專利名稱：從中草藥中篩選、分離活性物質(zhì)的方法、含有該活性物質(zhì)的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用生物傳感器技術(shù)，以病原分子為靶點(diǎn)，篩選具有與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的中草藥以及通過對中草藥提取物中各組分與病原分子結(jié)合活性的跟蹤檢測，定向分離能與病原分子結(jié)合的活性組分或活性物質(zhì)，對所得到的活性組分或活性物質(zhì)進(jìn)行針對病原分子的體內(nèi)外生物學(xué)活性評估。
背景技術(shù)：
國內(nèi)外研究經(jīng)驗(yàn)表明，從來自于天然的先導(dǎo)化合物中很有希望得到治療疑難病癥的新藥，從天然化合物篩選得到的有效單體的命中率比合成化合物高。臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，某些中草藥制劑可通過各種機(jī)制發(fā)揮對癥病中病原分子的治療作用，但由于中草藥組成成分復(fù)雜，尤其是受方法學(xué)的限制，中草藥中具有抗病原分子作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。
膿毒癥是由病原分子介導(dǎo)的全身性炎癥反應(yīng)綜合征，是導(dǎo)致臨床危重病人死亡的主要原因。膿毒癥發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制為病原體侵入機(jī)體后，其菌體的致炎病原分子被機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)中炎癥反應(yīng)細(xì)胞膜上/細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的模式識別受體識別，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)細(xì)胞活化，釋放炎癥介質(zhì)而引發(fā)組織器官的損傷。特別是伴有嚴(yán)重內(nèi)毒素(LPS)血癥的G-桿菌的感染。G-菌菌血癥的病死率為20～30％，而由菌血癥發(fā)展而來的膿毒癥休克其病死率可高達(dá)50～80％。目前針對膿毒癥的治療，臨床上尚缺乏有效的措施，因此導(dǎo)致感染性疾病的治療更為棘手，研究其發(fā)病機(jī)理并尋找有效的治療措施一直是臨床醫(yī)學(xué)關(guān)注的焦點(diǎn)。
近年來，隨著對病原體相關(guān)分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)及其模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)的發(fā)現(xiàn)，人類對膿毒癥的認(rèn)識發(fā)生了質(zhì)的飛躍。膿毒癥發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制為病原體侵入機(jī)體后，其菌體的致炎病原分子/病原體相關(guān)分子被機(jī)體非特異性免疫系統(tǒng)中炎癥反應(yīng)細(xì)胞膜上/細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)的模式識別受體識別，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)細(xì)胞活化，釋放炎癥介質(zhì)而引發(fā)組織器官的損傷。
現(xiàn)在我們知道，在微生物的進(jìn)化過程中，盡管作為脊椎動(dòng)物病原體的微生物種類繁多，但是由于構(gòu)成其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分子相對保守，因此脊椎動(dòng)物的非特異性免疫系統(tǒng)可以使用有限數(shù)量的受體分子識別結(jié)構(gòu)保守的病原體相關(guān)分子。存在于哺乳動(dòng)物炎癥反應(yīng)細(xì)胞膜上的Toll樣受體家族(Toll-like receptors，TLRs)及Nod蛋白(Nod proteins)就是哺乳動(dòng)物識別病原體相關(guān)分子的模式識別受體。TLRs是一種跨膜蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)11種；Nod蛋白是哺乳動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)進(jìn)行胞內(nèi)識別病原體的模式受體，有Nod1及Nod2兩種。目前，比較清楚的識別模式是TLR4識別G-菌的脂多糖/內(nèi)毒素(Lipopoly-saccharide/endotoxin，LPS)，Nod蛋白識別G+菌的肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，TLR9識別細(xì)菌基因組DNA(CpG-congtainingoligonucleotides，CpG DNA)，TLR2主要識別PGN、酵母多糖脂蛋白(ZymosanLipoprotein)，TLR3識別雙鏈RNA，TLR5識別鞭毛蛋白，TLR6識別脂肽(Lipopeptides)，TLR7、TLR8識別單鏈RNA等。
