第940號堿基(編號對應(yīng)于Chen,C.,和Cleary,P.,“釀膿鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),2653161-3167(1990)的編號)。相反的,反向PCR引物,5′-CCCCCCGGATTCTTATTGTTCTGGTTTATTAGA GTGGCC-3′(第16號序列)恰好在DNA重復(fù)區(qū)域上游第3954號堿基處退火。預(yù)測此蛋白的這個重復(fù)區(qū)域是通過細(xì)胞壁肽聚糖、并在此后附著到細(xì)胞壁肽聚糖的部分。各引物的斜體區(qū)域是已經(jīng)加到釀膿鏈球菌序列上從而使克隆過程得以進行的附加序列。正向引物的下劃線區(qū)域摻入一個EcoRI限制性酶切位點,而反向引物的下劃線區(qū)域摻入一個BamHI限制性酶切位點。反向引物還在基因的閱讀框中摻入一個終止翻譯的終止密碼子(TAA)。
所產(chǎn)生的對應(yīng)于堿基940-3954的PCR產(chǎn)物被克隆進一個中間載體pCR2.1中(Invitrogen,Inc.),并被轉(zhuǎn)化進E.coli Top10F細(xì)胞內(nèi)(Invitrogen,Inc.)。用EcoRI和BamHI對一個合適轉(zhuǎn)化體的質(zhì)粒DNA進行限制性酶切割。含有scpA1的片段的3018堿基長片段依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序進行凝膠純化,并連接到用同樣的酶進行限制性酶切的表達載體pTrc99a(Pharmacia)上。連接產(chǎn)物被轉(zhuǎn)化進E.coli.DH5á細(xì)胞,并選擇含有預(yù)期質(zhì)粒構(gòu)建的轉(zhuǎn)化體。所產(chǎn)生的質(zhì)粒中scpA1的PCR片段被置于Shine-Dalgamo序列及ATG啟始密碼子之后,并處于可被別乳糖類似物IPTG誘導(dǎo)的trc啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。
依據(jù)C.L.Fisher和G.K.Pei,“基于PCR的定點突變方法的修改”,生物技術(shù)(BioTechniques),23570-574(1997)所描述的程序,構(gòu)建野生型scpA1的定點遺傳突變體。通過與枯草桿菌蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶家族的序列比較,預(yù)測了SCPA1內(nèi)對于蛋白酶活性起重要作用的合適的氨基酸殘基。Siezen,R.J.,等,“枯草桿菌酶(subtilases),枯草桿菌蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶家族的同源性模擬及蛋白質(zhì)工程策略”,蛋白質(zhì)工程(Protein Engineering),4719-737(1991);Chen,C.,和Cleary,P.,“釀膿鏈球菌的鏈球菌C5a肽酶基因的完整核苷酸序列”,生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.),2653161-3167(1990)。在此家族內(nèi)保守的三個氨基酸殘基,參與了活性位點的形成。在SCPA1中,這些對應(yīng)于Asp130、His193、和Ser512。設(shè)計了三組非重疊寡聚核苷酸用于通過PCR改變這些氨基酸殘基中每一個殘基。設(shè)計了這些寡聚核苷酸,彼此遠離地擴增DNA相反鏈。在各組引物中,引物5′端將含有編碼這些被用于突變的氨基酸中的一個氨基酸的密碼子,此密碼子將被改變,從而使其編碼一個丙氨酸。這三組引物列舉如下;斜體部分是被改變的密碼子。
D130A正向引物(第17號序列)5′-ATT GCTGCT GGT TTT GAT AAA AAT CAT GAA GCG-3′GAT密碼子變?yōu)镚CT,對應(yīng)的天冬氨酸變?yōu)楸彼帷?br>
反向引物(第18號序列號)5′-CACTGCAACAACAGTCCC-3′H193A正向引物(第9號序列)5′-GAGGCCGGCACACACGTG-3′CAC密碼子變?yōu)镚CC,對應(yīng)的組氨酸變?yōu)楸彼帷?br>
反向引物(第20號序列)5′-TTG ATC GAC AGC GGT TTF ACC-3′S512A正向引物(第21號序列1)5′- ACT GCT ATG TCT GCT CCA TTA G-3′ACT密碼子變成GCT,對應(yīng)的絲氨酸變?yōu)楸彼帷?br>
