專利名稱：一類新的大環(huán)內(nèi)酯化合物,其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一類新化合物，其制備方法和其用途，更具體地說，本發(fā)明公開了分子式(I)化合物Wortmannilactone A、B及其同分異構(gòu)體化合物Wortmannilactone C、D(見分子式(II))，含有它的藥物組合物，利用微生物發(fā)酵制備上述化合物的方法及其中使用的微生物，和上述化合物或含有它們的藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物及抗腫瘤藥物中的用途。
其中R1＝OH時，為化合物Wortmannilactone A，R1＝OCH3時，為化合物Wortmannilactone B。

其中，R2＝OH時，為化合物Wortmannilactone C，R2＝OCH3時，為化合物WortmannilactoneD。
背景技術(shù)：
糖尿病是由胰島素分泌和/或胰島素作用的絕對或相對減弱而引起的綜合癥，主要表現(xiàn)為高血糖。糖尿病分為胰島素依賴型糖尿病(I DM)和胰島素非依賴型糖尿病(II DM)，II DM晚期可出現(xiàn)并發(fā)癥，其中微血管并發(fā)癥包括眼病、腎病和外周和自主神經(jīng)病，大血管并發(fā)癥包括動脈粥樣硬化冠心病和外周動脈病。糖尿病，特別是其并發(fā)癥，給患者及其親屬帶來了巨大的痛苦。
自從胰島素用于治療糖尿病以來，酮酸中毒、感染不再威脅糖尿病患者的生命安全。但長期的糖尿病并發(fā)癥仍然是糖尿病患者頭痛的嚴(yán)重問題。通過對糖尿病患者聚醇代謝通路異常的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞組織中山梨醇的蓄積是組織結(jié)構(gòu)、功能改變的重要原因，而聚醇代謝通路中的關(guān)鍵酶是醛糖還原酶(aldose reductase，AR)。醛糖還原酶以還原型輔酶II(NADPH)為輔酶，它催化己糖的還原反應(yīng)，可以將葡萄糖和半乳糖轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的還原產(chǎn)物山梨醇和半乳糖醇。然后，山梨醇再在山梨醇脫氫酶(sorbitoldehydrogenase)的作用下氧化成果糖。山梨醇脫氫酶則是聚醇代謝通路中的第二個酶，它可以氧化多種糖醇，但卻不能氧化半乳糖醇。因此，在體內(nèi)易導(dǎo)致半乳糖醇的積聚，從而引起半乳糖血癥的發(fā)生(張禮萍等人，醛糖還原酶抑制劑研究，國外醫(yī)藥抗生素分冊，1997，18(1)5-10)。值得注意的是，葡萄糖和半乳糖均不是AR的最適底物，當(dāng)血糖濃度維持在正常的生理水平時，AR并不被激活。在高血糖的生理狀況(如糖尿病發(fā)生時)，催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖的己糖激酶被飽和，此時AR則被激活，促使體內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)化成山梨醇。然而，山梨醇脫氫酶的活力并未呈比例地相應(yīng)增加，山梨醇又由于自身極性因素不易通過細(xì)胞膜，所以在胞內(nèi)造成了山梨醇的聚積。大量的動物和臨床試驗都已證實，醛糖還原酶抑制劑(ARI)能有效地改善糖尿病患者的聚醇代謝紊亂，從而預(yù)防和延緩糖尿病并發(fā)癥如白內(nèi)障、神經(jīng)病變、腎臟病變等的發(fā)生和發(fā)展(楊哲，醛糖還原酶抑制劑和糖尿病并發(fā)癥，國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，1999，26(4)217-222)。
Varma等人研究了多種黃酮類化合物的醛糖還原酶抑制活性。結(jié)果表明它們不同程度具有活性。但至今還沒有一個化合物投放市場(Var SD，etal，F(xiàn)lavonoids as inhibitors of lens aldose reductase，ScienceNY，1975，1881215-1216)。
盡管已有預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物，但仍不能滿足市場的需要。市場仍需要預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的替代藥物，特別是天然來源的替代藥物。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供一種分子式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其同分異構(gòu)體化合物Wortmannilactone C、D(見分子式(II))，含有它的藥物組合物及將它們用作醛糖還原酶抑制劑用于治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥和制備抗腫瘤藥物的用途。
本發(fā)明另一目的是提供一種制備上述化合物的方法及在該方法中使用的微生物。
本發(fā)明另一目的是提供一種治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物組合物。
