專利名稱：一種小牛血去蛋白提取物注射液及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種注射液，尤其涉及一種小牛血去蛋白提取物注射液及其制備方法，屬于藥物領域。
背景技術：
小牛血去蛋白提取物(血活素)自1955年由瑞士素高藥廠開發(fā)研制成功以來，五十年來已在世界各國推廣應用。其注射液每毫升含有40～50毫克小牛血去蛋白提取物，其中30％為氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸及相對分子量為2500～3000的寡肽類物質(zhì)，70％是無機成分。小牛血去蛋白提取物可顯著提高網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)活力，提高酶活性，加速細胞的氧化磷酸化反應和ATP的合成，激活細胞呼吸，促進新陳代謝，加快組織再生。臨床上主要用于治療老年癡呆癥、急慢性腦血管等疾病，特別對中風、顱腦外傷等器質(zhì)性精神障礙，對脊髓的一些病癥和外周血管閉塞性疾病等具有良好療效，無毒且耐受性好。
目前，小牛血去蛋白提取物主要通過將小牛血濃縮、超濾或透析后制備而成，在關鍵的去蛋白工序中常由于步驟多，時間長，使有效成份丟損較多。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種小牛血去蛋白提取物注射液，該注射液制備工藝簡捷、有效成分含量高、生物活性高。
一種小牛血去蛋白提取物注射液，其特征在于每毫升該注射液中含有固形物41～60mg，該固形物中55％～65％重量為無機物，35％～45％重量為有機活性物質(zhì)。優(yōu)選地，該注射液中的無機物為選自K+，Na+，Cl-和Ca2+中的一種或其混合物，該注射液中的有機活性物質(zhì)為選自氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸，血多肽中的一種或其混合物。
本發(fā)明的小牛血去蛋白提取物注射液可以通過下列方法制備得到一種小牛血去蛋白提取物注射液，主要由以下方法制備而成1)將小牛血或血清按一個方向先快后慢旋攪后，取下攪拌漿上纏繞的膠狀團塊，向血漿中加入枸椽酸鈉攪勻后于0～4℃冷藏保存1～30小時，撇去表層油膜后，分出血球，收集血漿備用；2)將步驟1)中所得到的血漿通過珠狀殼聚糖層析柱，收集過柱后的血漿備用；3)向上述過柱后的血漿中加入乙醇，攪拌、離心除去蛋白沉淀，上清液在75～85℃下，定容回收乙醇，加入蛋白酶，酶解10～38h；4)向酶解液中加入0.4～0.6倍(V/V)蒸餾水，加熱至75～85℃，趁熱用事先活化好的殼聚糖改性活性炭柱過濾，濾液備用；5)將上述濾液濃縮后再一次通過改性活性炭柱，加壓下過微孔濾膜，灌裝熔封，熱壓滅菌，即得。
上述制備方法中，其中步驟1)中將小牛血或血清優(yōu)選用消毒后的表面粗糙的攪拌漿按一個方向先快后慢旋攪15～20min；步驟1)中向攪拌后的血漿中加入3％重量的枸椽酸三鈉于0～4℃冷藏保存12～30h，步驟2)中將血漿按1～3ml/min.cm2流速范圍通過珠狀殼聚糖層析柱；步驟3)中向過柱后的血漿中加入0.5倍量(v/v)95％的乙醇，離心除去蛋白沉淀，上清液在80℃下定容回收乙醇，優(yōu)選濃縮到與過柱前的血漿相同的體積再加入蛋白酶，酶解24h；步驟3)中加入蛋白酶的重量為上清液的1～3％，在45～50℃下酶解；步驟4)中向酶解液中加入0.5倍(V/V)蒸餾水，加熱至80℃再趁熱過柱；步驟5)中將濾液濃縮至2/3體積后再一次通過改性活性炭柱，加壓下過0.2um微孔濾膜。
本發(fā)明提取方法由于采用吸附的工藝，并有加入蛋白酶進行酶解這一有效降解蛋白步驟，可迅速有效的去除小牛血中所含的多種蛋白，所以本發(fā)明注射液中其有效成份的含量也相應有所提高，生物活性相對較高。
以下通過實施例來進一步描述本發(fā)明的有益效果，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的范圍。