反向引物(第22號序列)5′-TCC AGA AAG TTT GGC ATA CTT GTT GTT AGC C將這些PCR引物組用于三個獨立反應(yīng)模板DNA是pLP6O5,含有野生型scpA1序列。PCR產(chǎn)物隨后自身連接并轉(zhuǎn)化進E.coli.Top10F(Invitrogen,Inc.)。篩選具有合適大小和限制性模式的轉(zhuǎn)化體。S512A突變體的序列變化破壞了一個特有的SpeI限制性酶切位點,從而使此突變能直接通過限制性分析進行鑒定。所有潛在的突變體都通過DNA測序來確定。隨后,將D130A突變與S512A突變組合,利用此蛋白的這兩個區(qū)域之間特有的PstI位點形成一個雙鏈突變體。最后的變化是,通過將突變的scpA1基因移到一個先前已被改變的含有卡那霉素基因的pTRC99a載體(Pharmacia,Inc.)上,使抗生素選擇從青霉素變?yōu)榭敲顾亍?br>
使用以上所描述的制備SCPA1突變株所用的方法,構(gòu)建了一個SCPB蛋白突變體。從B群鏈球菌(IIva+型)克隆了野生型SCPB基因。
實施例7突變蛋白的分析從各突變體構(gòu)建體表達的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分析,預(yù)測此蛋白的大小是121kD。然而,此酶羧基端的富含脯氨酸的跨細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)域使此蛋白在SDS-PAGE期間的遷移稍微慢一點,所以,用SDS-PAGE確定的表觀分子量是130kD。因為有活性的SCP可能對宿主有害,所以突變蛋白缺少酶活性是很重要的。此為突變蛋白的兩種性質(zhì)。在表7中比較了利用PMN粘附試驗測定的野生型和突變體蛋白的比活。這些試驗說明,被取代的氨基酸使酶的活性降低了超過90%。
表7PMN粘附試驗測定突變型蛋白酶活性蛋白 活性(U/mg*10-3)野生型 170SCPA49D130A<20SCPA49N295A<20SCPA49S512A<20還比較了突變體蛋白與野生型蛋白結(jié)合抗野生型酶的抗體的能力。為此目的使用了競爭性ELISA試驗。競爭性ELISAs測量可溶抗原對抗體結(jié)合固定化抗原的抑制。將恒定量的野生型抗原結(jié)合到微量滴定板的小孔上。同時加入恒定量的抗體和變化量的可溶性的競爭性抗原。用抑制百分?jǐn)?shù)對抗原濃度曲線的斜率來估計可溶性抗原對抗體相對結(jié)合力。雖然不知道抗血清中抗-SCPA的準(zhǔn)確濃度因而不能計算結(jié)合常數(shù),但是對數(shù)種蛋白的相對結(jié)合力做了比較(圖11)。因為抑制百分?jǐn)?shù)對濃度曲線的斜率對于野生型和突變體蛋白是一樣的,所以得出結(jié)論氨基酸殘基取代不改變抗體結(jié)合突變體蛋白的能力。
同時也測定重組的SCPA1、SCPA49及SCPB蛋白能同樣好地結(jié)合抗-SCPA的抗體(圖12)。在此試驗中平板抗原是SCPA49,而抗體是兔抗-SCPA49。此抗體對這些抗原的親和力由這些曲線顯示是高度相似的。這些結(jié)果顯示M49OF+和M1OF-A群鏈球菌及B群鏈球菌的SCPA蛋白關(guān)于抗體識別是相同的,并且可以在一種疫苗制劑中相互交換地使用。
實施例8SCPA抗原的皮下(SQ)給藥在小鼠中誘導(dǎo)保護作用所有早期的保護研究都是通過鼻內(nèi)無佐劑地給藥親合純化的SCPA49蛋白??乖∪饧捌は伦⑸湓跉v史上是優(yōu)選的,更為人們所接受的疫苗投藥方法。因此,進行試驗測試SCPA和MPL/明礬的皮下注射是否誘導(dǎo)保護性免疫應(yīng)答,以及當(dāng)A群鏈球菌的攻擊菌株與SCPA疫苗的來源血清型不同時那種應(yīng)答是否減少集群。通過喉培養(yǎng)或通過取樣所切割鼻組織來評價被免疫的小鼠從口鼻咽粘膜清除鏈球菌的能力。代表性喉培養(yǎng)物數(shù)據(jù)列于表8。
表8小鼠皮下接種疫苗a激發(fā)細(xì)菌b克隆化百分?jǐn)?shù)c對照小鼠 SCPA-免疫小鼠SCPA49S512AOF+M49 64%(3)36%ΔSCPA49 OF+M49 64%(3)20%ΔSCPA49 OF-M1 33%(5)8%SCPA1S512A OF-M49 23%(5)8%a疫苗含有10μg與佐劑MPL及明礬混合的所示抗原。各實驗組含有13-20小鼠。對照小鼠用破傷風(fēng)類毒素與相同的佐劑混合后免疫。
b小鼠通過鼻內(nèi)接種感染。
c通過喉培養(yǎng)物評定集群。括號中的數(shù)字顯示培養(yǎng)物被采集的天數(shù)。
通過皮下注射三種不同形式的SCPA抗原中的每一種抗原而進行免疫的小鼠誘導(dǎo)了適度的保護作用。用ΔSCPA49免疫保護小鼠抗OF-M1和OF+M49菌株。SCPA49S512A SCPA1S512A被選擇用于隨后的研究。
