專利名稱：禽多核苷酸疫苗制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可接種禽類，尤其是雞的疫苗制劑，還涉及相應的接種方法。
以前已有人提出過針對與雞病有關的多種病毒的疫苗。
迄今為止發(fā)展起來的方法為滅活疫苗或活疫苗，它們的使用提出了效價和穩(wěn)定性之間相容性的問題。實際上不論是從所用的不同抗原的角度，還是從制劑本身的角度，都必需確保不同疫苗效價之間的相容性。另外還存在的問題是這種聯合疫苗的保存及其安全性，尤其是存在佐劑時的安全性。這些疫苗一般十分昂貴。
專利申請WO-A-90 11092，WO-A-92 19183，WO-A-94 21797和WO-A-95 20660利用了最近興起的多核苷酸疫苗技術。已知這些疫苗使用了質粒，所述質粒能在宿主細胞中表達插入其中的抗原。已提出所有的施用途徑(腹膜內，靜脈內，肌內，經皮，皮內，粘膜等等)。也可以使用不同的接種方式，如將DNA沉積在金粒表面并投射之以穿入動物皮膚(Tang等，自然(Nature)，356，152-154，1992)，可以同時轉染皮膚，肌肉，脂肪組織和乳房組織的液體噴射注射器(Furth等，分析生物化學(Analytical Biochemistry)，205，365-368，1992)。
多核苷酸疫苗也可以使用裸DNA和經配制的DNA，如脂質或陽離子脂質體內的DNA。
因此，本發(fā)明打算提供多價的疫苗制劑，所述制劑可以確保接種能抵抗多種病原性的禽病毒。
本發(fā)明的另一目的是提供含有不同效價并滿足彼此相容性和效價穩(wěn)定性所需的所有標準的疫苗制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供可以在相同載體中含有不同效價的疫苗制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供使用簡單且便宜的疫苗。
本發(fā)明的另一目的是提供接種雞形目動物的方法，所述接種可以得到高效，長期以及安全性良好又不留后患的保護作用，包括多價保護作用。
因此，本發(fā)明的目的是禽疫苗制劑，所述制劑含有至少3種效價的多核苷酸疫苗，每種含有一個整合質粒，其可在宿主細胞中體內表達一種禽病原體效價的基因，這些效價選自馬立克氏病病毒(MDV)，新城疫病毒(NDV)，Gumboro病病毒(IBDV)，傳染性支氣管炎病毒(IBV)，傳染性貧血癥病毒(CAV)，傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)，腦脊髓炎病毒(AEV或禽白血病病毒ALV)，肺病毒病病毒，和禽瘟病毒，對于每種效價而言，質粒含有一種或多種基因，該基因對于馬立克氏病病毒選自gB和gD，對于新城疫病毒選自HN和F，對于Gumboro病病毒選自VP2，對于傳染性支氣管炎病毒選自S、M和N，對于傳染性貧血癥病毒選自C+NS1，對于傳染性喉氣管炎病毒選自gB和gD，對于腦脊髓炎病毒選自env和gag/pro，對于肺病毒病病毒選自F和G，和對于禽瘟病毒選自HA、N和NP。
本發(fā)明中的效價應理解成至少一種可提供抗所研究病原體病毒的保護作用的抗原，效價可含有得自一株或多株所研究病原體的一個或多個天然或經修飾的基因作為亞效價。
病原性因子的基因應理解成不僅指完整的基因，也指不同的多種核苷酸序列，包括保持了誘導保護性反應之能力的片段?；虻母拍罡采w了等價于實施例中詳細描述的序列的核苷酸序列，也就是說，有所不同但編碼相同蛋白質的序列。此概念也覆蓋了被研究的其它株病原體的核苷酸序列，它可以提供交叉保護作用或特異于株或株群的保護作用。此概念也覆蓋了已被修飾以便于由宿主動物在體內表達，但編碼相同蛋白質的核苷酸序列。
優(yōu)選本發(fā)明的疫苗制劑含有3種選自馬立克氏病、Gumboro病、傳染性貧血癥和新城疫的效價，也優(yōu)選在其中加入傳染性支氣管炎的效價。
在該3，4或5種效價的基礎上，可以加入一種或多種選自禽瘟、傳染性喉氣管炎、肺病毒病和腦脊髓炎的效價。
至于馬立克氏病效價，在不同質?；蛞粋€相同質粒中可使用兩個編碼gB和gD的基因，然而優(yōu)選僅使用gB基因。
對于新城疫效價而言，優(yōu)選使用整合至兩個不同質?；蛞粋€相同質粒中的HN和F這兩個基因。
對于傳染性支氣管炎的效價而言，優(yōu)選使用S基因。任選，但較不優(yōu)選S和M在單個質?；虿煌|粒中聯合。
對于傳染性貧血癥的效價而言，優(yōu)選C和NS1這兩個基因在相同的質粒中聯合。
對于傳染性喉氣管炎的效價而言，優(yōu)選僅使用gB基因。任選，但較不優(yōu)選gB和gD這兩個基因在不同質粒或一個相同質粒中聯合。
對于肺病毒病的效價而言，優(yōu)選使用單個質粒或不同質粒中的F和G這兩個基因。
對于禽瘟的效價而言，優(yōu)選使用HA基因，任選，但較不優(yōu)選，可以使用不同質粒或一個相同質粒中HA和NP或HA和N的聯合。優(yōu)選在相同疫苗中聯合得自一種以上流感病毒株，尤其是得自在自然界發(fā)現的不同株的HA序列。另一方面，NP提供了交叉保護作用，因此得自單個病毒株的序列能令人滿意。
對于腦脊髓炎的效價而言，優(yōu)選使用env。
本發(fā)明疫苗制劑以0.1-1ml，尤其是0.3-0.5ml的劑量體積提供。
劑量一般為每種質粒類型10ng-1mg，優(yōu)選為100ng-500μg，優(yōu)選為0.1μg-50μg。
