專利名稱：一種內(nèi)酰胺類抗生素及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于抗生素領(lǐng)域，具體涉及一種內(nèi)酰胺類抗生素及其制備方法背景技術(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素是臨床中常用的抗生素。它們以其抗菌譜廣，抗菌效果明顯，療效確定而廣泛使用。目前存在的問題是由于長期廣泛使用，導(dǎo)致很多病菌，如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌等對現(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生了明顯的抗藥性，因此迫切需要研究開發(fā)新的抗生素，特別是具有全新分子結(jié)構(gòu)的抗生素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供一種內(nèi)酰胺類抗生素，它具有全新的分子結(jié)構(gòu)，而且對多種病原細(xì)菌具有很高的抑制活性。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種內(nèi)酰胺類抗生素的制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種內(nèi)酰胺類抗生素，命名為秦嶺霉素，具有如下的分子結(jié)構(gòu) 該抗生素的制備方法，包括下列步驟1.發(fā)酵(1)發(fā)酵菌種發(fā)酵菌種的分類命名為秦嶺鏈霉菌(Streptomyces qinlingnensis sp.nov)，于2005年5月30日保藏于“中國生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏登記號為CGMCC NO.1381。
(2)斜面培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH值7.2～7.4)于1×105Pa下滅菌30min，接菌后在28～32℃下培養(yǎng)4d；(3)種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基(葡萄糖5～10g，可溶性淀粉5～10g，牛肉膏5～10g，蛋白胨10～18g，氯化鈉5～8g，蒸餾水1000ml，pH值7.2)，用250ml的三角瓶每瓶分裝100ml，然后用1ml無菌水將斜面的秦嶺鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為1×106～1×107個/ml。每瓶加1ml孢子懸浮液，置于搖床上28～32℃培養(yǎng)24～36h；(4)發(fā)酵 采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基(小米10～30g加蒸餾水1000ml煮沸15min后濾去米粒，加入葡萄糖15～30g，碳酸鈣2～15g，氯化鈉5～12g，蛋白胨5～15g，pH值7.2～7.4)于1×105Pa下滅菌30min，分裝于250ml三角瓶，每瓶20～100ml。接種量10％(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速150～240r/min，28～32℃振蕩培養(yǎng)4～5d。
2發(fā)酵液處理(1)發(fā)酵液經(jīng)100～200目篩網(wǎng)過濾后，用HPD-600大孔吸附樹脂吸附，甲醇洗脫；(2)將甲醇洗脫液濃縮，進(jìn)行硅膠柱層析以三氯甲烷∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和純甲醇五種洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇＝8∶2的餾分，濃縮后放置過夜，析出一種β-內(nèi)酰胺抗生素的粗結(jié)晶；(3)將上述粗結(jié)晶用制備高效液相色譜純化，得到本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺抗生素的純品。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下述優(yōu)點1本發(fā)明的抗生素是國內(nèi)外未報道過的新化合物，而且具有全新的分子結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有的β-內(nèi)酰胺類抗生素包括青霉素類和頭孢霉素類，前者是一個四元雜環(huán)并聯(lián)一個五元雜環(huán)，后者是一個四元雜環(huán)并聯(lián)一個六元雜環(huán)，二者在雜環(huán)的同一位置都有一個羧基，而本發(fā)明的抗生素是由一個四元環(huán)并聯(lián)一個七元環(huán)組成，不含羧基，也不含其它取代基。
2本發(fā)明的抗生素具有廣譜抗菌性，抗菌活性明顯優(yōu)于青霉素。
