專利名稱：具有協(xié)同作用的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥物組合物，具體地說，是一種含有天然植物提取物或單體的藥用組合物，用于治療和/或預防心腦血管疾病、糖尿病、老年癡呆癥，以及用于防止心腦血管疾病的復發(fā)。
背景技術：
隨著現(xiàn)代科學的高速發(fā)展，人們越來越重視“天然”藥物。近年來，醫(yī)藥界在防治心腦血管疾病、糖尿病等疾病的藥用植物研究方面做了諸多工作，加強了對生物活性物質(zhì)的分析和研究，以期進一步明確其功效。然而，取得的成效是有限的。這主要是由于心腦血管疾病、糖尿病等疾病的致病機理復雜，常伴有不同類別的一種或多種并發(fā)癥，已有的單一天然活性成分難以全方位奏效。
而且，大量不良反應報道的出現(xiàn)使人們認識到，天然藥物在發(fā)揮治療作用的同時也一樣具有副作用，人們由此而越來越重視這些天然植物藥物的安全性問題。例如，有報道(參見Rosenblatt M等，N Engl J Med 1997，3361108；Gianni L M等，USPharmacist 1998，23(5)80-86；Rowin J等，Neurology 1996，46(6)1775-6)表明，銀杏葉制品可與維生素E、阿司匹林等抗血小板聚集和抗血凝藥物發(fā)生潛在的相互作用，可導致出血、淤血或視覺變化等，甚至引起自發(fā)性雙側硬膜下血腫。另有報道(參見Hederson GL等，Life Sci 1999，65PL209-314；Anon等，Pharm J 2001，267(7157)79；康魯平，醫(yī)藥導報2004，23(12)974-6，中成藥，2005，27(5)520)表明，人參皂苷與經(jīng)CYP2C9和CYP3A4酶代謝的藥物合用時，可能會由于酶誘導作用而影響藥物療效和不良反應，而且人參皂也可與維生素E、阿司匹林等抗血小板聚集和抗血凝藥物發(fā)生潛在的相互作用，甚至某些品種的人參制品被禁止用于高血壓患者。
人們試圖采用多種天然藥物聯(lián)用的方式，以期通過它們之間的加合、甚至協(xié)同作用來減少用藥量，從而在確保(甚至提高)療效的同時進一步降低不良反應。遺憾的是，天然藥物的作用機理十分復雜，大多數(shù)天然藥物的藥物動力學參數(shù)、藥物代謝機制、作用機理均不清楚。因此，與化學藥品之間的相互作用相比，更難以預測天然藥物間的相互作用。以心腦血管領域常用的銀杏、人參和芍藥為例，雖然人們對它們之間的聯(lián)合給藥進行了廣泛研究(例如，中國專利申請ZL200310111065.5、ZL200310123995.2、ZL98110756.7)，但多著眼于不同組分針對不同癥狀的加和作用，即不同的藥物實際上是各自獨立地發(fā)揮著其原有的藥理活性，幾乎沒有有關協(xié)同作和/或降低毒副反應的報道。
本發(fā)明人注意到，在已有技術水平下，沒有關于銀杏與芍藥這兩種組分聯(lián)合應用的報道。李文軍(ZL200310110709.9)和董莉(醫(yī)藥論壇雜志2004，25(17)63-64)披露了人參、芍藥這兩種組分的聯(lián)合應用，但是依然沒有有關二者產(chǎn)生協(xié)同增效或減毒作用的報道。鑒于人參皂苷對某些疾病的冶療有賴于血漿有效濃度、并且有溶血等不良現(xiàn)象(孫光等，大連醫(yī)學院學報1996，16(2)107-110)，本發(fā)明人推測以銀杏代替人參與芍藥聯(lián)用，似乎是一種不錯的解決方案。但是，很明顯地，銀杏(主要含內(nèi)酯和黃酮)和人參(主要含皂苷)是組成和活性均不同的兩類藥物(參見ZL200310111065.5；鐘利群等，中華全科醫(yī)師雜志2003，2(4)251-252)，二者似乎是不可相互替代的。
更為不利的是，迄今為止，針對銀杏能否與芍藥聯(lián)合應用，二者的作用機制是加和、協(xié)同還是拮抗等基礎問題，已有技術沒有提供科學依據(jù)。至于二者是否能聯(lián)合用于其它疾病(例如糖尿病、老年癡呆癥)，已有技術甚至沒有類似的暗示或嘗試。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在這方面進行了有益的探索，并取得了喜人的結果。
本發(fā)明的一個目的在于提供于銀杏和芍藥在治療和/或預防心腦血管疾病、糖尿病、老年癡呆癥中的應用。
至于本發(fā)明藥物組合物的有益作用，首先是在治療糖尿病的過程中發(fā)現(xiàn)的。研究表明，糖尿病、尤其是其合并性病癥(例如糖尿病性冠心病)的發(fā)病率和死亡率均很高，而且糖尿病可導致心臟微血管病變、大血管病變、心肌病變、糖尿病自主神經(jīng)紊亂等危險疾病(北京醫(yī)學2003，25(2)84-85)。鑒于糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生機制非常復雜，學術界和臨床對此也存在爭議(J Am Coll Cardiol 2003，41(1)1-7；Intern Med 2003，42(7)554-9；Exp Clin Endocrinol Diabetes 2002，110(5)212-8；Biol Pharm Bull 2003，26(12)1668-73；山東醫(yī)藥2003，43(1)14-15)，尚無切實可行的治療方案(尤其是采用天然藥物的療法)，且有些降糖藥物之間的聯(lián)用反而加重其心血管病變的發(fā)生。