優(yōu)選使用簡單地置于接種載體，一般為生理鹽水等中的裸質粒。當然也可以使用現有技術中已描述的任何多核苷酸疫苗形式，尤其是配制于脂質體中的疫苗形式。
每個質粒都含有啟動子，在其控制下可確保插入基因在宿主細胞中的表達。所述啟動子一般是強的真核生物啟動子，尤其是來源于人或鼠、或任選來源于其它動物如大鼠、豬和豚鼠的巨細胞病毒早期CMV-IE啟動子。
啟動子更一般地講是來源于病毒或細胞。至于CMV-IE以外的病毒啟動子，可提到SV40病毒早期或晚期啟動子或Rous肉瘤病毒LTR啟動子。也可以是基因來源病毒的啟動子，例如基因自身的啟動子。
至于細胞啟動子，可提到細胞骨架基因的啟動子，例如結蛋白啟動子(Bolmont等，亞顯微鏡細胞學和病理學(Journal of SubmicroscopicCytology and Pathology)，1990，22，117-122；和Zhenlin等，基因(Gene)，1989，78，243-254)或者肌動蛋白啟動子。
當相同質粒中存在幾個基因時，它們會存在于相同的轉錄單位或兩個不同的單位中。
優(yōu)選通過混合表達各種效價之抗原的多核苷酸質粒來達到本發(fā)明不同疫苗效價的聯合，但也可以設想使幾種效價的抗原由相同質粒表達。
本發(fā)明的目的還在于單價疫苗制劑，所述制劑含有一個或多個編碼得自上述病毒之一的一個或多個基因的質粒，所述基因為上述的那些。除了它們的單價特征外，這些制劑可具有上述有關基因選擇，基因聯合，質粒組成，劑量體積，劑量等方面的特征。
單價疫苗制劑也可用于(i)制備上述的多價疫苗制劑，(ii)各對抗自己的疾病，(iii)與針對另一種疾病的另一類型(活的或滅活的完整的，重組的，亞單位)的疫苗聯合，或(iv)按下述作為疫苗的加強劑。
實際上本發(fā)明另一個目的是使用一種或多種本發(fā)明的質粒以制備用于接種動物的禽疫苗，所述動物首先已被第一種已知類型的常規(guī)疫苗(單價或多價)接種，所述第一種疫苗特別選自活的完整疫苗，滅活的完整疫苗、亞單位疫苗和重組疫苗，所述第一種疫苗具有(也就是說含有或能表達)由所述質粒編碼的抗原或提供交叉保護作用的抗原。
值得注意的是，所述多核苷酸疫苗具有強有力的加強效果，可導致免疫應答的增強并可獲得長期的免疫力。
一般地講，第一接種疫苗可選自可從不同的獸用疫苗生產商處購得的疫苗。
本發(fā)明的另一目的是接種試劑盒，所述試劑盒將本發(fā)明的疫苗制劑和上述第一接種疫苗組配在一起。本發(fā)明還涉及附帶有說明書的本發(fā)明的疫苗制劑，所述說明書指明該制劑可作為上述第一次接種的加強劑來使用。
本發(fā)明的另一目的是接種禽的方法，所述方法包括施用有效量的上述疫苗制劑。此接種方法包括施用一劑或更多劑疫苗制劑，這些劑量可以在短時間內連續(xù)施用和/或以較長的間隔期連續(xù)施用。
在這種接種方法中，通過現有技術中建議的用于多核苷酸接種的不同施用途徑并利用已知的施用技術施用本發(fā)明的疫苗制劑。
尤其涉及肌內途徑，卵內途徑，眼內途徑，噴霧法和飲水。
向免疫系統(tǒng)呈遞抗原的效力隨組織的不同而不同。具體地說，呼吸道粘膜是病原體進入的屏障，并與支持局部免疫力的淋巴組織相關。另外，對于大量接種而言，通過與粘膜，特別是頰粘膜，咽粘膜和支氣管區(qū)域的粘膜接觸以施用疫苗當然是有利的。
因此，尤其使用噴霧法或噴射或飲水經粘膜途徑施用疫苗形成了本發(fā)明優(yōu)選施用方式的一部分。可在在此意義上應用本發(fā)明的疫苗制劑和接種方法。
本發(fā)明的另一目的是一種接種方法，所述方法包括按上述進行第一次接種，并用本發(fā)明的疫苗制劑加強接種。
在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方案中，首先給動物施用有效劑量的常規(guī)疫苗，尤其是滅活的、活的、減毒的或重組的、或亞單位的疫苗以提供第一次接種，一段時間后，優(yōu)選為2至6周后，施用本發(fā)明的多價或單價疫苗。
本發(fā)明也涉及一種制備疫苗制劑的方法，即制備不同效價及其混合物的方法，如從此說明書中看到的方法。
下面參照附圖，借助于本發(fā)明的實施方案更詳細地描述本發(fā)明。


圖1質粒pVR1012
圖2質粒pAB045圖3質粒pAB080圖4Texas GB株NDV HN基因的序列圖5質粒pAB046圖6Texas GB株NDV F基因的序列圖7質粒pAB047圖8Faragher株IBDV VP2基因的序列圖9質粒pAB048圖10Massachusetts 41株IBV S基因的序列圖11質粒pAB049圖12Massachusetts 41株IBV M基因的序列圖13質粒pAB050圖14Massachusetts 41株IBV N基因的序列圖15質粒pAB051圖16質粒pAB054圖17質粒pAB055圖18質粒pAB076圖19質粒pAB089圖20質粒pAB086圖21質粒pAB081圖22質粒pAB082圖23質粒pAB077圖24質粒pAB078圖25質粒pAB088圖26質粒pAB079序列表SEQ ID NOSEQ ID NO1寡核苷酸AB062SEQ ID NO2寡核苷酸AB063