3本發(fā)明的抗生素，其生產(chǎn)原料廉價易得，發(fā)酵及后處理工藝相對簡單。


圖1秦嶺霉素紫外光譜2秦嶺霉素紅外光譜3秦嶺霉素高分辨質(zhì)譜4秦嶺霉素1H NMR譜5秦嶺霉素13C NMR譜6秦嶺霉素gCOSY譜7秦嶺霉素gHSQC譜8秦嶺霉素Ghmbc譜圖具體實施方式
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作詳細(xì)說明。
實施例1化合物制備1發(fā)酵(1)種子培養(yǎng) 培養(yǎng)基(葡萄糖8g，可溶性淀粉8g，牛肉膏6g，蛋白胨15g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，pH值7.2)，用250ml的三角瓶每瓶分裝100ml，然后用1ml無菌水將斜面的秦嶺鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為1×106～1×107個/ml，每瓶加1ml孢子懸浮液，置于搖床上30±1℃培養(yǎng)24h；(2)發(fā)酵 采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基(小米10g加蒸餾水1000ml煮沸15min后濾去米粒，加入葡萄糖15g，碳酸鈣2g，氯化鈉5g，蛋白胨5g，pH值7.2)于1×105Pa下滅菌30min，分裝于250ml三角瓶，每瓶50ml。接種量10％(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速210r/min，30±1℃振蕩培養(yǎng)4d。
2化合物的分離50L發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用5kg HPD-600大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附3h，將吸附飽和的大孔吸附樹脂裝入15cm(內(nèi)徑)×200cm(高)的玻璃柱中，用甲醇洗脫，流速為50ml·min-1，洗脫總體積約20L；濃縮甲醇洗脫液，得到褐色油狀物約50g。將所得褐色油狀物上硅膠柱(粒徑200～300目)進(jìn)行層析，以三氯甲烷∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和純甲醇五種洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇＝8∶2的餾分，濃縮后放置過夜，析出一種β-內(nèi)酰胺抗生素的粗結(jié)晶1.65g；將該粗結(jié)晶以制備高效液相色譜純化，得到本發(fā)明的β-內(nèi)酰胺抗生素純品0.546g，其中制備液相色譜條件如下色譜柱Hypersil C18，15μm，6cm(內(nèi)徑)×300cm(高)；流動相甲醇+水＝75+25(V/V)；流速60ml/min；檢測波長230nm。
3結(jié)構(gòu)鑒定化合物1物態(tài)白色結(jié)晶熔點196℃；元素分析N 17.91％，C 54.78％，H 5.55％，O 21.76％；分子量154.0741；分子式C7H10N2O2；(1)化合物的UVmax為222nm，說明分子中存在內(nèi)酯或內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)；從紅外光譜圖中可觀察到內(nèi)酰胺的特征吸收峰1636.38cm-1，提示化合物為一內(nèi)酰胺。
(2)從FAB-MS譜圖上可觀測到m/z 155[M+H]+，309[2M+H]+峰，說明化合物的分子量應(yīng)為154。高分辨質(zhì)譜測得m/z 155[M+H]+為154.1219(計算值為154.0741)，說明其分子式為C7H10N2O2，不飽和度為4。
(3)化合物的1H NMR顯示存在9個質(zhì)子(CD3OD，400MHz，δ4.24(m，1H)，4.10(dd，J＝16.8，3Hz，1H)，3.73(d，J＝16.8Hz，1H)，3.53(m，2H)，2.30(m，1H)，1.89-2.05(m，3H))，表明還有一個活潑質(zhì)子存在，因使用氘代甲醇為溶劑而未觀測到。13C NMR顯示了7條譜線(100MHz，δ171.9，166.4，59.8，47.0，46.3，29.4，23.3)，與分子式吻合，DEPT表明171.9和166.4是兩個季碳，它們是酯或酰胺的羰基，59.8的碳是一個叔碳，其余4個均為仲碳，這樣共有9個與碳相連的質(zhì)子，與1HNMR結(jié)果一致。GCOSY顯示4.24的質(zhì)子與4.10的質(zhì)子相關(guān)，而4.10的質(zhì)子又與3.73的質(zhì)子相關(guān)，而在gHSQC譜中4.10的質(zhì)子和3.73的質(zhì)子同時與47.0的碳原子相關(guān)，說明它們是兩個同碳質(zhì)子。4.24的質(zhì)子還與2.30和2.00處的質(zhì)子相關(guān)，而他們又同時與29.4的碳原子相關(guān)，說明它們也是兩個同碳質(zhì)子。