許多病原體如細(xì)菌、真菌等均能介導(dǎo)膿毒癥的發(fā)生，但臨床上由G-菌、G+菌介導(dǎo)的膿毒癥占95％以上。細(xì)菌多個(gè)病原分子參與膿毒癥的發(fā)生，但細(xì)菌介導(dǎo)膿毒癥發(fā)生的主要病原分子是G-菌的LPS、G+菌的PGN和G-菌、G+菌所共有的CpGDNA。LPS、PGN和CpG DNA三個(gè)病原分子中任何一個(gè)單一分子均可介導(dǎo)致死性膿毒癥的發(fā)生，然而臨床上任何病原體所引發(fā)的膿毒癥其病原分子都不是單一的，因此只將某一種病原分子作為靶點(diǎn)，可能只能解決膿毒癥的部分問題，這可能是既往主要以單一的LPS分子為靶點(diǎn)的膿毒癥防治效果欠佳的原因。因此，如能有效地拮抗上述三個(gè)主要的病原分子，膿毒癥的防治就有可能取得突破性進(jìn)展。
國內(nèi)外研究經(jīng)驗(yàn)表明，從來自于天然的中草藥中很有希望得到治療膿毒癥的新藥，從中草藥中篩選得到的有效單體的命中率比合成化合物高。
同時(shí)，臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，某些中藥制劑可通過促進(jìn)LPS代謝、抑制巨噬細(xì)胞的活化等機(jī)制發(fā)揮對膿毒癥的治療作用，但由于中草藥組成成分復(fù)雜，尤其是受方法學(xué)的限制，中藥中抗LPS作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚。
化合物1，2，3，4，6-O-五沒食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloyglucose，PGG)不是一個(gè)新的化合物，在文獻(xiàn)《Adachi H，Konishi K，Horikoshi I.The effectsof 1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-beta-d-glucose on rat liver mitochondrial respiration.ChemPharm Bull(Tokyo)1989；37(5)1341-1344》中提到，研究表明PGG作為一種黃嘌呤氧化酶抑制劑，可對線粒體的呼吸及氧化磷酸化產(chǎn)生影響，該影響可能通過作用氫化可的松脫氫酶和NADH脫氫酶實(shí)現(xiàn)。但未見用于治療疾病的藥物中，更未見用于治療膿毒癥的藥物中。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的主要目的是提供一種從中草藥中篩選、分離治療疾病的活性組分或活性物質(zhì)的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過利用生物傳感技術(shù)方法，從具有抗菌/抗炎的中草藥中篩選、分離并具有治療膿毒癥作用的抗LPS/Lipid A的有效組分或活性物質(zhì)。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是通過利用生物傳感技術(shù)方法，從具有抗菌/抗炎的中草藥中篩選、分離包含活性物質(zhì)PGG的藥物組合物，本發(fā)明的又一個(gè)目的是包含活性物質(zhì)PGG的藥物組合物在制備治療膿毒癥的藥物中的應(yīng)用。
一種從中草藥中篩選活性組分或活性物質(zhì)的方法，其原理是通過利用光學(xué)原理的光學(xué)生物傳感器技術(shù)，在生物傳感器的樣品池表面包被固相受體，當(dāng)受體與其流動(dòng)相的配體發(fā)生結(jié)合作用時(shí)，以共振角度進(jìn)入光線衰減區(qū)的激光就會發(fā)生共振角度的改變，這一變化通過計(jì)算機(jī)FASTplot和FASTfit程序處理后就可以檢測到傳感器表面受體與其配體分子之間的相互作用及親合力。通過特異性的洗脫及回收，即可得到純度極高的配體分子。
其包括如下步驟①應(yīng)用生物傳感器技術(shù)，將病原分子包被于生物傳感器的樣品池作為固定相配基；使病原分子結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要生物學(xué)作用的基團(tuán)外露，以此作為與中草藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點(diǎn)，對能與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的中草藥進(jìn)行篩選、并將此結(jié)合作用作為進(jìn)一步分離中草藥中拮抗病原分子活性組分或活性物質(zhì)的檢測手段；②以中草藥提取物為流動(dòng)相，使該中草藥提取物中的活性物質(zhì)與固定相的病原分子結(jié)合，篩選能夠與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的中草藥；③將篩選出的與病原分子具有較強(qiáng)結(jié)合活性的中草藥提取物，經(jīng)吸附柱層析或高效液相色譜(HPLC)方法或者兩種方法相結(jié)合進(jìn)行分離，對所得到的不同組分再次通過生物傳感器進(jìn)行結(jié)合活性檢測，即可得到能與病原分子發(fā)生結(jié)合作用<p>表5復(fù)方巖白菜素分散片與普通片中馬來酸氯苯那敏溶出曲線對比
從表4、表5中可以看出，本發(fā)明三批樣品的溶出度均一性良好，批內(nèi)個(gè)體差異小，批間重現(xiàn)性好，三批分散片的溶出度均較市售普通片明顯加快，5分鐘巖白菜素的平均溶出度為73.8％，比普通片在5分鐘時(shí)的溶出度提高了28.0％以上；馬來酸氯苯那敏的平均溶出度為60.0％，比普通片