SEQ ID NO3寡核苷酸AB148SEQ ID NO4寡核苷酸AB149SEQ ID NO5寡核苷酸AB072SEQ ID NO6寡核苷酸AB073SEQ ID NO7Texas GB株NDV HN基因的序列SEQ ID NO8寡核苷酸AB091SEQ ID NO9寡核苷酸AB092SEQ ID NO10Texas GB株NDV F基因的序列SEQ ID NO11寡核苷酸AB093SEQ ID NO12寡核苷酸AB094SEQ ID NO13Faragher株IBDV VP2“基因”的序列SEQ ID NO14寡核苷酸AB095SEQ ID NO15寡核苷酸AB096SEQ ID NO16Massachusetts 41株IBV S基因的序列SEQ ID NO17寡核苷酸AB097SEQ ID NO18寡核苷酸AB098SEQ ID NO19Massachusetts 41株IBV M基因的序列SEQ ID NO20寡核苷酸AB099SEQ ID NO21寡核苷酸AB100SEQ ID NO22Massachusetts 41株IBV N基因的序列SEQ ID NO23寡核苷酸CD064SEQ ID NO24寡核苷酸CD065SEQ ID NO25寡核苷酸CD066SEQ ID NO26寡核苷酸AB105SEQ ID NO27寡核苷酸AB140SEQ ID NO28寡核苷酸AB141SEQ ID NO29寡核苷酸AB164SEQ ID NO30寡核苷酸AB165SEQ ID NO31寡核苷酸AB160
SEQ ID NO32寡核苷酸AB161SEQ ID NO33寡核苷酸AB150SEQ ID NO34寡核苷酸AB151SEQ ID NO35寡核苷酸AB152SEQ ID NO36寡核苷酸AB153SEQ ID NO37寡核苷酸AB142SEQ ID NO38寡核苷酸AB143SEQ ID NO39寡核苷酸AB144SEQ ID NO40寡核苷酸AB145SEQ ID NO41寡核苷酸AB156SEQ ID NO42寡核苷酸AB158SEQ ID NO43寡核苷酸AB146SEQ ID NO44寡核苷酸AB147實施例實施例1病毒的培養(yǎng)在適當的細胞系統(tǒng)中培養(yǎng)病毒直至得到細胞病變效應。本領域技術人員熟知每種病毒所用的細胞系統(tǒng)。簡單地說，用感染復數為1的被研究的病毒株接種對所用病毒敏感的細胞，所述細胞在Eagle最低基本培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基)或另一種適當的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后于37℃保溫被感染的細胞直至出現完全的細胞病變效應(平均為36小時)。
實施例2提取病毒基因組DNA培養(yǎng)后，收獲上清液和被裂解的細胞，于4℃，1000g將全部的病毒懸浮液離心10分鐘以除去細胞碎片，然后通過于4℃，400,000g超速離心1小時以收獲病毒顆粒。將沉淀物溶解于最少量的緩沖液(10mMTris，1mM EDTA)中，于37℃，在十二烷基硫酸鈉(SDS)的存在下(終濃度為0.5％)，用蛋白酶K(終濃度為100μg/ml)將上述濃縮的病毒懸浮液處理2小時。然后用苯酚/氯仿混合物提取病毒DNA，再用2倍體積的無水乙醇沉淀之。于-20℃放置過夜后，于4℃，10,000g將DNA離心15分鐘，干燥DNA沉淀物，然后將它溶于最少量的無菌超純水中，接著可以用限制性酶消化所述DNA。
實施例3分離病毒基因組RNA根據本領域技術人員熟知的技術純化RNA病毒，然后使用P.Chromczynski和N.Sacchi所述的“硫氰酸胍/苯酚-氯仿”提取技術(分析生物化學，1987，162，156-159)分離各個病毒的基因組病毒RNA。
實施例4分子生物學技術使用J.Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述的標準分子生物學技術進行所有的質粒構建。使用“Geneclean”試劑盒(BIO 101 Inc.La Jolla，CA)分離用于本發(fā)明的所有限制性片段。
實施例5RT-PCR技術合成多個特異性的寡核苷酸(在其5’末端含有限制性位點以便于克隆經擴增的片段)以使其完全覆蓋欲被擴增的基因的編碼區(qū)(見具體的實施例)。根據標準技術(Sambrook J等人，1989)進行逆轉錄(RT)反應和聚合酶鏈反應(PCR)。用一對特異性的擴增引物進行一種RT-PCR反應，所述反應的模板是提取出的病毒基因組RNA。用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)提取經擴增的互補DNA，然后用限制性酶消化。
實施例6質粒pVR1012質粒pVR1012(圖1)得自Vical Inc.，San Diego，CA，USA。其構建描述于J.Hartikka等人(人類基因療法(Human Gene Therapy)，1996，7，1205-1217)。
實施例7構建質粒pAB045(MDV gB基因)用根據實施例2的技術制備的馬立克氏病病毒(MDV)(RB1B株)(L.Ross等，普通病毒學雜志(J.Gen.Virol.)，1989，70，1789-1804)基因組DNA和下列寡核苷酸AB062(37聚體)(SEQ ID NO1)5’AAAACTGCAGACTATGCACTATTTTAGGCGGAATTGC 3’AB063(35聚體)(SEQ ID NO2)5’GGAAGATCTTTACACAGCATCATCTTCTGAGTCTG 3’進行PCR反應以從MDV病毒中分離PstI-BglII片段形式的編碼gB糖蛋白的基因。純化之后，用PstI和BglII消化2613bp的PCR產物以分離2602bp的PstI-BglII片段。將此片段與預先經PstI和BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB045(7455bp)(圖2)。