通過一個更加定量的試驗評價了鏈球菌鼻內(nèi)攻擊后的持留。此方法包括在感染后不同時間處死小鼠,切取鼻組織(NT),隨后分析鼻組織的活鏈球菌(CFU)。在緩沖液中將標(biāo)準(zhǔn)量的NT勻漿,并通過活菌計數(shù)測定每毫克組織的CFU數(shù)量。
用SCPA49S512A、SCPA1S512A或破傷風(fēng)類毒素皮下免疫三組小鼠。所有疫苗都與以前一樣與佐劑MPL/明礬混合。小鼠接受了四次5ìg蛋白抗原的注射,接著在最后一次注射后接受兩周攻擊。用OF+M49菌株CS101攻擊后16小時收獲了鼻組織。每毫克組織的CFU幾何平均值由表9表表9每毫克鼻組織的CFU集合平均值疫苗抗原16小時a破傷風(fēng) 571bSCPA49S512A 2.27SCPA1S512A 1.60a.小鼠鼻內(nèi)感染之后獲取鼻組織的時間。
b.數(shù)值是對數(shù)值。
與鼻組織相關(guān)的鏈球菌數(shù)量正如預(yù)期的一樣隨時間下降,在用SCPA免疫的小鼠中這種下降更快也更完全。已經(jīng)用SCPA免疫過的所有組小鼠都保留了比對照組小鼠少的鏈球菌。在此試驗中用SCPA1S512A進行的免疫是非常有效的,它誘導(dǎo)了一個交叉的保護應(yīng)答,因為攻擊菌株CS101是OF+M49而疫苗蛋白SCPA1S512A的來源是OF-M1菌株。這些結(jié)果證明,一個單一的SCPA能誘導(dǎo)抗異種血清型的保護作用。保護作用由中和細(xì)菌表面的肽酶活性的抗體提供。這增加了鏈球菌在粘膜組織沉積以后的數(shù)小時內(nèi)吞噬細(xì)胞的流入。假設(shè),鏈球菌被吞噬細(xì)胞快速清除將預(yù)防細(xì)菌隨后的增殖和持留。當(dāng)用ELISA進行分析時,小鼠一律有1∶32,000或更大的IgG滴度,顯示SCPA抗原和佐劑皮下注射一貫地誘導(dǎo)強烈的抗體應(yīng)答。
實施例9B群鏈球菌的C5a肽酶在序列上幾乎與A群鏈球菌M12及M49完全相同B群鏈球菌C5a肽酶(SCPB)基因被克隆、測序,并與A群鏈球菌M12及M49比較。使用對應(yīng)于部分scpA12序列的引物,使用以上所描述的方法,通過PCR擴增完整的scpB基因。SCPB基因編碼一種3450bp的開放閱讀框(ORF),它特定編碼了一個長1150氨基酸、分子量為126,237的蛋白。SCPB的氨基酸序列如圖2所示。ScpB的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列與M12及M49A群鏈球菌之間做比較,顯示高度相似性,分別是98%和97%。ScpB含有一個50bp的缺失,此缺失與C-末端重復(fù)區(qū)域中的兩個相重疊,并且相對于scpA12基因有數(shù)個其它的小差異。這些序列的成線法比較顯示,scpA12在系統(tǒng)發(fā)育上實際上是與scpB更近,而不是和scpA49更近。三十個代表血清型III,III/R,II,Ia/c,NT/c,NT/c/R1的菌株,攜帶了一個scpB拷貝。
使用表達載體pGEX-4T-1質(zhì)粒(ATCC登記號98225)在E.coli中表達重組的SCP,并且顯示,重組的SCP與從親本B群鏈球菌菌株78-471(IIa+b型)提取的酶完全相同。Western印跡分析顯示,重組的SCP與以前從B群鏈球菌純化的C5ase酶完全相同。
這里所引用的所有公開、專利及專利文件都并入本發(fā)明一起考慮,即使有些是單獨引用的。本發(fā)明所描述的關(guān)于各種特定的和優(yōu)選的實施方案和技術(shù),應(yīng)該理解為在此基礎(chǔ)上做出許多變化和修改卻仍然不超出本發(fā)明之范圍。
序列表<110>明尼蘇達大學(xué)董事會<120>鏈球菌C5a肽酶疫苗<130>600.450WO1<150>US09/206,898<151>1998-12-07<150>US08/589,756<151>1996-01-22<160>23<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>1164<212>蛋白質(zhì)<213>釀膿鏈球菌<400>1Leu Arg Lys Lys Gln Lys Leu Pro Phe Asp Lys Leu Ala Ile Ala Leu1 5 10 15Met Ser Thr Ser Ile Leu Leu Asn Ala Gln Ser Asp Ile Lys Ala Asn20 25 30Thr Val Thr Glu Asp Thr Pro Ala Thr Glu Gln