在此，我們發(fā)現(xiàn)本發(fā)明藥物組合對糖尿病及其心腦血管相關并發(fā)癥具有極好的治療效果。同時，本發(fā)明人大膽推測這是由于銀杏內(nèi)酯和芍藥苷作用于不同靶點，尤其是在不同病理階段發(fā)揮治療作用，發(fā)揮了藥物聯(lián)用的整體治療優(yōu)勢。上述藥物組合克服了已有藥物存在的作用單一、服藥量大等缺點，代表了天然藥物治療和預防糖尿病及其并發(fā)癥的新趨勢。
然而，二者聯(lián)用的有益效果并不僅局限于糖尿病及其并發(fā)癥中。在進一步的研究中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物組合物在心腦血管疾病(尤其是缺血性疾病)、老年癡呆癥的治療和/或預防中也表現(xiàn)出極好的治療效果。所述心腦血管疾病例如包括冠心病、腦卒中(也稱腦中風)、心肌梗塞，和所述老年癡呆癥包括阿爾茨海默病(簡稱AD)或腦血管性癡呆(簡稱VD)。
本發(fā)明的另一個重要發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明藥物組合物在防止心腦血管疾病復發(fā)方面的有益效果。心腦血管疾病是危害現(xiàn)代人健康的常見病和多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率和致殘率均很高。以腦梗死(缺血性腦卒中)為例，研究表明男性和女性患動脈粥樣化血栓性腦梗死5年的累計復發(fā)率，分別為42％和24％(Sacco RL等，Stroke 1982，13290-295)。尤為不利的是，復發(fā)性腦梗死的病死率、致殘率均高于首次發(fā)病(梁玉宏等，國外醫(yī)學腦血管疾病分冊1993，1155)。
當前，心腦血管疾病發(fā)病后的治療研究結果尚無法令人滿意，但已公認這類疾病是可以預防的疾病(Sacco RL等，Cerebrovasc Dis 1999，(增刊3)37-44)。按照干預措施介入的時間，預防可通常分為兩個階段“一級預防”，即對健康人群或存在心腦血管疾病危險因素、但尚無心腦血管疾病癥狀的人群開展預防。例如，一個人沒有發(fā)生冠心病，但其有可能導致冠心病的吸煙、嗜酒、高血壓、糖尿病等不利因素，針對這些不良嗜好、疾病加以治療，則可能防止或推遲冠心病的發(fā)生?！耙患夘A防”通常主要強調(diào)生活(行為)方式干預，而不倡導使用藥物干預；和“二級預防”，即對已出現(xiàn)心腦血管疾病癥狀，如短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)或已有缺血性卒中后癡呆發(fā)作史的病人開展預防，防止其再次發(fā)生同種疾病而采取的措施。在此，本發(fā)明術語“防止復發(fā)”是指“二級預防”。
雖然常規(guī)化學藥物例如阿司匹林等可在一定程度上實現(xiàn)有效預防，但是有相當?shù)木窒扌?，甚至失敗的案例也很?參見王少華等，鐵道醫(yī)學1999，27(2)136)，臨床上俗稱為“阿司匹林抵抗”。同時，阿司匹林增加機體出血(尤其是上消化道出血)的危險性，相當一部分患者使用受限。并且，最近有報道，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)綜合現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)認為，非甾體抗炎藥存在增加心血管不良事件的可能性。目前，在臨床實踐中，還沒有任何一種藥物可以同時具有上述藥理作用(特別是協(xié)同作用)，臨床醫(yī)生被迫選擇多種藥物同時使用。而同時使用種類繁多的藥物，很可能帶來藥物副作用的疊加(盡管報道很少，但臨床醫(yī)生實際應用藥物時難以決策，往往是顧及藥物副作用)。尤為不利的是，在眾多復發(fā)危險因素中，究竟哪一種危險因素對復發(fā)起著主要作用，也沒有明確結論，因此目前尚無一種藥物是以“一級預防”或“二級預防”作為主要活性/適應癥而上市的。
本發(fā)明人在此方面做了有益的嘗試和探索，而且取得了誘人的成果。動物實驗表明，銀杏和芍藥的組合在同時控制多個主要的復發(fā)危險因素方面表現(xiàn)出了出人意料的協(xié)同作用。鑒于時間及醫(yī)學論理學因素，我們只進行了有限數(shù)量的缺血性腦卒中“二級預防”臨床觀察試驗，但是已可以從中預測出本發(fā)明組合物在心腦血管疾病“一級預防”、尤其是“二級預防”臨床上的潛在應用前景。
根據(jù)試驗結果，并結合目前國際公認的心腦血管疾病“一級預防”、“二級預防”循證醫(yī)學證據(jù)，我們推測，本發(fā)明藥物組合物之所以能有效地防止了心腦血管疾病的復發(fā)，極有可能是在以下作用中表現(xiàn)出的協(xié)同作用①抗血小板聚集作用(抑制血小板的聚集與分泌，改變血小板和管內(nèi)皮細胞的前列腺素代謝途徑，使血管內(nèi)環(huán)境趨向防止血小板聚集、防止血栓形成及血管內(nèi)皮破損)；②調(diào)節(jié)血脂作用(使甘油三酯和總膽固醇降低，高密度脂蛋白稍增加，肝臟合成極低密度脂蛋白減少，這三種變化都能積極防止動脈硬化的發(fā)生)；③調(diào)節(jié)糖代謝作用(將糖尿病患者的血糖水平控制在理想范圍內(nèi)，改善脂肪代謝障礙，控制膽固醇的合成)；④抗氧化作用(激活人體內(nèi)的SOD，抑制自由基的作用，抑制脂質(zhì)過氧化物對體內(nèi)生物膜正常功能的破壞，減少動脈、尤其是小動脈的硬化機會)。