本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于，配方中加入氯化鈉2.25kg，使等滲效果更好，同時(shí)具有穩(wěn)定溶液的作用，另外在制劑制備過程中，調(diào)節(jié)PH值，使溶液pH值控制4.0～5.0之間；這樣可以穩(wěn)定溶液，延長貯存期。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1一、處方研究(1000瓶)甘油25kg果糖12.5kg氯化鈉 2.25kg注射用水適量全量250L二.制備工藝(1000瓶)a.取50L注射用水，加入處方量的甘油、果糖與氯化鈉，攪拌使其溶解；b.再按體積加入0.1％(w/v，50g)的針劑用活性炭，充分?jǐn)嚢?，并加熱至約70℃，攪拌30分鐘，趁熱粗濾脫炭；放冷至室溫；c.補(bǔ)加注射用水至近全量，測定溶液的pH值和含量，使pH值控制4.0～5.0之間；d.用0.22μm微孔濾膜反復(fù)過濾，至溶液澄清；e.濾液按每瓶250ml灌裝于250ml無色透明的輸液瓶中，加滌綸薄膜，加塞，扎鋁蓋；f.于115℃熱壓滅菌30分鐘；g.按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)；h.檢驗(yàn)合格的產(chǎn)品進(jìn)行包裝，即得甘油果糖注射液成品。
實(shí)施例2一、處方研究(500瓶)甘油25kg果糖12.5kg
具體包括如下步驟A根據(jù)親和型特異選擇性生物傳感器IAsys plus(Affinity-sensor IAsys plus)樣品池的包被流程，將LPS或Lipid A包被在樣品池中，并計(jì)算包被的LPS或LipidA的量，具體如下①儀器包被溫度設(shè)定為20℃～25℃，攪拌速率設(shè)定為80次/秒～100次/秒；②放入樣品池，異丙醇清洗；③PBS/AE清洗，然后異丙醇清洗；④加入1～2mg/ml的LPS或Lipid A氯仿溶液10～30μl，留置1～2min；⑤PBS/AE清洗，然后0.1～0.2M HCl清洗，留置1min；⑥PBS/AE清洗，然后10mM NaOH清洗，留置1～2min；⑦PBS/AE清洗，計(jì)算包被值；⑧1.0～2.0mg/ml BSA 90～120μl，保留5～10min；PBS/AE清洗，保留1～2min；⑨檢查包被后的共掁圖形；在樣品池中包被LPS或Lipid A；B回收與Lipid A或者LPS結(jié)合的物質(zhì)①將赤芍5～10μl提取液加入樣品池；②與Lipid A或者LPS的結(jié)合、解離反應(yīng)；③分別用親合反應(yīng)液反復(fù)沖洗，鹽酸溶液梯度洗脫，平衡后吸出再生反應(yīng)液；④回吸收的再生反應(yīng)液用NaOH調(diào)至pH接近7.0后，冷凍抽干，作為下一步分離的參考標(biāo)準(zhǔn)品；C離子交換柱或硅膠柱流出組份與Lipid A或者LPS結(jié)合①pH8～9的赤芍提取液靜置2～3小時(shí)后離心棄上清；②沉淀加入pH6.0～7.0的PBS復(fù)溶；③HCl滴定調(diào)整pH值為6.0～6.5；④靜置2～3小時(shí)后離心收集上清；⑤過離子交換柱或硅膠柱層析，收集與Lipid A或者LPS具有高結(jié)合活性的組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，低溫冷凍抽干即得到與Lipid A或者LPS高結(jié)合的中草藥活性成分。
D高效液相色譜分離與制備將所得到的中草藥活性成分用高效液相色譜法進(jìn)行進(jìn)一步的分離，收集與Lipid A或者LPS具有高結(jié)合活性的組分，對所得到的組分進(jìn)行純度和質(zhì)譜檢測，如不是單一的化合物，則用同法進(jìn)行進(jìn)一步的分離，直至得到單一的活性物質(zhì)。
將LPS的活性中心Lipid A包被于生物傳感器(Affinity-Sensor IAsys plus)的樣品池作為固定相配基，以明確能夠結(jié)合Lipid A的中草藥提取物為流動(dòng)相，使固定相的Lipid A陰離子基團(tuán)與中草藥提取物中提取液中的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的陽離子基團(tuán)通過靜電勢作用實(shí)現(xiàn)結(jié)合，通過特異性的洗脫、回收，重新得到高純度的能夠治療某種疾病的中草藥，并以此建立了定向分離、純化能夠與Lipid A特異性結(jié)合的化學(xué)物質(zhì)的技術(shù)平臺。
光學(xué)生物傳感器技術(shù)的原理是利用光學(xué)原理，在生物傳感器的樣品池表面包被固相受體，當(dāng)受體與其流動(dòng)相的配體發(fā)生結(jié)合作用時(shí)，以共振角度進(jìn)入光線衰減區(qū)的激光就會發(fā)生共振角度的改變，這一變化通過計(jì)算機(jī)FASTplot和FASTfit程序處理后就可以檢測到傳感器表面受體與其配體分子之間的相互作用及親合力，通過特異性的洗脫及回收，即可得到純度極高的配體分子。