實施例8構建質粒pAB080(MDV gD基因)用根據實施例2的技術制備的馬立克氏病病毒(MDV)(RB1B株)(L.Ross等，普通病毒學雜志，1991，72，949-954)基因組DNA和下列寡核苷酸AB148(29聚體)(SEQ ID NO3)5’AAACTGCAGATGAAAGTATTTTTTTTTAG 3’AB149(32聚體)(SEQ ID NO4)5’GGAAGATCTTTATAGGCGGGAATATGCCCGTC 3’進行PCR反應以從MDV病毒中分離PstI-BglII片段形式的編碼gD糖蛋白的基因。純化之后，用PstI和BglII消化1215bp的PCR產物以分離1199bp的PstI-BglII片段。將此片段與預先經PstI和BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB080(6051bp)(圖3)。
實施例9構建質粒pAB046(NDV HN基因)用根據實施例3的技術制備的新城疫病毒(NDV)(Texas GB株)基因組RNA和下列寡核苷酸
AB072(39聚體)(SEQ ID NO5)5’ATAAGAATGCGGCCGCCATGGACCGTGCAGTTAGCAGAG 3’AB094(34聚體)(SEQ ID NO6)5’CGCGGATCCTTAAATCCCATCATCCTTGAGAATC 3’根據實施例5的技術進行T-PCR反應以從NDV病毒Texas GB株中分離NotI-BamHI片段形式的編碼HN糖蛋白的基因(圖4和SEQ IDNO7)。純化之后，用NotI和BamHI消化1741bp的RT-PCR產物以分離1723bp的NotI-BamHI片段。將此片段與預先經NotI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB046(6616bp)(圖5)。
實施例10構建質粒pAB047(NDV F基因)用根據實施例3的技術制備的新城疫病毒(NDV)(Texas GB株)基因組RNA和下列寡核苷酸AB091(37聚體)(SEQ ID NO8)5’AGAATGCGGCCGCGATGGGCTCCAGATCTTCTACCAG 3’AB092(34聚體)(SEQ ID NO9)5’TGCTCTAGATCATATTTTTGTAGTGGCTCTCATC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從NDV病毒Texas GB株中分離NotI-XbaI片段形式的編碼F糖蛋白的基因(圖6和SEQ IDNO10)。純化之后，用NotI和XbaI消化1684bp的RT-PCR產物以分離1669bp的NotI-XbaI片段。將此片段與預先經NotI和XbaI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB047(6578bp)(圖7)。
實施例11構建質粒pAB048(IBDV VP2基因)用根據實施例3的技術制備的Gumboro病病毒(IBDV)(Faragher株)基因組RNA和下列寡核苷酸AB093(33聚體)(SEQ ID NO11)5’TCAGATATCGATGACAAACCTGCAAGATCAAAC 3’
AB094(38聚體)(SEQ ID NO12)5’AGAATGCGGCCGCTTACCTCCTTATAGCCCGGATTATG 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從IBDV病毒Faragher株中分離EcoRV-NotI片段形式的編碼VP2蛋白的序列(圖8和SEQ IDNO13)。純化之后，用EcoRV和NotI消化1384bp的RT-PCR產物以分離1367bp的EcoRV-NotI片段。將此片段與預先經EcoRV和NotI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB048(6278bp)(圖9)。
實施例12構建質粒pAB049(IBV S1基因)用根據實施例3的技術制備的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)(Massachusetts 41株)基因組RNA和下列寡核苷酸AB095(32聚體)(SEQ ID NO14)5’ACGCGTCGACATGTTGGTAACACCTCTTTTAC 3’AB096(35聚體)(SEQ ID NO15)5’GGAAGATCTTCATTAACGTCTAAAACGACGTGTTC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從IBV病毒Massachusetts 41株中分離SalI-BglII片段形式的編碼S糖蛋白S1亞單位的序列(圖10和SEQ ID NO16)。純化之后，用SalI和BglII消化1635bp的RT-PCR產物以分離1622bp的SalI-BglII片段。將此片段與預先經SalI和BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB049(6485bp)(圖11)。