⑤調(diào)節(jié)血壓作用(降低血管的被動擴張，減少血管壁所受張力、通透性增加，防止血漿成分外滲；降低血管壁厚，改善其堅固性增加，防止出現(xiàn)平滑肌玻璃樣變性和壞死)；同時，鑒于心腦血管疾病二級預防的復雜性，本發(fā)明人期望不受任何理論的限制，所取得的有益效果皆由藥理藥效實驗證明。有利的是，動物實驗表明，本發(fā)明藥物組合物還表現(xiàn)出顯著的抗炎性反應作用施用本發(fā)明藥物后，受試動物的動脈粥樣硬化斑塊形成的受抑制程度，與其體內(nèi)炎性標志物CRP(或者MCP-1)的降低水平相平行，這明顯提示本發(fā)明藥物組合物通過抑制血管發(fā)生炎性反應，從而抑制了脂質(zhì)沉著引起動脈硬化的機會，降低了腦卒中復發(fā)或死亡的重要危險因素。上述發(fā)現(xiàn)結合臨床試驗結果，進一步驗證了本發(fā)明組合物在缺血性腦卒中“二級預防”方面的應用潛力。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供于銀杏和芍藥在制備用于防止心腦血管疾病復發(fā)的藥物中的應用。在臨床應用時，醫(yī)師可以根據(jù)患者的年齡、體制、嚴重程度等因素，制定個體給藥方案，例如給予1/5-1倍治療/預防有效量的本發(fā)明藥物組合物。眾所周知，長期口服給藥比較適于預防復發(fā)。
本發(fā)明銀杏內(nèi)酯、芍藥苷可以單獨的制劑形式供聯(lián)合給藥，也可以同時含有二者的產(chǎn)品形式提供。
因此，本發(fā)明的另一個目的在于提供用于含有銀杏內(nèi)酯和芍藥苷的藥用組合物，其中銀杏內(nèi)酯和芍藥苷的重量比例為0.05-10∶1，優(yōu)選0.05-5∶1、0.1-1∶1，和更優(yōu)選0.2∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1。
本發(fā)明組合物中，可以選擇藥味(例如芍藥)直接粉碎成粉末入藥，也可以相當于上述天然藥物材生藥量的提取物或其他形式入藥。因此，本發(fā)明藥物組合物的活性組成包括藥材原粉、脂或水溶性提取物、有效部位、或有效成分。例如，所述活性組成包括a)銀杏銀杏提取物(例如低級醇、丙酮、乙酸乙酯的銀杏葉提取物)，主要含有銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物(例如標準提取物Egb)，或銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏內(nèi)酯單體，或銀杏黃酮單體。其中，所述銀杏內(nèi)酯(Ginkgolides)是指含有各種銀杏萜類內(nèi)酯物質(zhì)(二萜內(nèi)酯A、B、C、M、J，倍半內(nèi)酯等)的混合物；“銀杏內(nèi)酯單體”是指上述萜類內(nèi)酯中各種內(nèi)酯類物質(zhì)的單體和/或其衍生物、或其化學修飾物、類似物。所述銀杏黃酮是指含有各種銀杏黃酮物質(zhì)(銀杏黃酮及其苷、總黃酮醇及其苷、雙黃酮、兒茶素等)的混合物；“銀杏黃酮單體”是指上述黃酮中各種黃酮類物質(zhì)的單體和/或其衍生物、或其化學修飾物、類似物。
b)芍藥芍藥(白芍、赤芍、川赤芍)的干燥根粉末，含有苷類化合物(優(yōu)選為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷)的提取物，或芍藥苷(Paeoniflorin)單體。另外，研究表明，同時含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷、丹皮酚(paenol)、丹皮酚原苷(paeonolide)、丹皮酚苷(paeoniside)、芍藥苷元(paeoniflorgenone)等的有效部位也是有益的。本領域技術人員可以理解的是，本發(fā)明芍藥苷類的來源并不局限于芍藥，含有芍藥苷類的同屬其他植物也可實現(xiàn)本發(fā)明，其提取和制備方法為已知技術，在此不作贅述。
可以采用現(xiàn)代提取和分離技術，以提高活性物質(zhì)的純度、盡量除去不需要的雜質(zhì)，類似的技術在已有技術中已相當成熟有效，例如DE2117429A、中國專利申請ZL021109737、ZL02133298.3、ZL031131263、ZL03152921、ZL03119744、ZL03114826、ZL03153496、ZL01128926、ZL200410041120、遼寧中醫(yī)學院學報(2002年，4(1)24)、中成藥(2005年，27(3)350-351)、世界科學技術-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2003年，(1)33-39)、中國天然藥物(2004年，2(1)11-15)等。