在gHSQC譜中，4.24的質(zhì)子與59.8的碳原子相關(guān)，3.53的質(zhì)子與46.3的碳原子相關(guān)，而1.89-2.05處的另兩個質(zhì)子與23.3的碳原子相關(guān)，且3.53的質(zhì)子與1.89-2.05處的另兩個質(zhì)子彼此相關(guān)，說明它們是兩個相鄰的碳原子上的質(zhì)子，因此尚有兩個羰基碳的信號未能指認(rèn)。由于分子中只有兩個氧原子并構(gòu)成結(jié)構(gòu)中的兩個羰基，所以不可能成酯(13C NMR中無80-60間的信號證實推斷是正確的)，唯一的可能是分子中存在兩個酰胺基團(tuán)。再根據(jù)不飽和度為4的事實，說明分子必須存在兩個環(huán)才能滿足要求。由于只有一個活潑質(zhì)子，說明一個酰胺氮原子上無質(zhì)子，與兩個取代基相連，在這種分子相對簡單的化合物中只有形成β-內(nèi)酰胺才能滿足此條件，而另一個酰胺氮原子與一個取代基相連。其GCOSY譜中4.24的叔碳質(zhì)子與4.10的質(zhì)子相關(guān)，而4.10的質(zhì)子又與3.73的質(zhì)子相關(guān)。在gHMBC譜中，166.4的羰基與4.24的叔碳質(zhì)子以及2.00的質(zhì)子相關(guān)，171.9的羰基與4.10和3.73的兩個同碳質(zhì)子相關(guān)，從而證實166.4的羰基是β-內(nèi)酰胺的四元環(huán)酰胺羰基，171.9的羰基則是另一個酰胺羰基。同時在gHMBC譜中，還觀測到59.8的碳原子與2.00和2.30的質(zhì)子相關(guān)，47.0的碳原子與4.24的叔碳質(zhì)子相關(guān)，46.3的碳原子與1.89-2.05處的兩個質(zhì)子相關(guān)，29.4的碳原子與相關(guān)4.24的叔碳質(zhì)子相關(guān)，以及23.3的碳原子與3.53的兩個質(zhì)子相關(guān)，從而證實了化合物1具有下面的分子結(jié)構(gòu)，命名為秦嶺霉素。

實施例2抗菌活性測定1.秦嶺霉素對常見細(xì)菌的抗菌活性測定秦嶺霉素抗菌活性測定采用管碟法。底層培養(yǎng)基為2％的瓊脂培養(yǎng)基，上層培養(yǎng)基為牛肉浸膏培養(yǎng)基。在每個培養(yǎng)皿中加入10ml底層培養(yǎng)基，冷凝后再將已融化冷至45℃左右的上層培養(yǎng)基(加入供試細(xì)菌)倒入已凝固的底層培養(yǎng)基表面，待冷凝后，放置牛津杯。在每個牛津杯中加入秦嶺霉素藥液0.2ml，每處理重復(fù)3次，清水作對照。在26±1℃溫箱中培養(yǎng)24h，測定抑菌圈直徑。結(jié)果如表1所示表1秦嶺霉素的抗菌活性

從表1可以看出，秦嶺霉素?zé)o論是對革蘭氏陽性菌(金色葡萄球菌、鏈球菌、蠟狀芽孢桿菌)，還是革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、沙門氏菌)都有顯著的抑制作用，在200mg·L-1濃度下，抑菌圈直徑在18.9～28.5mm之間。
2.秦嶺霉素和青霉素對蠟狀芽孢桿菌的抗菌活性比較采用管碟法(方法同上)，結(jié)果如表2所示
表2秦嶺霉素和青霉素對蠟狀芽孢桿菌的抗菌活性比較

在供試濃度范圍內(nèi)，抑菌圈半徑的平方與濃度的對數(shù)值呈直線函數(shù)關(guān)系。以濃度對數(shù)值(x)為自變量，以抑菌圈半徑的平方值(y)為依變量，從表2數(shù)據(jù)分別求出兩種抗生素的回歸方程y(秦嶺霉素)＝81.024x-74.949(r＝0.9674)y(青霉素)＝82.778x-106.24 (r＝0.9894)若要使抑菌圈直徑達(dá)到15mm，帶入上面方程，可求出秦嶺霉素的濃度需要144.29mg·L-1，青霉素的濃度需要310.09mg·L-1。這表明，對蠟狀芽孢桿菌，秦嶺霉素的抗菌活性是青霉素的21.5倍。
3.秦嶺霉素和青霉素對金色葡萄球菌的抗菌活性比較采用管碟法(方法同上)，結(jié)果如表3所示表3秦嶺霉素和青霉素對金色葡萄球菌的抗菌活性比較

在供試濃度范圍內(nèi)，抑菌圈半徑的平方與濃度的對數(shù)值呈直線函數(shù)關(guān)系。以濃度對數(shù)值(x)為自變量，以抑菌圈半徑的平方值(y)為依變量，從表3數(shù)據(jù)分別求出兩種抗生素的回歸方程y(秦嶺霉素)＝134.02x-142.20(r＝0.9632)y(青霉素)＝127.36x-209.56 (r＝0.9913)若要使抑菌圈直徑達(dá)到15mm，帶入上面方程，可求出秦嶺霉素的濃度需要64.14mg·L-1，青霉素的濃度需要269.52mg·L-1。這表明，對金色葡萄球菌，秦嶺霉素的抗菌活性是青霉素的4.21倍。
4.秦嶺霉素和青霉素對大腸桿菌的抗菌活性比較采用管碟法(方法同上)，結(jié)果如表4所示表4秦嶺霉素和青霉素對大腸桿菌的抗菌活性比較