實施例13構建質粒pAB050(IBV M基因)用根據實施例3的技術制備的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)(Massachusetts 41株)基因組RNA和下列寡核苷酸AB097(39聚體)(SEQ ID NO17)5’ATAAGAATGCGGCCGCATGTCCAACGAGACAAATTGTAC 3’AB098(38聚體)(SEQ ID NO18)
5’ATAAGAATGCGGCCGCTTTAGGTGTAAAGACTACTCCC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從IBV病毒Massachusetts 41株中分離NotI-NotI片段形式的編碼M糖蛋白的基因(圖12和SEQ IDNO19)。純化之后，用NotI消化710bp的RT-PCR產物以分離686bp的NotI-NotI片段。將此片段與預先經NotI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB050(5602bp)，該質粒在相對啟動子而言正確的方向上含有IBV M基因(圖13)。
實施例14構建質粒pAB051(IBV N基因)用根據實施例3的技術制備的雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)(Massachusetts 41株)基因組RNA和下列寡核苷酸AB099(34聚體)(SEQ ID NO20)5’AAAACTGCAGTCATGGCAAGCGGTAAGGCAACTG 3’AB100(33聚體)(SEQ ID NO21)5’CGCGGATCCTCAAAGTTCATTCTCTCCTAGGGC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從IBV病毒Massachusetts 41株中分離PstI-BamHI片段形式的編碼N蛋白的基因(圖14和SEQ IDNO22)。純化之后，用PstI和BamHI消化1250bp的RT-PCR產物以分離1233bp的PstI-BamHI片段。將此片段與預先經PstI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB051(6092bp)(圖15)。
實施例15構建質粒pAB054(VAC VP1基因)用根據實施例2的技術制備的雞貧血癥病毒(CAV)(Cuxhaven-1株)基因組DNA(B.Meehan等，Arch.Virol，1992，124，301-319)和下列寡核苷酸CD064(39聚體)(SEQ ID NO23)5’TTCTTGCGGCCGCCATGGCAAGACGAGCTCGCAGACCGA3’
CD065(38聚體)(SEQ ID NO24)5’TTCTTGCGGCCGCTCAGGGCTGCGTCCCCCAGTACATG 3’進行PCR反應以分離NotI-NotI片段形式的編碼CAV VP1衣殼蛋白的基因。純化之后，用NotI消化1377bp的PCR產物以分離1359bp的NotI-NotI片段。將此片段與預先經NotI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB054(6274bp)，該質粒在相對啟動子而言正確的方向上含有CAV VP1基因(圖16)。
實施例17構建質粒pAB055(VAC VP2基因)用根據實施例2的技術制備的雞貧血癥病毒(CAV)(Cuxhaven-1株)基因組DNA(B.Meehan等，Arch.Virol，1992，124，301-319)和下列寡核苷酸CD066(39聚體)(SEQ ID NO25)5’TTCTTGCGGCCGCCATGCACGGGAACGGCGGACAACCGG3’AB105(32聚體)(SEQ ID NO26)5’CGCGGATCCTCACACTATACGTACCGGGGCGG 3’進行PCR反應以分離NotI-BamHI片段形式的編碼CAV病毒VP2蛋白的基因。純化之后，用NotI和BamHI消化674bp的PCR產物以分離659bp的NotI-BamHI片段。將此片段與預先經NotI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB055(5551bp)(圖17)。
實施例18構建質粒pAB076(ILTV gB基因)用根據實施例2的技術制備的雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)(SA-2株)基因組DNA(K.Kongsuwan等，病毒學(Virology)，1991，184，404-410)和下列寡核苷酸AB140(38聚體)(SEQ ID NO27)5’TTCTTGCGGCCGCCATGGCTAGCTTGAAAATGCTGATC 3’
AB141(36聚體)(SEQ ID NO28)5’TTCTTGCGGCCGCTTATTCGTCTTCGCTTTCTTCTG 3’進行PCR反應以分離NotI-NotI片段形式的編碼ILTV病毒gB糖蛋白的基因。純化之后，用NotI消化2649bp的PCR產物以分離2631bp的NotI-NotI片段。將此片段與預先經NotI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB076(7546bp)，該質粒在相對啟動子而言正確的方向上含有ILTV gB基因(圖18)。