可針對銀杏內(nèi)酯、芍藥苷的溶解特性和體內(nèi)吸收特點(張壯等，中國實驗方劑學雜志2000，6(6)21-24)，采用標準制劑技術制成適宜的口服或非腸道給藥劑型，類似的技術在已有技術中也已相當成熟有效，例如制備銀杏內(nèi)酯鈉鹽(ZL00115134)、口腔快速崩解片(ZL200310123852)、軟膠囊(ZL03116572)、緩控釋制劑(ZL02116223、ZL200310110709)、環(huán)糊精包合物(ZL200310125175)、注射劑(ZL99124228、ZL021153590、ZL03113818、ZL031399428、ZL200410069038)、粉針劑(ZL03131959.9、ZL200410013937、ZL2003101210259、ZL200410000912)、滴丸(ZL03136485)、分散片(ZL03125462)、磷脂復合物(ZL01139971、ZL03128337)等。
可以理解的是，本領域技術人員根據(jù)不同的疾病狀況，可選用不同組合形式。例如，在以抗動脈粥樣硬化作用為主的治療中，可采用“銀杏內(nèi)酯(為主)+芍藥苷”的組合；而在以抗氧化作用為主的治療中，可采用“銀杏黃酮(為主)+芍藥苷”的組合。本發(fā)明組合物臨床使用中，每日推薦劑量(優(yōu)選)為銀杏內(nèi)酯2mg-30mg、芍藥苷5-50mg、銀杏黃酮10-100mg。
隨后進行的研究表明，與已有的“銀杏(內(nèi)酯)+人參(皂苷)+芍藥(苷)”組合(例如ZL98110756.7)相比，在減少了一種活性成分的情況下，本發(fā)明藥物組合物依然保持了相同、甚至就某些方面而言更為有利的藥理作用(例如避免了不需要的人參皂苷之不良反應)，多項指標顯著優(yōu)于單獨施用的銀杏內(nèi)酯、銀杏黃酮或芍藥苷，這是本領域技術人員無法根據(jù)現(xiàn)有技術推測的。因此，本發(fā)明試圖提供一種選擇，它提供了一種新的安全產(chǎn)品作為現(xiàn)有技術的替代，這種產(chǎn)品及其相應治療方案將是醫(yī)生高度認可并著力推薦的。
藥理藥效學試驗研究一.心腦血管方面的藥理作用1.對離體豚鼠心臟冠脈流量的影響1.1材料本發(fā)明藥物組合物銀杏內(nèi)酯-芍藥苷(2∶1、1∶1、1∶5、1∶10)，4mg/kg注射給藥；陽性對照藥銀杏內(nèi)酯(4mg/kg)；芍藥苷(4mg/kg)；銀杏內(nèi)酯+人參皂苷+芍藥苷(1∶1∶1，簡稱“銀-人-芍”，12mg/kg)；硫酸異丙腎上素注射液。
1.2實驗方法A.調(diào)節(jié)恒溫灌流裝置(參照《中藥藥理研究方法學》，人民衛(wèi)生出版社，第一版，第523頁)；B.制備豚鼠離體心臟，放入低溫洛氏液中排出余血，在升主動脈最高處插入主動脈插管，固定，使洛氏液由冠脈經(jīng)心肌入右心房，從腔靜脈和肺動脈的斷端流出，心尖通過蛙心夾連接記錄杠桿，描記心臟搏動曲線，記錄心率；C.測定冠脈流量冠脈流量、心率、心搏幅度基本穩(wěn)定后，連續(xù)測量3次每分鐘流量球平均值，作為給藥前的正常流量；D.給藥后的作用從主動脈上方注入各藥，測定給藥后1～10分鐘內(nèi)每分鐘流量、心率和心搏幅度，找出其極值，算出給藥后灌流量的最大增建值。每個藥物重復5個心臟，結果見表1。
表1.不同配比的本發(fā)明組合物(注射)對離體豚鼠心臟的影響(X±SD)

自身前后比較*p＜0.05**p＜0.01由表1實驗結果可知，硫酸異腎上腺素、銀杏內(nèi)酯、銀-人-芍、本發(fā)明組合物均能增加離體心臟冠脈流量。硫酸異腎上腺素和銀杏內(nèi)酯雖然可明顯增加冠脈流量，也明顯增加心率和心搏幅度。銀-人-芍也可增加冠脈流量，但同時也增加心率，因而增加心肌耗氧量，所以可據(jù)此推測硫酸異腎上腺素和銀杏內(nèi)酯+人參皂苷+芍藥苷并不適用于冠心病患者。
本發(fā)明組合物明顯增加冠脈流量，但不增加心率和心搏幅度，效果好于硫酸異腎上腺素和銀-人-芍，也好于單獨施用的銀杏內(nèi)酯或芍藥苷。
2.對不同誘導劑(包括血小板活化因子、腺苷二磷酸)誘導血小板凝集的影響2.1材料本發(fā)明藥物組合物(銀杏內(nèi)酯-芍藥苷1∶1，簡稱組合物A，4mg/kg注射)，和銀杏葉和白芍的提取物(1∶1，簡稱組合物B，10、20、30mg/kg灌胃)；空白對照組生理鹽水陽性對照藥相當于同樣用藥量的單組分的銀杏內(nèi)酯(4mg/kg)；相當于同樣用藥量的單組分的芍藥苷(10mg/kg)；天保寧片(含銀杏葉提取物20mg/kg)；銀杏+人參+芍藥提取物(1∶1∶1，30mg/kg)2.2實驗方法豚鼠分組，實驗動物連續(xù)灌胃5天，空白對照用生理鹽水。末次給藥1小時后頸動脈采血，以枸櫞酸鈉抗凝，混勻后離心(800r/min)2次，合并上清液作為富血小板血漿(PRP)，血小板計數(shù)；余下血漿離心(3000r/min)，取上清液作為貧血小板血漿(PPP)；以PPP調(diào)零，取PRP300μl加入比濁管，37℃溫育5分鐘，加入誘導劑血小板活化因子(PAF)，聚集不同時間，記錄數(shù)據(jù)，結果見表2。
表2.對PAF誘導的豚鼠血小板聚集的影響