Ala Val Glu Thr Pro35 40 45Gln Pro Thr Thr Val Ser Glu Glu Val Pro Ser Ser Lys Glu Thr Lys50 55 60Thr Pro Gln Thr Pro Asp Asp Ala Glu Glu Thr Val Ala Asp Asp Ala65 70 75 80Asn Asp Leu Ala Pro Gln Ala Pro Ala Lys Thr Pro Asp Thr Ser Ala85 90 95Thr Ser Lys Ala Thr Ile Arg Asp Leu Asn Asp Pro Ser Gln Val Lys100 105 110Thr Leu Gln Glu Lys Ala Gly Lys Gly Ala Gly Thr Val Val Ala Val115 120 125
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370 375 380Lys Gly Lys Ile Ala Leu Ile Glu Arg Gly Asp Ile Asp Phe Lys Asp385 390 395 400Lys Ile Ala Asn Ala Lys Lys Ala Gly Ala Val Gly Val Leu Ile Tyr405 410 415Asp Asn Gln Asp Lys Gly Phe Pro Ile Glu Leu Pro Asn Val Asp Gln420 425 430Met Pro Ala Ala Phe Ile Ser Arg Lys Asp Gly Leu Leu Leu Lys Glu435 440 445Asn Pro Gln Lys Thr Ile Thr Phe Asn Ala Thr Pro Lys Val Leu Pro450 455 460Thr Ala Ser Gly Thr Lys Leu Ser Arg Phe Ser Ser Trp Gly Leu Thr465 470 475 480Ala Asp Gly Asn Ile Lys Pro Asp Ile Ala Ala Pro Gly Gln Asp Ile485 490 495Leu ser ser Val Ala Asn Asn Lys Tyr Ala Lys Leu Ser Gly Thr Ser500 505 510Met Ser Ala Pro Leu Val Ala Gly Ile Met Gly Leu Leu Gln Lys Gln515 520 525Tyr Glu Thr Gln Tyr Pro Asp Met Thr Pro Ser Glu Arg Leu Asp Leu530 535 540Ala Lys Lys Val Leu Met Ser Ser Ala Thr Ala Leu Tyr Asp Glu Asp545 550 555 560Glu Lys Ala Tyr Phe Ser Pro Arg Gln Gln Gly Ala Gly Ala Val Asp565 570 575Ala Lys Lys Ala Ser Ala Ala Thr Met Tyr Val Thr Asp Lys Asp Asn580 585 590Thr Ser Ser Lys Val His Leu Asn Asn Val Ser Asp Lys Phe Glu Val595 600 605Thr Val Thr Val His Asn Lys Ser Asp Lys Pro Gln Glu Leu Tyr Tyr610 615 620Gln Ala Thr Val Gln Thr Asp Lys Val Asp Gly Lys Leu Phe Ala Leu625 630 635 640Ala Pro Lys Ala Leu Tyr Glu Ala Ser Trp Gln Lys Ile Thr Ile Pro645 650 655Ala Asn Ser Ser Lys Gln Val Thr Ile Pro Ile Asp Val Ser Gln Phe660 665 670Ser Lys Asp Leu Leu Ala Pro Met Lys Asn Gly Tyr Phe Leu Glu Gly675 680 685Phe Val Arg Phe Lys Gln Asp Pro Thr Lys Glu Glu Leu Met Ser Ile