實施例20構建質粒pAB089(ILTV gD基因)用根據實施例2的技術制備的雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)(SA-2株)基因組DNA(M.Johnson等，1994，Genbank序列登記號為L31965)和下列寡核苷酸AB164(33聚體)(SEQ ID NO29)5’CCGGTCGACATGGACCGCCATTTATTTTTGAGG 3’AB165(33聚體)(SEQ ID NO30)5’GGAAGATCTTTACGATGCTCCAAACCAGTAGCC 3’進行PCR反應以分離SalI-BglII片段形式的編碼ILTV病毒gD糖蛋白的基因。純化之后，用SalI和BglII消化1134bp的PCR產物以分離1122bp的SalI-BglII片段。將此片段與預先經SalI-BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB089(5984bp)(圖19)。
實施例21構建質粒pAB086(AEV env基因)用根據實施例3的技術制備的禽腦脊髓炎病毒(AEV)(C型)基因組RNA(E.Bieth等，核酸研究(Nucleic Res.)，1992，20，367)和下列寡核苷酸AB160(54聚體)(SEQ ID NO31)5’TTTGATATCATGGAAGCCGTCATTAAGGCATTTCTGACTGGATACCCTGGGAAG 3’
AB161(31聚體)(SEQ ID NO32)5’TTTGGATCCTTATACTATTCTGCTTTCAGGC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以分離EcoRV-BamHI片段形式的編碼AEV病毒Env糖蛋白的序列。純化之后，用EcoRV和BamHI消化1836bp的RT-PCR產物以分離1825bp的EcoRV-BamHI片段。將此片段與預先經EcoRV和BamHI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB086(6712bp)(圖20)。
實施例22構建質粒pAB081(AEV gag/pro基因)用根據實施例3的技術制備的禽腦脊髓炎病毒(AEV)(C型)基因組RNA(E.Bieth等，核酸研究，1992，20，367)和下列寡核苷酸AB150(31聚體)(SEQ ID NO33)5’ACGCGTCGACATGGAAGCCGTCATTAAGGTG 3’AB151(32聚體)(SEQ ID NO34)5’TGCTCTAGACTATAAATTTGTCAAGCGGAGCC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以分離SalI-XbaI片段形式的編碼AEV病毒Gag和Pro蛋白的序列。純化之后，用SalI-XbaI消化2125bp的RT-PCR產物以分離2111bp的SalI-XbaI片段。將此片段與預先經SalI和XbaI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB081(6996bp)(圖21)。
實施例23構建質粒pAB082(肺病毒G基因)用根據實施例3的技術制備的火雞鼻氣管炎病毒(TRV)(2119株)基因組RNA(K.Juhasz等，普通病毒學雜志，1994，75，2873-2880)和下列寡核苷酸AB152(32聚體)(SEQ ID NO35)5’AAACTGCAGAGATGGGGTCAGAGCTCTACATC 3’AB153(31聚體)(SEQ ID NO36)5’CGAAGATCTTTATTGACTAGTACAGCACCAC 3’
根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以分離PstI-BglII片段形式的編碼TRV病毒G糖蛋白的基因。純化之后，用PstI和BglII消化2165bp的RT-PCR產物以分離1249bp的PstI-BglII片段。將此片段與預先經PstI和BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB082(6101bp)(圖22)。
實施例24構建質粒pAB077(禽瘟病毒HA基因，H2N2株)用根據實施例3的技術制備的禽瘟病毒(AIV)(H2N2 Postdam株)基因組RNA(J.Schafer等，病毒學，1993，194，781-788)和下列寡核苷酸AB142(33聚體)(SEQ ID NO37)5’AAACTGCAGCAATGGCCATCATTTATCTAATTC 3’AB143(31聚體)(SEQ ID NO38)5’CGAAGATCTTCATATGCAGATTCTGCATTGC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從禽瘟病毒(H2N2株)分離PstI-BglII片段形式的編碼HA糖蛋白的基因。純化之后，用PstI和BglII消化1709bp的RT-PCR產物以分離1693bp的PstI-BglII片段。將此片段與預先經PstI和BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB077(6545bp)(圖23)。