與空白對照組比較*p＜0.05**p＜0.01誘導劑為腺苷二磷酸(ADP)的實驗結果，類似于表2顯示的效果。
由上述結果可知，銀杏內(nèi)酯、銀-人-芍、天保寧片、本發(fā)明組合物高和中劑量組均能抑制不同誘導劑誘導的血小板聚集(凝集)、降低最大聚集率，其中以銀-人-芍、本發(fā)明組合物高劑量效果最好，中劑量組也表現(xiàn)出抑制血小板聚集作用，優(yōu)于單獨施用的銀杏內(nèi)酯或芍藥苷。
還對大鼠頸動-靜脈血流旁路術血栓形成的影響、對大鼠體外血栓形成的影響等進行了實驗，結果表明本發(fā)明組合物對體內(nèi)血栓形成具有明顯對抗作用。
3.對大鼠試驗性腦缺血的影響還對腦水含量的影響、MCAO所致大鼠缺血損傷行為學指標的影響等進行了實驗，結果表明①本發(fā)明各配比組、銀-人-芍組、以及單獨施用的銀杏內(nèi)酯，對不完全性腦缺血引起的腦水腫均顯示出明顯保護作用，單獨施用的芍藥苷治療組作用不明顯。與單獨施用的銀杏葉治療組相比，本發(fā)明組合物各組的腦含水量顯著減少(P＜0.01)，表明其對不完全性腦缺血引起的腦水腫有顯著的保護作用，效果稍優(yōu)于或等于銀-人-芍組②大鼠MCAO后明顯有腦梗塞發(fā)生，本發(fā)明各配比組均可明顯降低腦梗塞組織重量百分比(P＜0.01)，效果與銀杏+人參+芍藥組相近似，單獨施用的芍藥苷治療組作用不明顯。而單獨施用的銀杏內(nèi)酯組也有較明顯的降低效果(P＜0.05)，但明顯不如本發(fā)明組合物的大、中劑量組③同樣，在對MCAO所致大鼠缺血損傷行為學指標的影響的實驗中，顯示了與上述相類似的結果，即本發(fā)明的組合物大、中劑量組的效果最好，明顯優(yōu)于單獨施用的銀杏內(nèi)酯或芍藥苷組，而且效果稍優(yōu)于或等于銀-人-芍組。
二.糖尿病方面的藥理作用1.材料本發(fā)明藥物組合物(銀杏內(nèi)酯-芍藥苷1∶5，簡稱組合物A，注射)，和銀杏葉和白芍的提取物(簡稱組合物B，灌胃)；正常對照組生理鹽水；糖尿病組生理鹽水；陽性對照藥相當于同樣用藥量的單組分的銀杏內(nèi)酯；相當于同樣用藥量的單組分的芍藥苷；降糖靈片；銀杏內(nèi)酯+人參皂苷+芍藥苷。
2.實驗方法糖尿病實驗模型的建立二級SD大鼠按照150mg/kg體重尾靜脈注射四氧嘧啶液，在四氧嘧啶液作用下，大鼠的胰島β細胞受到損傷，造成胰島素發(fā)生障礙，3天后尾靜脈采血測空腹血糖，血糖值大于11.0mmol/L的為糖尿病大鼠。
每日一次，連續(xù)4周，之后，尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)和血清Ins。
表3.對糖尿病大鼠的FBG和血清Ins的影響


與糖尿病組比較*p＜0.05**p＜0.01上述實驗表明，以銀杏內(nèi)酯和芍藥苷組成的組合物注射組的效果最明顯(p＜0.01)。提取物的高劑量口服組次之?？诜炙庈湛僧a(chǎn)生一定的降低血糖的作用，但不如銀-人-芍組、本發(fā)明組合物明顯，口服銀杏內(nèi)酯組降血糖作用不明顯，口服銀-人-芍組，可以降低四氧嘧啶糖尿病的血糖，并使血清Ins水平呈一定程度升高。降糖靈片只顯示降低血糖的效果，對血清Ins水平的影響不顯著。本發(fā)明組合物注射組明顯降低了四氧嘧啶糖尿病的血糖，并使血清Ins水平明顯升高，這表明銀杏內(nèi)酯與芍藥苷的聯(lián)合用藥對四氧嘧啶糖尿病大鼠產(chǎn)生了較強的降血糖作用。
同時，本發(fā)明研究了本發(fā)明組合物對糖尿病模型的大鼠的血清、肝、腦中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的影響。與正常對照組相比，糖尿病模型的大鼠的血清、肝、腦、胰腺中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著提高，而經(jīng)過本發(fā)明的組合物高劑量給藥后，上述組織中的MDA明顯下降，而胰腺MDA值變化不明顯，說明銀杏(內(nèi)酯)和芍藥(苷)是改善和治療糖尿病的有效藥物，尤其以二者的一定比例配伍使用，其伍用加合的效果最好(明顯優(yōu)于單用各組分)。
另外，進一步的實驗證明，本發(fā)明組合物可以糾正糖尿病微血管動力學異常，其效果優(yōu)于單獨施用的銀杏內(nèi)酯或芍藥苷。
三.高血脂方面的藥理作用1.材料本發(fā)明藥物組合物(銀杏內(nèi)酯-芍藥苷2∶1，簡稱組合物A，注射)，和銀杏葉和白芍的提取物(簡稱組合物B，灌胃)；正常對照組生理鹽水；高血脂組生理鹽水；陽性對照藥相當于同樣用藥量的單組分的銀杏內(nèi)酯；相當于同樣用藥量的單組分的芍藥苷；洛伐他?。汇y杏內(nèi)酯+人參皂苷+芍藥苷；
2.實驗方法高血脂模型的建立Wistar大鼠給予高脂飼料20g/只/天，共12天；正常對照組喂食普通飼料。
每日一次，藥物灌胃，連續(xù)12天，最后一天禁食不禁水，次日麻醉，之后腹主動脈取血，分離血清，測空腹血脂包括甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)，按照試劑盒說明書操作，結果見下表表4.對糖尿病大鼠TG、TC、HDL和LDL的影響