通過對赤芍提取液中各組分與Lipid A結(jié)合活性的跟蹤檢測，分離得到三個(gè)與Lipid A具有高親合力的單體化合物；結(jié)構(gòu)分析明確了其中一個(gè)的結(jié)構(gòu)為1，2，3，4，6-O-五沒食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloyglucose，PGG)，其結(jié)構(gòu)式為 雖然PGG不是一個(gè)新的化合物，但是對其生物學(xué)活性研究表明①PGG與LipidA具有較高的親合力，其Kd值為3.2×10-6M；②PGG在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對LPS均具有較強(qiáng)的中和作用，并能夠顯著抑制由LPS介導(dǎo)的TNF-α和/或IL-6的釋放；③PGG對LD100LPS攻擊動(dòng)物具有顯著的保護(hù)作用，并呈明顯量效關(guān)系。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，采用如下技術(shù)方案①按照Thermo公司生物傳感器操作說明，將Lipid A包被于生物傳感器的樣品池，由于Lipid A具有親水端和疏水端，當(dāng)Lipid A包被在樣品池表面形成脂質(zhì)單分子層后，其疏水的脂肪酸被固定于樣品池表面，而親水端外露，用于和配體結(jié)合；根據(jù)包被圖形即可知道的包被量，即建立中草藥的篩選靶點(diǎn)。②以此包被的外露親水端，從具有拮抗內(nèi)毒素作用的中草藥提取液內(nèi)垂釣與Lipid A結(jié)合的物質(zhì)，并選擇0.01N的HCl做為特異性洗脫液，回收到微量與Lipid A較高結(jié)合的物質(zhì)。雖然與lipid A結(jié)合的成分不只一種，但是通過特異性的梯度洗脫，便可能得到純度較高、結(jié)合力較高的結(jié)合組分。③通過對回收物進(jìn)行再次的結(jié)合反應(yīng)測定、LPS中和試驗(yàn)和紫外掃描，得到了對所需物質(zhì)的初步吸收峰值，特別是對活性基團(tuán)吸收峰值的確定，為下游的硅膠柱層析和高效液相色譜(HPLC)制備提供參考標(biāo)準(zhǔn)。④硅膠柱層析和HPLC分離單體化合物，得到并明確一個(gè)與Lipid A具有高親合力的單體化合物PGG。在每一步單體成份的的分離過程中，都可以利用與待分離成份與Lipid A的親合力以監(jiān)控該成份的存在的部位。
本發(fā)明還通過補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)測定PGG與LPS的結(jié)合、中和活性；PGG對LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和/或IL-6的抑制；PGG對LD100LPS攻擊動(dòng)物具有顯著的保護(hù)作用，研究其用于治療膿毒癥。
以Lipid A為靶點(diǎn)，從中草藥中篩選、垂釣，并定向分離拮抗LPS活性的中草藥單體物質(zhì)，具有簡便、快捷、穩(wěn)定可靠的優(yōu)點(diǎn)，目前國內(nèi)外尚未見類似的研究。
本發(fā)明相對于傳統(tǒng)方法具有以下有益效果，①省時(shí)傳統(tǒng)方法判定一個(gè)物質(zhì)的抗LPS功能最少需要約60分鐘，本發(fā)明最多需10分鐘。②省力對測定的物質(zhì)不需要特殊處理。③特異性強(qiáng)即只選擇與LPS/Lipid A結(jié)合的物質(zhì)。④結(jié)果準(zhǔn)確由于中草藥化學(xué)成份復(fù)雜，對鱟試劑反就產(chǎn)生干擾，假陰性、假陽性高，本發(fā)明不需要其它的成份，特異性高，因此結(jié)果準(zhǔn)確。⑤實(shí)時(shí)監(jiān)控傳統(tǒng)的單體分離由于不能建立特異性的篩選、分離靶點(diǎn)，因此有時(shí)需要最后才能進(jìn)行結(jié)果判定，而本方法可以隨時(shí)取樣測定與LPS/Lipid A親合力。同時(shí)由于可以微量回吸收與LPS/Lipid A結(jié)合的成份進(jìn)行分析，為下游分離工作提供了指導(dǎo)。而傳統(tǒng)的方法在分離的早期是無法達(dá)到這一目的。

圖1.LPS O55B5在樣品池中的包被曲線圖2.Lipid A在樣品池中的包被曲線圖3.42種中草藥提取液與Lipid A的結(jié)合反應(yīng)4.生物傳感器回吸收物與Lipid A和結(jié)合5.生物傳感器回吸收物的紫外掃描結(jié)果圖6.回吸收物與LPS O111B4混合后的紫外掃描結(jié)果圖7.LPS O111B4的紫外掃描8.硅膠柱流出組分與Lipid A結(jié)合9.硅膠柱分離的10-15組分色譜制備10.HPLC制備物與Lipid A的結(jié)合11.HPLC制備42min流出峰的紫外掃描結(jié)果圖12. 42min化合物的紅外光譜圖13. 42min流出組分的質(zhì)譜圖-1圖14. 42min流出組分的流出組分的質(zhì)譜圖-2圖15. 42min流出組分的核磁共振圖譜圖16.PGG和Lipid A的FASTfit解離常數(shù)計(jì)算17.PGG對LPS的中和作用圖18.PGG對細(xì)胞活力的影響圖19.PGG對LPS攻擊小鼠的保護(hù)作用具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明。
實(shí)施例1樣品池的包被1.1實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)Thermo公司樣品池的包被流程，將LPS及Lipid A包被在樣品池中，并計(jì)算包被的LPS和Lipid A的量。具體步驟如下①儀器包被溫度設(shè)定為22℃，攪拌速率設(shè)定為85次/sec，數(shù)據(jù)采集設(shè)定為2次/sec；②放入樣品池，異丙醇清洗，收集數(shù)據(jù)曲線1min；③PBS/AE清洗，采集數(shù)據(jù)10min；異丙醇清洗，采集數(shù)據(jù)曲線1min；④加入2mg/ml的LPS氯仿溶液20μl，留置1min；⑤PBS/AE清洗，采集數(shù)據(jù)5min；0.1M HCl清洗，留置1min；⑥PBS/AE清洗，采集數(shù)據(jù)5min；10mM NaOH清洗，留置1min；⑦PBS/AE清洗，采集數(shù)據(jù)5min，計(jì)算包被值；⑧1.5mg/ml BSA 90μl，保留5min；PBS/AE清洗，保留1min；⑨檢查包被后的共掁圖形；⑩同法在樣品池中包被Lipid A。