具體實施例方式采集6個月小牛的靜脈血共10升，置消毒后廣口塑料桶中，用表面粗糙的攪拌槳順時針方向先快攪5min，然后慢攪10min，提起攪拌漿，瀝凈血漿，去掉攪拌槳上膠粘團塊；剩余血漿加30克枸櫞酸鈉攪勻，于4℃冷藏過夜，撇去表層油膜后，裝入離心管以3000r/min速度離心15min，分出血球，用雙層紗布濾出上層血漿約得9.5升；將血漿通過珠狀殼聚糖層析柱(血量∶殼聚糖量為10∶1)，流速控制在3ml/min.cm2，用500ml蒸餾水洗柱至流出液無色，得10升層析液；攪拌下向?qū)游龊蟮难獫{中加入5升95％的乙醇，攪拌15min，裝入離心管，以5000r/min速度離心15min，除去蛋白沉淀；上清液在80℃下回收乙醇5升，蒸餾液剩10升；蒸餾液轉(zhuǎn)移至水解罐中，降溫至45℃時，加入25克木瓜蛋白酶，攪勻，保溫水解24h；向水解液中加入5升蒸餾水稀釋，加熱至80℃，趁熱用事先于120℃活化4h的殼聚糖改性活性炭粉柱過濾。(液∶炭為10∶1)，濾液濃縮至10升，再次通過改性活性炭柱；用藥液泵將濾液壓過0.2um微孔濾膜，灌裝，2ml/支，熔封，115℃熱壓滅菌30min于4℃冰箱中保存。
采集6月齡小牛靜脈血15升，置消毒后的廣口瓶中，用表面粗糙的攪拌槳順時針方向快攪5min，然后慢攪10min，提起攪拌槳瀝凈血漿，去掉攪拌槳上的膠粘團塊，剩余血漿中加45克枸櫞酸鈉攪拌，于4℃冷藏過夜，次日晨撇去表層的油膜后，裝入離心管以3000r/min速度離心15min，用雙層沙布濾出上層血漿約得14.2升(截留血球)，將血漿過珠狀殼聚糖層折柱(血漿量∶殼聚糖為10∶1)，流速控制在2ml/min.cm2，加800ml蒸餾水從上方洗柱至流出液無色，得15升層折液。攪拌下向此層析后血漿中加入75升95％的乙醇，攪拌15min，裝入離心管，以5000r/min速度離15min，除去蛋白沉淀，上清液于85℃下回收乙醇7.5升，蒸餾液剩15升，將此蒸餾液轉(zhuǎn)移至水解罐中，待降溫至40℃時，加入胰蛋白酶45克，攪勻，保持40℃水解24h，向水解液中加入7.5升蒸餾水加熱至85℃趁熱用事先活化好的殼聚糖改性活性炭粉過濾。(液∶炭為10∶1)。濾液真空濃縮至15升，再次通過改性活性炭柱過濾，用藥液泵加壓過0.2um微孔濾膜，灌裝2ml/支，熔封，115℃熱壓滅菌30min后于4℃冰箱中保存。
采集6月齡小牛靜脈血20升，置消毒后的廣口瓶中，以表面粗糙的攪拌槳按方向快攪5min，然后慢攪l0min，提起攪拌槳控凈血槳，棄去槳上的膠粘團，瓶內(nèi)血槳中加60克枸椽酸鈉攪勻后于4℃冷藏12h以上，然后去除表層油膜后，裝入離心管，以3000r/min速度離心15min，用雙層紗布過濾，截留血球棄去，上清血漿得約19升，將此血漿通過珠狀殼聚糖層析柱吸附雜蛋白(血漿量∶殼聚糖為10∶1)流速控制在1ml/min.cm2取1升蒸餾水洗柱至流出液無色，得20升層析液。再邊攪拌邊向?qū)游龊蟮难獫{中加10升95％的乙醇，繼續(xù)攪15min后，裝入離心管，以5000r/min速度離心15min，濾除下部沉淀，上清液在75℃下回收乙醇至10升，所余蒸餾液為20升，轉(zhuǎn)移至水解罐中，降溫至40℃時，加入復合蛋白酶60克，攪勻，保溫40℃水解24h，向水解液中加入10升，蒸餾水加熱到80℃0.5h，趁熱用殼聚糖改性活性炭粉柱(先于120℃活化4h)過濾，(液∶炭為10∶1)，濾液真空濃縮至20升，再過一次改性活性炭柱，最后用藥液泵加壓下過0.2um微孔濾膜，灌裝，2ml/支，熔封，115℃熱壓滅菌30min，于4℃冰箱中貯存。
本發(fā)明注射液有效成分含量檢測一、試驗材料1、供試樣品本發(fā)明實施例1所制備的注射液。
2、對照樣品市售的小牛血去蛋白提取物注射液。
二、檢測方法1、檢測儀器萬分之一天平，氨基酸分析儀，稱重砰，真空泵，電烘箱，坩鍋，酒精燈。
2、檢測方法總固體含量精密量取樣品2ml至稱量砰中在53±3℃下真空干燥，至恒重(中國藥典2000版2部附錄VIII L)計算。
游離氯基酸取本品及標準氯基酸適量，用氯基酸分析儀進行分析。
無機鹽干燥總固體物用熾灼殘渣法，灰化以后稱重。小分子有機物總固體物的量減去無機鹽量，得到小分子有機物。
三、檢測結果樣品的各有效成分含量檢測結果見表1。
表1 本發(fā)明注射液有效成分含量檢測結果

檢測結果說明，本發(fā)明所制備的注射液含有較高的有效成分，與對照樣品相比，其有效成分的含量明顯要高于對照樣品。