與高血脂組比較*p＜0.05**p＜0.01上述實驗表明，口服銀杏內(nèi)酯可以降低TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.05)；口服銀-人-芍也可以降低TG、TC和LDL，但升高HDL不明顯(p＞0.05)；而銀杏內(nèi)酯和芍藥苷組成的組合物注射，以及銀杏葉-白芍的提取物的高劑量口服，明顯降低TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.01)，這表明銀杏-白芍的聯(lián)合用藥對四氧嘧啶糖尿病大鼠血脂代謝產(chǎn)生了較強的調(diào)節(jié)作用。
四.抗氧化方面的藥理作用1.對高血脂癥大鼠的抗氧化作用1.1材料本發(fā)明藥物組合物銀杏黃酮+芍藥苷1∶1(40、20、10mg/kg灌胃)；正常對照組生理鹽水；
高血脂組生理鹽水；陽性對照藥銀杏黃酮(20mg/kg、40mg/kg)；銀杏內(nèi)酯(10mg/kg、20mg/kg)；芍藥苷(40mg/kg、20mg/kg)；VE(150mg/kg)；人參+芍藥(2∶1，100mg/kg)；1.2實驗方法高血脂模型的建立Wistar大鼠給予高脂飼料20g/只/天，共12天；正常對照組喂食普通飼料。高脂模型與正常組比較，血清和肝臟的LPO明顯升高，而SOD活性明顯降低，表明高血脂大鼠伴有自由基脂質(zhì)過氧化損傷。
每日一次，藥物灌胃，連續(xù)12天，最后一天禁食不禁水，次日麻醉，之后腹主動脈取血，分離血清，測過氧化脂質(zhì)(LPO)和超氧化物歧化酶(SOD)，按照試劑盒說明書操作，取1/2肝臟待測LPO和SOD，結果見下表表5.對高血脂大鼠血清和肝臟LPO和SOD的影響(nmol/L)

與高血脂組比較*p＜0.05**p＜0.01上述實驗表明，單獨施用的銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和芍藥苷大劑量時存在一定的抗氧化活性(芍藥苷的活性優(yōu)于銀杏內(nèi)酯)，低劑量銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、芍藥苷則不明顯。本發(fā)明組合物的中、高劑量組有抗氧化活性，尤其是高劑量組的活性更顯著(p＜0.01)，明顯優(yōu)于單獨施用的銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯和其他對照藥，推測這是由于銀杏葉中銀杏總黃酮的清除自由基能力較強，抗氧化活性優(yōu)于銀杏內(nèi)酯，而本發(fā)明的組合物中有效成分為銀杏總黃酮，所以活性優(yōu)于單純的銀杏內(nèi)酯。
另外，還從保護神經(jīng)細胞、減少腦組織丙二醛(MDA)和NO生成等方面，考察了本發(fā)明組合物的抗氧化作用，結果證明本發(fā)明組合物對腦組織MDA有明顯抑制作用，降低腦組織中升高的NO，對神經(jīng)細胞也顯示了保護作用，實驗也證明銀杏內(nèi)酯的抗氧化作用較弱，推測本發(fā)明組合物在抗氧化中以銀杏葉總黃酮的活性為主。其中的銀杏和芍藥提取物兩者存在明顯的協(xié)同作用，其原因和機理有待進一步探討。
五.老年癡呆方面的藥理作用1.材料本發(fā)明藥物組合物含有銀杏和白芍的提取物(簡稱組合物，配比分別為6∶1、1∶1、1∶6，ip 20mg/kg)；正常對照組生理鹽水；模型組β-淀粉樣肽；陽性對照藥銀杏內(nèi)酯(20mg/kg)；芍藥苷(20mg/kg)；銀杏內(nèi)酯+人參皂苷+芍藥苷(20mg/kg)；2.實驗方法模型的建立將小鼠麻醉，將其前囟處皮膚開一小口，暴露顱骨，側腦室注入β一淀粉樣肽，對照組注射生理鹽水。
ip給藥10天。之后將透明的安全島置于水迷宮第三象限，以第一、第二象限為小鼠的入水點，水面高出安全島1cm，室溫，上方通過攝像機和監(jiān)視屏與計算機相連，自動檢測和記錄活動軌跡(大致分為邊緣型、隨機型、趨向型和直線型)以及到達安全島的時間，同步進行數(shù)據(jù)處理，每天訓練4次，每次3min，每次入水前將小鼠擱置在安全島30秒，訓練結束再擱置30秒，以強化記憶，記錄進步的速度(是否路程增加、潛伏期延長、尋找策略目的性是否增強等)，第四天，結果見下表。
表6.對β-淀粉樣肽所致的AD小鼠學習記憶功能障礙改善的作用(n＝10)


與模型組比較*p＜0.05上述實驗表明，銀-人-芍、本發(fā)明各配比組均具有路程減少、潛伏期縮短、尋找策略目的性增強的作用，銀杏內(nèi)酯組也有該方面的作用，但不如銀-人-芍以及本發(fā)明組合物組的效果，而本發(fā)明組合物的作用相近似或略優(yōu)于銀-人-芍組。
同時本發(fā)明對上述實驗的大鼠死亡率、抗D-半乳糖致腦老化、預防/治療VD、被動回避實驗中對誘發(fā)小鼠記憶鞏固/再現(xiàn)障礙的作用等指標也作以詳細測試，實驗證明，本發(fā)明的組合物的合用施用效果均好于單獨使用銀杏內(nèi)酯或芍藥苷。說明本發(fā)明的組合物產(chǎn)生了效果加合/協(xié)同作用。