實施例25構建質粒pAB078(禽瘟病毒HA基因，H7N7株)用根據實施例3的技術制備的禽瘟病毒(AIV)(H7N7 Leipzig株)基因組RNA(C.Rohm等，病毒學，1995，209，664-670)和下列寡核苷酸AB144(31聚體)(SEQ ID NO39)5’AAACTGCAGATGAACACTCAAATCCTGATAC 3’AB145(31聚體)(SEQ ID NO40)5’TTTGGATCCTTATATACAAATAGTGCACCGC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從禽瘟病毒(H7N7株)分離PstI-BamHI片段形式的編碼HA糖蛋白的基因。純化之后，用PstI和BamHI消化1707bp的RT-PCR產物以分離1691bp的PstI-BamHI片段。將此片段與預先經PstI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB078(6549bp)(圖24)。
實施例26構建質粒pAB088(禽瘟病毒NP基因，H1N1株)用根據實施例3的技術制備的禽流感病毒(AIV)(H1N1 Bavaria株)基因組RNA(M.Gammelin等，病毒學，1989，170，71-80)和下列寡核苷酸AB156(32聚體)(SEQ ID NO41)5’CCGGTCGACATGGCGTCTCAAGGCACCAAACG 3’AB158(30聚體)(SEQ ID NO42)5’CGCGGATCCTTAATTGTCATACTCCTCTGC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以分離SalI-BamHI片段形式的編碼禽流感病毒NP核蛋白的基因。純化之后，用SalI和BamHI消化1515bp的RT-PCR產物以分離1503bp的SalI-BamHI片段。將此片段與預先經SalI和BamHI消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB088(6371bp)(圖25)。
實施例27構建質粒pAB079(禽瘟病毒N基因，H7N1株)用根據實施例3的技術制備的禽瘟病毒(AIV)(H7N1 Rostock株)基因組RNA(J.McCauley，1990，Genbank登記號為X52226)和下列寡核苷酸AB146(35聚體)(SEQ ID NO43)5’CGCGTCGACATGAATCCAAATCAGAAAATAATAAC 3’AB147(31聚體)(SEQ ID NO44)5’GGAAGATCTCTACTTGTCAATGGTGAATGGC 3’根據實施例5的技術進行RT-PCR反應以從禽瘟病毒(H7N1株)分離SalI-BglII片段形式的編碼N糖蛋白的基因。純化之后，用SalI和BglII消化1361bp的RT-PCR產物以分離1350bp的SalI-BglII片段。將此片段與預先經SalI和BglII消化的載體pVR1012(實施例6)連接，得到質粒pAB079(6212bp)(圖26)。
實施例28制備和純化質粒為了制備欲接種動物的質粒，可使用能得到超螺旋形式占優(yōu)勢的純化質粒懸浮液的任何技術，這些技術是本領域技術人員所熟知的。這里可特別提到J.Sambrook等人(分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1989)所述的堿裂解技術，接著再在溴化乙錠的存在下，在氯化銫梯度中進行2次連續(xù)的超速離心。也可參照專利申請PCT WO 95/21250和PCT WO 96/02658，它們描述了工業(yè)化規(guī)模生產可用于接種之質粒的方法。為了制備疫苗(見實施例17)，可重新懸浮純化的質粒以得到適于儲存的高濃度溶液(＞2mg/ml)。為此，將質粒重新懸浮于超純水或TE緩沖液(10mM Tris-HCl；1mM EDTA，pH8.0)中。
實施例29制備聯合疫苗從其濃縮溶液(實施例16)開始混合制備聯合疫苗所需的多種質粒。制備混合物以使各個質粒的終濃度相當于各個質粒的有效劑量。可用于調節(jié)疫苗終濃度的溶液可以是0.9％的NaCl溶液，也可以是PBS緩沖液。
也可以將特殊的制劑，如脂質體，陽離子脂質用于制備疫苗。
實施例30對雞接種以每種質粒10，50或100μg的劑量接種雞，通過肌內途徑用針頭進行注射。注射位點是胸骨(對于2周齡以上的雞而言)和大腿(對于1天齡或以上的雞而言)。此時，以0.1至0.3ml的體積施用疫苗劑量。
在成年雞中(大于20周齡)，也可以使用為接種雞而特別設計的液體噴射注射裝置(不帶針頭)(如AVIJET裝置)，經肌內途徑進行注射。此時，注射體積是0.3ml?？稍谛毓腔虼笸壬线M行注射。類似地，在成年雞中，也可用針頭，經肌內途徑以0.3ml的體積對胸骨或大腿進行注射。質粒疫苗的注射也可在卵內進行，此時，可使用實施例29中提到的特殊制劑，注射至18天齡有胚卵中的體積是50至200μl。
權利要求
1.禽疫苗制劑，所述制劑含有至少3種效價的多核苷酸疫苗，每種含有一個整合質粒，其可在宿主細胞中體內表達一種禽病原體效價的基因，這些效價選自馬立克氏病病毒、新城疫病毒、Gumboro病病毒、傳染性貧血癥病毒，對于每種效價而言，質粒含有一種或多種基因，該基因對于馬立克氏病病毒選自gB和gD，對于新城疫病毒選自HN和F，對于Gumboro病病毒選自VP2，對于傳染性貧血癥病毒選自C+NS1。
2.根據權利要求1的疫苗制劑，其特征在于對于馬立克氏病病毒的效價而言，所述制劑僅含有gB基因。
3.根據權利要求1的制劑，其特征在于所述制劑在相同質?；虿煌|粒中含有新城疫病毒的HN和F基因。