本發(fā)明小牛血去蛋白提取液生物活性試驗本發(fā)明小牛血去蛋白提取液為細胞呼吸激活劑，能促進細胞對氧的攝取和利用。通過WARBURG微量呼吸檢壓儀測定其在豚鼠肝細胞中促進細胞呼吸的活力，由耗氧增加量計算其生物活性。測定小牛血去蛋白注射液樣品的生物活性，與市售小牛血去蛋白提取液樣品比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明小牛血去蛋白提取液的QO2(μl·O2/mg·h)均高于6.40，對照品的相應的數(shù)值均低于5.20。
權利要求
1.一種小牛血去蛋白提取物注射液，其特征在于每毫升該注射液中含有固形物41～60mg，其中該固形物中55％～65％重量為無機物，35％～45％重量為有機活性物質(zhì)。
2.根據(jù)權利要求1的小牛血去蛋白提取物注射液，其中所述的無機物選自K+，Na+，Cl-和Ca2+中的一種或其混合物。
3.根據(jù)權利要求1的小牛血去蛋白提取物注射液，其中有機活性物質(zhì)選自氨基酸、糖類、酮酸、嘌呤、核苷酸、血多肽中的一種或其混合物。
4.一種制備權利要求1的小牛血去蛋白提取物注射液的方法，包括以下步驟1)將小牛血或血清按一個方向先快后慢旋攪后，將膠狀團塊去掉，向攪拌后的血漿中加入枸椽酸鈉，攪勻后于0～4℃冷藏保存1～30h，撇去表層油膜后，分出血球，收集血漿備用；2)將步驟1)中所得到的血漿通過珠狀殼聚糖層析柱，收集過柱后的血漿備用；3)向上述過柱后的血漿中加入乙醇，攪拌、離心除去蛋白沉淀，上清液在75～85℃下定容回收乙醇，加入蛋白酶，酶解10～38h；4)向酶解液中加入0.4～0.6倍(V/V)蒸餾水，加熱至75～85℃，趁熱用事先活化好的殼聚糖改性活性炭柱過濾，濾液備用；5)將上述濾液濃縮后再通過改性活性炭柱，加壓下過微孔濾膜，灌裝熔封，熱壓滅菌，即得。
5.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟1)中將小牛血或血清用表面粗糙的攪拌漿按一個方向先快后慢旋攪15～20min。
6.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟1)中向攪拌后的血漿中加入3％重量的枸椽酸三鈉，攪勻后于0～4℃冷藏保存12～30h。
7.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟2)中將血漿按1～3ml/min.cm2流速范圍通過珠狀殼聚糖層析柱。
8.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟3)中向過柱后的血漿中加入0.5倍量(v/v)95％的乙醇，離心除去蛋白沉淀，上清液在80℃下定容回收乙醇，保留與過柱前的血漿相同的體積，加入蛋白酶，酶解24h。
9.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟3)中加入蛋白酶的重量為上清液的1～3％，在45～50℃下酶解。
10.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟4)中向酶解液中加入0.5倍(V/V)蒸餾水，加熱至80℃再趁熱過柱。
11.按照權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟5)中將濾液濃縮至2/3體積后再一次通過改性活性炭柱，加壓下過0.2um微孔濾膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的小牛血去蛋白提取物注射液及其制備方法，每毫升該注射液中含有固形物41～60mg，其中55％～65％重量為無機物，35％～45％重量為有機活性物質(zhì)；該注射液制備方法如下1)將小牛血或血清按一個方向先快后慢旋攪后，向血漿中加入枸椽酸鈉，攪勻后冷藏保存，分出血球，收集血漿備用；2)將血漿通過珠狀殼聚糖層析柱，加入乙醇，攪拌、離心除去蛋白沉淀，上清液定容回收乙醇，加入蛋白酶，酶解；3)向酶解液中加入蒸餾水，加熱后用殼聚糖改性活性炭柱過濾；4)將上述濾液濃縮后通過改性活性炭柱，加壓下過微孔濾膜，灌裝熔封，熱壓滅菌，即得。本發(fā)明制備工藝簡捷、成本低，所制備的注射液中含有較高的有效成份。
文檔編號A61K35/14GK1698653SQ20051007691
公開日2005年11月23日 申請日期2005年6月9日 優(yōu)先權日2005年6月9日
發(fā)明者趙紅梅 申請人:趙紅梅