六.抗AS(動脈粥樣硬化)的藥理作用1.對兔AS病變進展的抑制作用1.1材料本發(fā)明藥物組合物為含有銀杏、白芍的提取物(1∶2，100mg/kg灌胃)；正常對照組生理鹽水；模型組生理鹽水；陽性對照藥銀杏內(nèi)酯(10mg/kg)芍藥苷(20mg/kg)；阿司匹林(50mg/kg)；1.2實驗方法將雄性新西蘭兔，隨機分組正常組(A組，空白對照組，喂普通標準飼料)、AS模型組(B組，喂含1％膽固醇飼料)、AS+陽性對照藥銀杏內(nèi)酯組(C1組，膽固醇喂料與B組同，另同時給予銀杏內(nèi)酯口服，10mg/kg)、AS+陽性對照藥芍藥苷組(C2組，膽固醇喂料與B組同，另同時給予芍藥苷口服，20mg/kg)、AS+陽性對照藥阿司匹林組(C3組，膽固醇喂料與B組同，另同時給予阿司匹林口服，50mg/kg)、AS+本發(fā)明組合物組(D組，膽固醇喂料與B組同，另同時給予本發(fā)明實施例1的組合物口服)。動物均單籠飼養(yǎng)。實驗期為12周。12周后處死動物。
測定指標1血脂、血清C反應蛋白(CRP)和單核細胞趨化因子-1(MCP-1)水平在0、12周末經(jīng)耳緣靜脈抽血，用酶學法測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C，其中LDL-C由Friedewald公式計算得出，按照試劑盒說明書操作。
實驗結果表明，各組高膽固醇塑料組動物的血清TG、TC、LDL-C水平均明顯高于喂養(yǎng)前，也顯著高于正常對照組；口服銀杏內(nèi)酯可以降低TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.05)；口服阿司匹林也可以降低TG、TC和LDL，但升高HDL不明顯(p＞0.05)；而本發(fā)明組合物的高劑量口服組則明顯地降低了TG、TC和LDL，升高HDL(p＜0.01)。
再于12周末取靜脈血，利用固相酶聯(lián)免疫吸附法測血清CRP水平和MCP-1水平，結果見表7表7.對兔主動脈的CRP和MCP-1水平的影響n＝10

與模型組比較*p＜0.05**p＜0.01結果表明，口服芍藥苷的作用不明顯，銀杏內(nèi)酯、阿司匹林組和本發(fā)明組合物組的血清CRP和MCP-1的濃度仍高于正常，但明顯低于模型組和芍藥苷組。D組與C1之間雖然無顯著性差異，但是數(shù)據(jù)表明銀杏內(nèi)酯與芍藥苷藥物的合用具有使血清CRP和MCP-1進一步降低的趨勢，其增強銀杏內(nèi)酯活性的機理有待進一步探討。
測定指標2主動脈組織病理形態(tài)學改變并分析病變程度于12周末處死動物，剖開胸腹腔，游離主動脈全長，剝離外膜脂肪組織，縱行剖開置于10％中性福爾馬林中保存，大體標本行蘇丹III染色厚攝像，利用生物醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定斑塊大體面積、內(nèi)膜總面積和血管周長，計算斑塊與內(nèi)膜面積比；并將主動脈全長分段，常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚度的病理切片，染色，測量內(nèi)膜厚度、中膜厚度，計算內(nèi)膜與中膜厚度比，并加以平均，作為病理形態(tài)學觀察指標的測定值，見表8。
測定指標3斑塊部位的巨噬細胞、平滑肌細胞陽性率以及COX-2的表達取4μm厚主動脈組織切片采用EnVision法進行免疫組織化學染色，設替代對照(PBS代替一抗)，棕黃色顆粒裝產(chǎn)物為陽性標記，采用細胞圖像分析系統(tǒng)計算陽性細胞百分率，取平均值，見表8。
表8.兔主動脈組織病理形態(tài)學改變以及斑塊部位的巨噬細胞、平滑肌細胞陽性率(％)


與模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01病理形態(tài)學改變與模型組比較，芍藥苷組各項指標均無明顯變化；與模型組比較，銀杏內(nèi)酯、阿司匹林組和本發(fā)明組合物組的各項指標呈顯著性減少，同時巨噬細胞含量明顯減少，平滑肌細胞含量明顯增加，其中以本發(fā)明組合物組最為顯著(p＜0.01)。
毒理學小鼠急毒、長毒實驗結果表明本發(fā)明的組合物靜脈注射小鼠的最大耐受量為1.5g/kg，腹腔注射的LD50為3g/kg；與對照組相比，本發(fā)明組合物在給藥30周時，各臟器系數(shù)均無顯著差異。
病理形態(tài)學觀察大鼠主要臟器均未見與受試藥物毒性相關的病理改變。
缺血性腦卒中二級預防的臨床觀察1.對象入選標準年齡＜75歲；缺血性腦卒中；首發(fā)或二次復發(fā)病例；急性期3月后；有CT/MRI診斷，并與臨床表現(xiàn)相符合。
排除標準各種出血性卒中；三次及以上腦卒中發(fā)作；影像學檢查為缺血性腦卒中，而無臨床癥狀或體征的病人；無CT/MRI確診的腦卒中患者；缺血性腦卒中急性期3個月內(nèi)；瘤卒中；血液??；嚴重肝腎功能損傷；靜息卒中。
2.方法與結果本發(fā)明組合物組400例病人，口服(銀杏內(nèi)酯15mg+芍藥苷40mg/天)；藥物對照組480例病人，阿司匹林，口服75mg/天；空白對照組470例病人，不提供阿司匹林或組合物藥物。
于實驗開始的第30、60、90、120天，觀察是否有卒中復發(fā)、副作用(出現(xiàn)胃腸不適、黑便、惡心、噯氣等癥狀)和嚴重副作用(以出現(xiàn)黑便，大便潛血檢查陽性，經(jīng)停藥抗酸治療后黑便、潛血消失為判定上消化道出血副反應依據(jù))，評定復發(fā)必須有CT/MRI確診。結果見下表表9.120天復發(fā)率觀察表