4.根據權利要求1的制劑，其特征在于針對傳染性貧血癥病毒的質粒在相同質粒中含有C+NS1。
5.根據權利要求1至4中任一項的疫苗制劑，其特征在于所述制劑另外含有至少一種選自傳染性支氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒，腦脊髓炎病毒，肺病毒病病毒，和禽瘟病毒，對于這些效價而言，質粒含有一種或多種基因，該基因選自傳染性支氣管炎病毒的S、M和N，傳染性喉氣管炎病毒的gB和gD，腦脊髓炎病毒的env和gag/pro，肺病毒病病毒的F和G，和禽瘟病毒的HA、N和NP。
6.根據權利要求5的疫苗制劑，其特征在于對于傳染性支氣管炎病毒的效價而言，所述制劑僅含有S基因。
7.根據權利要求5的疫苗制劑，其特征在于對于傳染性喉氣管炎病毒的效價而言，所述制劑僅含有gB基因。
8.根據權利要求5的疫苗制劑，其特征在于對于肺病毒病病毒的效價而言，所述制劑在不同質?；蛞粋€和相同質粒中含有F和G這兩個基因。
9.根據權利要求5的疫苗制劑，其特征在于對于禽瘟病毒效價而言，所述制劑僅含有HA基因。
10.根據權利要求5的疫苗制劑，其特征在于對于腦脊髓炎病毒效價而言，疫苗制劑含有env基因。
11.根據權利要求1至10中任一項的疫苗制劑，其特征在于所述制劑含有10ng-1mg，優(yōu)選為100ng-500μg，更優(yōu)選為0.1μg-50μg每種質粒。
12.權利要求1至11中任一項所述的一種或多種質粒用于制備接種動物的禽疫苗的用途，所述動物首先已被第一種選自活的完整疫苗、滅活的完整疫苗、亞單位疫苗和重組疫苗的疫苗接種，所述第一種疫苗具有由該質粒編碼的抗原或提供交叉保護作用的抗原。
13.一種接種試劑盒，所述試劑盒將根據權利要求1至11中任一項的疫苗制劑和選自活的完整疫苗、滅活的完整疫苗、亞單位疫苗和重組疫苗的第一種禽疫苗組配在一起，所述第一種疫苗具有由該多核苷酸疫苗編碼的抗原或提供交叉保護作用的抗原，在第一次接種時施用第一種疫苗，并將所述疫苗制劑用作加強劑。
14.附帶有說明書的根據權利要求1至11中任一項的疫苗制劑，所述說明書指明此制劑能用作選自活的完整疫苗、滅活的完整疫苗、亞單位疫苗和重組疫苗的第一種禽疫苗的加強劑，所述第一種疫苗具有由該多核苷酸疫苗編碼的抗原或提供交叉保護作用的抗原。
15.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達新城疫病毒HN基因。
16.權利要求15的疫苗，其中所述質粒還含有F基因。
17.權利要求15的疫苗，其還含有含F基因的質粒。
18.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達傳染性粘液囊病病毒VP2基因。
19.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達傳染性貧血癥病毒C和NS1基因。
20.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達選自gB和gD基因的馬立克氏病病毒基因。
21.權利要求20的疫苗，其中質粒含有gB和gD基因。
22.權利要求20的疫苗，其包含含gB基因的質粒和含gD基因的質粒。
23.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達選自gB和gD基因的ILTV基因。
24.權利要求23的疫苗，其中質粒含有gB和gD基因。
25.權利要求23的疫苗，其含有含gB基因的質粒和含gD基因的質粒。
26.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達選自F和G基因的肺病毒病病毒基因。
27.權利要求26的疫苗，其中質粒含有F和G基因。
28.權利要求26的疫苗，其含有含F基因的質粒和含G基因的質粒。
29.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達選自env和gag/pro基因的腦脊髓炎病毒基因。
30.權利要求29的疫苗，其中質粒含有env基因。
31.含有一種質粒和藥物可接受載體的禽疫苗，所述質粒含有并在體內表達選自M和N基因的傳染性支氣管炎病毒基因。
32.權利要求15-31任一項的疫苗，其中所述基因處于選自CMV-IE啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、Rous肉瘤病毒LTR啟動子、細胞骨架基因啟動子的啟動子控制之下。
33.權利要求32的疫苗，其中所述基因處于CMV-IE啟動子控制之下。
34.含有選自VP1和VP2基因的傳染性貧血癥病毒基因的質粒，該質粒允許體內表達所述基因。
全文摘要
禽疫苗制劑，所述制劑含有至少3種效價的多核苷酸疫苗，每種含有一個整合質粒，其可在宿主細胞中體內表達一種禽病原體效價的基因，這些效價選自馬立克氏病病毒、新城疫病毒、Gumboro病病毒、傳染性貧血癥病毒，對于每種效價而言，質粒含有一種或多種基因，該基因對于馬立克氏病病毒選自gB和gD，對于新城疫病毒選自HN和F，對于Gumboro病病毒選自VP2，對于傳染性貧血癥病毒選自C+NS1。
文檔編號A61K39/295GK1701788SQ200510066979
公開日2005年11月30日 申請日期1997年7月16日 優(yōu)先權日1996年7月19日
發(fā)明者J-C·奧都尼特, A·布薩都恩, M·里威爾 申請人:梅瑞爾公司