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10101015 1020Thr Lys Leu Leu Glu Gly His Ser Asn Lys Pro Glu Gln Asp Gly Ser1025103010351040Asp Gln Ala Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Glu Gln Asp Gly104510501055Ser Gly Gln Ala Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Glu Gln Asp106010651070Gly Ser Gly Gln Thr Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Glu Gln107510801085Asp Gly Ser Gly Gln Thr Pro Asp Lys Lys Pro Glu Thr Lys Pro Glu109010951100Lys Asp Ser Ser Gly Gln Thr Pro Gly Lys Thr Pro Gln Lys Gly Gln1105111011151120Pro Ser Arg Thr Leu Glu Lys Arg Ser Ser Lys Arg Ala Leu Ala Thr112511301135Lys Ala Ser Thr Arg Asp Gln Leu Pro Thr Thr Asn Asp Lys Asp Thr114011451150Asn Arg Leu His Leu Leu Lys Leu Val Met Thr Thr Phe Phe Leu Gly115511601165Leu Val Ala His Ile Phe Lys Thr Lys Arg Thr Lys Lys117011751180
權(quán)利要求
1.一種組合物,其包含結(jié)合或連接一個或多個肽或結(jié)合或連接一個或多個多糖的無酶活性的鏈球菌C5a肽酶(SCP),其中所述肽或多糖是另一種病原體。
2.按照權(quán)利要求1所述的組合物,其中是另一種病原體的所述蛋白質(zhì)或多糖是肺炎鏈球菌(Streptococcus pnuemoniae)蛋白質(zhì)。
3.按照權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述多糖是A群鏈球菌多糖,B群鏈球菌多糖,C群鏈球菌多糖或G群鏈球菌多糖。
4.按照權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述SCP包含SCP的特異性縫隙或催化結(jié)構(gòu)域。
5.按照權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述SCP包含SCP的催化結(jié)構(gòu)域。
6.按照權(quán)利要求5所述的組合物,其中所述SCP還包含SCP的催化結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞壁插入片段之間的區(qū)域。
7.按照權(quán)利要求4所述的組合物,其中所述SCP包含特異性縫隙。
8.按照權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述SCP不包含SCP信號序列。
9.按照權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述SCP不包含SCP信號序列和不包含SCP細(xì)胞壁插入片段。
10.按照權(quán)利要求1所述的組合物,其中所述SCP在氨基酸殘基260、261、262、415、416、417、130、193、295或512的一個或多個位置具有修飾。
11.一種活性成分在制備用于保護易感哺乳動物抗β-溶血性鏈球菌集落或感染的藥物中的應(yīng)用,所述活性成分包含免疫原量的權(quán)利要求1-10任一項的肽。
12.一種疫苗,其包含權(quán)利要求1-10任一項的肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于抗β-溶血鏈球菌集群或感染的新型疫苗。這種疫苗包含一種具有免疫原量的鏈球菌C5a肽酶的突變體(SCP),同時也提供了一種通過使用此種疫苗保護易感的哺乳動物抗β-溶血鏈球菌集群或感染的方法,并對無酶活性的SCP和編碼SCP蛋白多聚核糖核基酸也進行了披露。
文檔編號A61K39/02GK1679929SQ20051005292
公開日2005年10月12日 申請日期1999年12月3日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月7日
發(fā)明者保羅·帕特里克·克利里, 德博拉·K·斯塔夫斯林 申請人:明尼蘇達大學(xué)董事會