1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果包被后的共掁圖像為對稱的單峰圖形，證明所包被的LPS在樣品池中分布均勻，見圖1、圖2。A、B兩點(diǎn)間差的絕對值即為LPS O55B5和LipidA在樣品池中的包被量，分別為183.2和251arc second，符合實(shí)驗(yàn)要求。
實(shí)施例242種中草藥提取液與Lipid A的結(jié)合反應(yīng)測定結(jié)果2.1實(shí)驗(yàn)方法制備42種中草藥提取液，分別取5μl上樣，測定其與Lipid A的結(jié)合反應(yīng)，檢測方法同上。
2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果赤芍、金銀花、烏梅等10種中草藥與Lipid A具有高親合結(jié)合的能力(RU結(jié)果＞90arc second)。圖3的結(jié)果顯示，中草藥與Lipid A結(jié)合存在較大的差異，(RU10.54arc second～1204.1arc second)，說明可能這些中草藥的抗LPS作用存在較大的差異，其中赤芍與Lipid A具有相當(dāng)強(qiáng)的特異性結(jié)合能力。
實(shí)施例3赤芍抗LPS單體的分離研究3.1回收與Lipid A結(jié)合的物質(zhì)3.1.1實(shí)驗(yàn)方法赤芍5μl提取液加入樣品池，經(jīng)過與Lipid A的結(jié)合、解離反應(yīng)后，分別再用親合反應(yīng)液反復(fù)沖洗，鹽酸溶液梯度洗脫，平衡后吸出再生反應(yīng)液，0.1N的HCl再生反應(yīng)，回吸收的再生反應(yīng)液加入NaOH，冷凍抽干。
3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用生物傳感器的回收功能，通過非特異的洗脫去除無效組分，再經(jīng)特異性的梯度洗脫，將與Lipid A結(jié)合的物質(zhì)從樣品池表面洗脫下來，最后將各梯度洗脫組分再次進(jìn)行與Lipid A的結(jié)合測定，結(jié)果顯示0.01N的Hcl特異性洗脫液回收的物質(zhì)(其中主要含有酸堿中和后的鹽成分)與Lipid A結(jié)合的RU最高，見圖4。
3.2回收與lipidA結(jié)合物質(zhì)的紫外掃描3.2.1實(shí)驗(yàn)方法回吸收物用去熱原水溶解后，以去熱原水為參照，進(jìn)行190nm～1100nm的全波段紫外掃描，觀察其紫外吸收峰。同時(shí)將回吸收物加入等體積的0.05EU/ml LPS標(biāo)準(zhǔn)品LPS O111B4，37℃水浴30min，以LPS為參照，再次測定紫外吸收峰。
3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果紫外掃描吸收峰值為200.4、215.1、276.8nm，結(jié)果見圖5；在該樣品內(nèi)加入LPS標(biāo)準(zhǔn)品后，其紫外吸收峰值為206.2、247.3、975.5，見圖6；單純的LPS O111B4標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收峰值為975.5nm，見圖7。這提示回吸收物與LPS結(jié)合后，其276.8nm吸收峰消失，而出現(xiàn)了247.3nm的新吸收峰，提示回吸收物與LPS作用與其自身的276.8nm吸光基團(tuán)有關(guān)，因此276.8nm的吸收峰可能是其活性中最重要的吸收峰，可做為該活性物質(zhì)的示蹤基團(tuán)。
3.3硅膠柱流出組份與lipidA結(jié)合情況3.3.1實(shí)驗(yàn)方法赤芍提取液(pH8)靜置2小時(shí)后離心棄上清，沉淀加入pH6.0的PBS復(fù)溶，HCl滴定調(diào)整pH值為6.2，靜置2小時(shí)后離心，沉淀再用1/4上清體積pH6的PBS復(fù)溶(1N的HCl調(diào)節(jié))，合并兩次上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，低溫冷凍抽干。
3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果在實(shí)驗(yàn)中顯示，赤芍提取液用NaOH沉淀后，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)沉淀物中含有與lipid A高結(jié)合的物質(zhì)。其中以pH值8沉淀最為理想。沉淀物通過硅膠層析后，其流出組份分部收集，測定與lipidA的結(jié)合。硅膠柱洗脫液共收集115管，合并相同的Rf值，得到12個(gè)不同的組分(由于柱層析分離更充分，因此其分離出的組分要較薄層層析所觀察到的實(shí)際組分多)，經(jīng)生物傳感器檢測顯示，5-10、10-15、21-25、31-35、110-115等組分均與Lipid A有一定的結(jié)合，其中以10-15組分最高，其紫外掃描結(jié)果與回收物的紫外掃描結(jié)果類同。結(jié)果見圖8。