在供試濃度范圍內(nèi)，抑菌圈半徑的平方與濃度的對數(shù)值呈直線函數(shù)關(guān)系。以濃度對數(shù)值(x)為自變量，以抑菌圈半徑的平方值(y)為依變量，從表4數(shù)據(jù)分別求出兩種抗生素的回歸方程y(秦嶺霉素)＝85.19x-110.63(r＝0.9508)y(青霉素)＝75.38x-126.18 (r＝0.9488)若要使抑菌圈直徑達(dá)到15mm，帶入上面方程，可求出秦嶺霉素的濃度需要296.81mg·L-1，青霉素的濃度需要1001.31mg·L-1·這表明，對大腸桿菌，秦嶺霉素的抗菌活性是青霉素的3.37倍。
權(quán)利要求
1.一種內(nèi)酰胺類抗生素，其特征在于該抗生素具有如下的分子結(jié)構(gòu)
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗生素的制備方法，其特征在于包括下列步驟(1)發(fā)酵菌株菌株的分類命名為秦嶺鏈霉菌(Streptomyces qinlingnensis sp.nov)，于2005年5月30日保藏于“中國生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏登記號為CGMCCNO.1381。(2)斜面培養(yǎng)采用高氏一號培養(yǎng)基(可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH值7.2～7.4)于1×105Pa下滅菌30min，接菌后在28～32℃下培養(yǎng)4d；(3)種子培養(yǎng)培養(yǎng)基(葡萄糖5～10g，可溶性淀粉5～10g，牛肉膏5～10g，蛋白胨10～18g，氯化鈉5～8g，蒸餾水1000ml，pH值7.2)，用250ml的三角瓶每瓶分裝100ml，然后用1ml無菌水將斜面的秦嶺鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液，使其濃度為1×106～1×107個/ml，每瓶加1ml孢子懸浮液，置于搖床上28～32℃培養(yǎng)24～36h；(4)發(fā)酵采用液體搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)基(小米10～30g加蒸餾水1000ml煮沸15min后濾去米粒，加入葡萄糖15～30g，碳酸鈣2～15g，氯化鈉5～12g，蛋白胨5～15g，pH值7.2～7.4)于1×105Pa下滅菌30min，分裝于250ml三角瓶，每瓶20～100ml；接種量10％(V/V)，搖床轉(zhuǎn)速150～240r/min，28～32℃振蕩培養(yǎng)4～5d；(5)發(fā)酵液處理發(fā)酵液經(jīng)100～200目篩網(wǎng)過濾后，用HPD-600大孔吸附樹脂吸附，甲醇洗脫；將甲醇洗脫液濃縮，進(jìn)行硅膠柱層析以三氯甲烷∶甲醇＝9∶1、8∶2、7∶3、6∶4和純甲醇五種洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集三氯甲烷∶甲醇＝8∶2的餾分，濃縮后放置過夜，析出內(nèi)酰胺抗生素的粗結(jié)晶；將上述粗結(jié)晶用制備高效液相色譜純化，得到權(quán)利要求1的內(nèi)酰胺抗生素的純品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述抗生素用于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其特征在于將所述抗生素用于抗革蘭氏陽性菌(金色葡萄球菌、無乳鏈球菌、蠟狀芽孢桿菌)、革蘭氏陰性菌(沙門氏菌、大腸桿菌)的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗生素——秦嶺霉素及其制備方法。本發(fā)明的秦嶺霉素屬于內(nèi)酰胺類化合物，具有如右圖所示的分子結(jié)構(gòu)，其產(chǎn)生菌分類命名為秦嶺鏈霉菌(Streptomyces qinlingnensis sp.nov)，于2005年5月30日保藏于“中國生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏登記號為CGMCC NO.1831。本發(fā)明的秦嶺霉素的制備方法包括種子培養(yǎng)和液體發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過濾后大孔吸附樹脂吸附，甲醇洗脫，再經(jīng)硅膠柱層析可得秦嶺霉素粗結(jié)晶。經(jīng)制備高效液相色譜純化可得純品。本發(fā)明的秦嶺霉素具有廣譜抗菌性，對多種病原細(xì)菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，優(yōu)于對照藥劑青霉素。
文檔編號A61P31/04GK1872854SQ20051007561
公開日2006年12月6日 申請日期2005年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月31日
發(fā)明者姬志勤, 吳文君, 龍建友, 師寶君, 祁志軍, 胡兆農(nóng) 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)藥研究所