表10.120天消化道副反應觀察表

表11.120天上消化道出血副反應觀察表

3.結論本發(fā)明組合物及阿司匹林均可以降低缺血性腦卒中的復發(fā)率，兩者效果相當，與空白對照組相比，本發(fā)明組合物組和藥物對照組均有著顯著性差異。
服用阿司匹林的480例病人中出現(xiàn)37例副作用和11例嚴重副作用，而服用本發(fā)明組合物的400例病人只有7例副作用，1例嚴重副作用產(chǎn)生，兩組對比有顯著性差異。
制劑實施例實施例1 膠囊劑取銀杏葉提取物(純度97％，其中黃酮含24％，內(nèi)酯含6％)5g，取赤芍提取物(含芍藥苷20％)5g，加入淀粉，混合均勻，制粒、粉碎過篩、干燥制得顆粒，裝入20粒硬膠囊中即得。經(jīng)檢測，每膠囊中含有銀杏內(nèi)酯15mg、和芍藥苷50mg。
實施例2 片劑取銀杏內(nèi)酯8g，芍藥苷60g，磨細粉過80目篩，加適量糊精，混勻，先用40-60％乙醇濕勻，后用淀粉漿制粒，過篩后80℃干燥，整粉(過14目篩)用100目均勻地將硬脂酸鎂混入顆粒中，制得1000片，包衣即得。經(jīng)檢測，每片中含有銀杏內(nèi)酯8mg、和芍藥苷60mg。
實施例3 軟膠囊劑取銀杏黃酮40g、芍藥苷20g，加入植物油中混勻，用明膠作囊殼材料，壓制成1000粒軟膠囊。經(jīng)檢測，每膠囊中含有銀杏黃酮40mg、和芍藥苷20mg。
實施例4 緩釋片取銀杏內(nèi)酯40g、芍藥苷5g、加入乳糖、微晶纖維素、羥丙甲基基纖維素、聚乙烯吡咯、硬質(zhì)酸鎂，按照標準制粒和壓片工藝制備1000粒。經(jīng)檢測，每膠囊中含有銀杏內(nèi)酯40mg、和芍藥苷5mg。
實施例5 凍干針劑取羥丙基-β-環(huán)糊精80克、葡甲胺3克加2000ml注射用水溶解，得溶液I，85℃保溫，備用；另取銀杏內(nèi)酯10克加適量丙酮使其溶解，取芍藥苷20g，再將二者緩緩加入溶液I中進行溶解，保溫65分鐘，然后放冷至室溫，濾過，再微孔濾膜過濾，分裝1000支，凍干，其凍干工藝為，先-15℃冷凍成型，再-40℃冷凍降溫，冷凍下真空干燥，36小時后，緩緩升溫，直至25℃封蓋，即得。經(jīng)檢測每支含有銀杏內(nèi)酯10mg、和芍藥苷20mg。
權利要求
1.一種藥物組合物，包括以下組分a.銀杏提取物，或主要含有銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物，或銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體、或銀杏內(nèi)酯單體、或銀杏黃酮單體；和b.芍藥的干燥根粉末，或含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、芍藥新苷的芍藥提取物，或芍藥苷單體，其中組分a中銀杏內(nèi)酯與組分b中芍藥苷的重量比例為0.05-10∶1。
2.如權利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.主要含有銀杏內(nèi)酯和銀杏黃酮作為活性成分的銀杏提取物；和b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物。
3.如權利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.銀杏黃酮單體和銀杏內(nèi)酯單體；和b.含有芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷的芍藥提取物。
4.如權利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.銀杏內(nèi)酯單體；和b.芍藥苷單體，其中銀杏內(nèi)酯與芍藥苷的重量比例為0.1-5∶1。
5.如權利要求1的藥物組合物，包括以下組分a.銀杏黃酮單體；和b.芍藥苷單體，其中銀杏黃酮與芍藥苷的重量比例為0.1-5∶1。
6.如權利要求4的藥物組合物，其中銀杏內(nèi)酯與芍藥苷的重量比例為0.1-1∶1。
7.如權利要求5的藥物組合物，其中銀杏黃酮與芍藥苷的重量比例為0.1-1∶1。
8.如權利要求1-7之一的藥物組合物，為口服或非腸道給藥制劑形式。
9.權利要求1-8之一的藥物組合物在制備用于治療和/或預防糖尿病及其并發(fā)癥、老年癡呆癥、心腦血管疾病的藥物中的應用。
10.權利要求1-8之一的藥物組合物在制備用于防止心腦血管疾病復發(fā)的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥物組合物、制備方法及其應用，所述藥物組合物主要含有銀杏內(nèi)酯和芍藥苷。本發(fā)明藥物組合物可用于治療和預防糖尿病、老年癡呆癥、心腦血管疾病，以及用于防止心腦血管疾病的復發(fā)。
文檔編號A61P25/28GK1714832SQ200510082739
公開日2006年1月4日 申請日期2005年7月11日 優(yōu)先權日2005年7月11日
發(fā)明者林艷和, 潘錫平, 林谷風 申請人:深圳市生物谷科技有限公司