3.4高效液相色譜分離與制備3.4.1實(shí)驗(yàn)方法①色譜分離與Lipid A結(jié)合最高RU的組分用60％甲醇配制成0.5mg/ml濃度，進(jìn)樣檢測波長275nm，進(jìn)行色譜分離。②色譜制備色譜柱柱溫25℃，流速15ml/min，進(jìn)樣濃度200mg/ml，進(jìn)樣體積200μl，根據(jù)流出峰進(jìn)行收集，負(fù)壓抽干。PBS配制成1mg/ml濃度，上樣，生物傳感器測定與Lipid A結(jié)合。
3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果硅膠柱分離的10～15組分經(jīng)過色譜分離，以乙腈為流動(dòng)相在18％的條件下，分離的效果較好，以此為條件進(jìn)行色譜制備，見圖9。將色譜制備的樣品冷凍抽干后，經(jīng)生物傳感器檢測顯示，42min、75min、100min、68min等流出峰與Lipid A具有一定的結(jié)合，其中以42min的RU最大，結(jié)果見圖10。
3.5結(jié)構(gòu)分析3.4.1實(shí)驗(yàn)方法將與Lipid A結(jié)合力最高的組分進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜和核磁共掁進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。
3.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果①紫外掃描42min流出組分進(jìn)行紫外掃描，其吸收峰分別為199.2、214.9、276.8nm，通過三種化合物的紫外吸收峰值比較；提示它具有相同的紫外吸收基團(tuán)。結(jié)果見圖11-14②紅外光譜對42分鐘化合物的紅外光譜分析結(jié)果如下，結(jié)果見圖12。
③質(zhì)譜42min的質(zhì)譜圖如圖13-14。
④核磁共掁譜見圖15。
⑤質(zhì)譜及核磁共掁分析如下42min化合物的質(zhì)譜分析結(jié)果為分子離子峰的m/e＝942.0，粹片離子峰解析MS-FAB(neg.)m/z771[M-153-H20]-，175.0[M-765-H]-，分子量為940，與1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰-β-D-葡萄糖(C41H32O26)分子量相符。
42min的核磁共掁譜見圖15。分析結(jié)果為該樣品的核磁共振譜測試在氘代甲醇中進(jìn)行。[α]D+41°(c，0.30，MeOH)，氫譜在6.89ppm與7.10ppm之間有5個(gè)單峰，其積分值表明每個(gè)峰代表2個(gè)質(zhì)子，應(yīng)為對稱取代的苯環(huán)上的質(zhì)子。而另外5組峰則來自于?；摩?葡萄糖，分別為δ6.22(d，J＝8.4Hz，H-1)，5.89(t，J＝8.4Hz，H-2)，5.61(t，J＝9.5Hz，H-4)，5.58(dd，J＝8.4，9.8Hz，H-3)，4.51(dd，J＝12，1.7Hz，H-6)，4.39(m，H-5，H-6’)。碳譜中，葡萄糖的C-1的化學(xué)位移為93.84ppm，與普通的葡萄糖相比，向高場位移了許多，這是由于1位和2位OH被?；鸬模渌荚拥幕瘜W(xué)位移分別為74.44，74.13，72.22，69.84，63.14。而在100～170ppm范圍，有5組共振峰，而每一組都包含5個(gè)峰，這些共振峰為沒食子酸的譜峰，其中167ppm附近的一組峰為羰基峰，146，140，120，110附近的4組峰則分別對應(yīng)于苯環(huán)上的C-3和C-5，C-4，C-1，C-2和C-6。
綜合以上紅外光譜分析結(jié)果、質(zhì)譜及核磁共掁譜，通過與文獻(xiàn)比較，可以確證該化合物為1，2，3，4，6-O-五沒食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloylglucose，PGG)。其結(jié)構(gòu)式為
實(shí)施例4PGG的體外拮抗LPS作用研究4.1PGG與Lipid A的親合力測定4.1.1實(shí)驗(yàn)方法分別以不同濃度的PGG為流動(dòng)相，與樣品池包被Lipid A進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，具體方法見第一部分，并通過FASTplot和FASTfit作圖，測定其解離平衡常數(shù)(KD)。
4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果PGG與LPS的活性中心Lipid A具有較高的結(jié)合親合力，其KD值為3.2×10-6M，見圖16。
4.2GPP對LPS的LPS中和實(shí)驗(yàn)4.2.1實(shí)驗(yàn)方法將不同濃度的PGG與定量的LPS標(biāo)準(zhǔn)品LPS O111B4等體積混合，配成終濃度為PGG 8、4、2、1、0μg/ml和LPS標(biāo)準(zhǔn)品0.1EU/ml，37℃孵育30分鐘后，測定中和后的LPS值，結(jié)果以EU/ml報(bào)告，并計(jì)算中和率LPS中和率＝(總LPS實(shí)測值-中和后LPS實(shí)測值)/總LPS實(shí)測值。
4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果PGG能夠呈劑量依賴性地抑制LPS催化的鱟試劑凝集反應(yīng)，PGG在8、4、2、1μg/ml的濃度能夠中和78.5％、75.4％、35.8％、24.9％的LPS活性，顯示了較強(qiáng)的LPS中和作用(圖17)。
4.3對LPS刺激的人外周血單核細(xì)胞(hPBMC)釋放TNF-α和IL-6的抑制作用4.3.1實(shí)驗(yàn)方法①量效作用培養(yǎng)4h后的hPBMC加入終濃度為100ng/ml的LPS O111B4，并同時(shí)加入不同終濃度的PGG，以LPS 100ng/ml陽性對照，以加入PBS為陰性對照，4h后取上清，ELISA法測定TNF-α和IL-6。②時(shí)效作用培養(yǎng)4h后的hPBMC，分別于100ng/ml的LPS O111B4加入的前20、10min(表示“-”)、同時(shí)加入及后10、20min(表示“+”)加入終濃度為80μg/ml的PGG，以LPS 100ng/ml陽性對照，以加入PBS為陰性對照，4h后，取上清，ELISA法測定TNF-α和IL-6。
4.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果①量效作用PGG能夠呈劑量依賴性地抑制LPS刺激的TNF-α和IL-6釋放(表1)。②時(shí)效作用PGG在LPS刺激前20、10min加入培養(yǎng)細(xì)胞，對TNF-α和IL-6均有顯著的抑制作用；在10min內(nèi)加入，雖仍能顯著抑制TNF-α和IL-6的分泌(p＜0.05)，但作用要顯著弱于同時(shí)加入的0時(shí)相點(diǎn)(p＜0.05)；但是當(dāng)在LPS作用細(xì)胞20min后加入，其抑制效果明顯降低，與LPS對照組比較已無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；結(jié)果見表2。
表1PGG對LPS刺激的hPBMC釋放TNF-αe和IL-6影響的量效作用

*，p＜0.05vs LPS；**，p＜0.01vs LPS表2PGG對LPS刺激的hPBMC釋放TNF-α和IL-6影響的時(shí)效作用

*，p＜0.05 vs LPS；**，p＜0.01 vs LPS；◆，p＜0.05 vs 0min；
4.4PGG對細(xì)胞活力影響的測定(MTT法)4.4.1實(shí)驗(yàn)方法hPBMC加入不同濃度的PGG培養(yǎng)2h，離心去上清，每孔加入200μl新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液，再加入20μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h后離心去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，振蕩10min，酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
4.4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果此濃度的PGG對細(xì)胞的活性不產(chǎn)生影響，見圖18。
4.5PGG對致死劑量LPS攻擊小鼠的保護(hù)作用4.5.1實(shí)驗(yàn)方法NHI小鼠100只，雌雄各半，分為PGG對照組、LPS對照組及PGG 20、40、80mg/kg三個(gè)劑量處理組，每組各20只。PGG對照組由尾靜脈注射80mg/kg的PGG；LPS對照組注入20mg/kg的LPS O111B4及生理鹽水100μl/20g；PGG處理組于LPS注入后立即分別注射20、40、80mg/kg的PGG，每只動(dòng)物液體注入總量為200μl/20g。分別于8、16、24、48、72h觀察動(dòng)物的存活情況。
4.5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果20mg/kg的LPS攻擊小鼠后，LPS組小鼠在8小時(shí)即開始出現(xiàn)死亡，大部分動(dòng)物集中在8～16h內(nèi)死亡，24h后LPS組動(dòng)物已全部死亡；PGG組動(dòng)物在8～16h小時(shí)也出現(xiàn)動(dòng)物死亡，但動(dòng)物的死亡數(shù)量較少，死亡時(shí)間也明顯延遲，24h后動(dòng)物基本上不再死亡。不同劑量的PGG 72h保護(hù)率分別為25％、45％(p＜0.05)、70％(p＜0.01)。說明PGG具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果見圖19。
權(quán)利要求
1.一種從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，包括如下步驟①應(yīng)用生物傳感器技術(shù)，將病原分子包被于生物傳感器的樣品池作為固定相配基，使病原分子結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要生物學(xué)作用的基團(tuán)外露，以此作為與中草藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點(diǎn)；②以中草藥提取物為流動(dòng)相，使該中草藥提取物中的活性物質(zhì)與固定相的病原分子結(jié)合，篩選能夠與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的中草藥；③將篩選出的與病原分子具有較強(qiáng)結(jié)合活性的中草藥提取物，經(jīng)吸附柱層析或者高效液相色譜(HPLC)方法或者兩種方法相結(jié)合進(jìn)行分離，對所得到的不同組分再次通過生物傳感器進(jìn)行結(jié)合活性檢測，即可得到能與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的活性組分或活性物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述生物傳感器為親和型生物傳感器。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述生物傳感器為親和型特異選擇性生物傳感器IAsysPlus(Affinity-sensor IAsys plus)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述吸附柱層析為離子交換柱層析或者硅膠柱層析。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述病原分子為致炎病原分子內(nèi)毒素(LPS)或類脂A(Lipid A)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，所述病原分子為肽聚糖或細(xì)菌基因組DNA(CpG DNA)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述作為流動(dòng)相的中草藥為具有抗炎作用的中草藥，其抗炎基礎(chǔ)在于本身含有可與病原分子結(jié)合的活性組分，所述活性組分通過靜電勢作用實(shí)現(xiàn)與所述病原分子發(fā)生特異性結(jié)合作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述中草藥為赤芍、地丁、阿膠、桅子、枳實(shí)、大黃、射干、青果、烏梅、白鮮皮、金銀花等84種中草藥中一種或一種以上的組合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，其特征在于，所述中草藥提取物為水和/或乙醇提取液。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法，包括如下步驟①應(yīng)用生物傳感器技術(shù)，將類脂A(Lipid A)包被于親和型特異選擇性生物傳感器IAsys Plus(Affinity-sensor IAsys plus)的樣品池作為固定相配基；使類脂A(Lipid A)結(jié)構(gòu)上發(fā)揮重要生物學(xué)作用的陰離子基團(tuán)外露，以此作為與中草藥中治療疾病的活性物質(zhì)發(fā)生結(jié)合作用的靶點(diǎn)；②以中草藥提取液為流動(dòng)相，使所述中草藥提取液中的活性物質(zhì)與固定相的類脂A(Lipid A)陰離子基團(tuán)與中草藥提取液中的活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)中的陽離子基團(tuán)通過靜電勢作用實(shí)現(xiàn)結(jié)合，篩選能夠與類脂A(Lipid A)發(fā)生結(jié)合作用的中草藥赤芍；③將篩選出的與類脂A(Lipid A)具有較強(qiáng)結(jié)合活性的赤芍提取液，經(jīng)吸附柱層析和高效液相色譜(HPLC)方法進(jìn)行分離，對所得到的不同組分再次通過親和型特異選擇性生物傳感器IAsys Plus(Affinity-sensor IAsys plus)進(jìn)行與類脂A(Lipid A)的結(jié)合活性檢測，即可得到能與類脂A(Lipid A)發(fā)生結(jié)合作用的活性組分或活性物質(zhì)。
11.一種如權(quán)利要求1所述的方法制備的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括活性物質(zhì)1，2，3，4，6-O-五沒食子酰-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-β-D-pentagalloylglucose，PGG)，其結(jié)構(gòu)式為
12.權(quán)利要求11所述的藥物組合物在制備治療膿毒癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種從中草藥中篩選、分離活性組分或活性物質(zhì)的方法及其藥物組合物和在治療膿毒癥中的應(yīng)用，應(yīng)用生物傳感器技術(shù)，將病原分子包被子生物傳感器的樣品池作為固相配基，以中草藥提取物為流動(dòng)相，使該中草藥提取物中的活性物質(zhì)與固定相的病原分子結(jié)合，篩選能夠與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的中草藥，將篩選出提取物經(jīng)吸附柱層析和高效液相色譜(HPLC)方法進(jìn)行分離，對所得到的不同組分再次通過生物傳感器進(jìn)行結(jié)合活性檢測，得到能與病原分子發(fā)生結(jié)合作用的活性組分或活性物質(zhì)。如以LPS的活性中心Lipid A為固定相配基，通過對赤芍提取液與Lipid A的結(jié)合反應(yīng)檢測，篩選、分離活性物質(zhì)1，2，3，4，6－O－五沒食子酰－β－D－葡萄糖(PGG)，并將其用于制備治療膿毒癥藥物組合物中的應(yīng)用。該方法具有省時(shí)、省力、特異性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號A61P31/00GK1864702SQ20051007067
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者鄭江, 呂根法, 周紅, 郭毅斌, 曹紅衛(wèi), 王寧, 衛(wèi)國, 馮文曦 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院