本發(fā)明另一目的是提供一種抗腫瘤的藥物組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明發(fā)明人對醛糖還原酶抑制劑進(jìn)行了大量研究，結(jié)果驚人地發(fā)現(xiàn)某些微生物的代謝產(chǎn)物具有醛糖還原酶抑制劑活性，通過進(jìn)一步藥理實驗，發(fā)現(xiàn)了其還具有抗腫瘤作用，因此完成本發(fā)明。
一方面，本發(fā)明提供了一種如分子式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其同分異構(gòu)體化合物Wortmannilactone C、D(見分子式(II))，及其可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥
(I)其中R1＝OH時，為化合物Wortmannilactone A，R1＝OCH3時，為化合物Wortmannilactone B。
其中，R2＝OH時，為化合物Wortmannilactone C，R2＝OCH3時，為化合物WortmannilactoneD。
另一方面，本發(fā)明提供了一種利用微生物發(fā)酵制備上述化合物的方法，該方法包括將選定的真菌在培養(yǎng)基上發(fā)酵，然后對所得發(fā)酵液進(jìn)行分離和純化。
另一方面，本發(fā)明提供了一種微生物F-01-195，它可用于上述發(fā)酵方法制備上述化合物，它的保藏編號為CGMCC 1224。
另一方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括上述化合物或其可藥用鹽作為活性成分和可藥用載體。
另一方面，本發(fā)明涉及上述化合物或組合物用于制備治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物的用途。
另一方面，本發(fā)明涉及上述化合物或組合物用于制備抗腫瘤藥物中的用途。


圖1為產(chǎn)生菌F-01-195的菌落形態(tài)照片；圖2為產(chǎn)生菌F-01-195的電子顯微鏡照片；圖3為Wortmannilactone A紫外吸收光譜圖；圖4為Wortmannilactone A紅外光譜圖；圖5為Wortmannilactone A質(zhì)譜圖；圖6為Wortmannilactone A1H NMR圖譜；圖7為Wortmannilactone A13C NMR圖譜；圖8為Wortmannilactone B1H NMR圖譜；圖9為Wortmannilactone B13C NMR圖譜；圖10為Wortmannilactone C1H NMR圖譜；圖11為Wortmannilactone C13C NMR圖譜；圖12為Wortmannilactone D1H NMR圖譜；圖13為WortmannilactoneD13C NMR圖譜。
發(fā)明的詳細(xì)描述如上所述，本發(fā)明涉及分子式(I)化合物WortmannilactoneA、B及其同分異構(gòu)體化合物Wortmannilactone C、D(見分子式(II))，其可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥
其中R1＝OH時，為化合物Wortmannilactone A，R1＝OCH3時，為化合物Wortmannilactone B。
其中，R2＝OH時，為化合物Wortmannilactone C，R2＝OCH3時，為化合物Wortmannilactone D。
上述化合物可做為醛糖還原酶抑制劑用于治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥，另外，還可以用于治療腫瘤。
具有上述用途的化合物不僅是化合物本身，適當(dāng)時也可以是其藥學(xué)上可接受的鹽(酸或堿加成鹽)或立體異構(gòu)體(包括光學(xué)異構(gòu)體，例如對映體和外消旋體)。
上述藥學(xué)可接受的加成鹽包括化合物能夠形成的治療活性的非毒性酸和堿加成鹽形式。堿性的化合物通過用適當(dāng)?shù)乃崽幚韷A的形式可轉(zhuǎn)化成它們的藥學(xué)可接受的酸加成鹽。酸的例子包括無機(jī)酸，諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸；有機(jī)酸，諸如乙酸、丙酸、羥乙酸、乳酸、丙酮酸、乙醇酸、馬來酸、丙二酸、草酸、苯磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、三氟乙酸、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、水楊酸、對氨基水楊酸、撲酸、苯甲酸、抗壞血酸等。堿加成鹽形式的例子是鈉、鉀、鈣鹽，以及與藥學(xué)可接受的胺形成的鹽，所述的胺是諸如氨、烷基胺、苯胺和氨基酸，諸如精氨酸和賴氨酸。
上述化合物和鹽可以形成溶劑化物，例如水合物、醇合物等。上述醛糖還原酶抑制劑還可以是前藥或可在體內(nèi)代謝變化后釋放出所述活性成分的形式。選擇和制備適當(dāng)?shù)那八幯苌锸潜绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知技術(shù)。
下文中為簡便起見，本發(fā)明限定的任何化合物、其可藥用鹽、其溶劑化物及其立體異構(gòu)體都簡稱為本發(fā)明的化合物。
本發(fā)明另一方面提供了制備上述化合物的方法，該方法包括1.提供能夠通過發(fā)酵產(chǎn)生上述化合物的微生物，它們?yōu)樵颇险婢?，?yōu)選，鄔氏黃絲曲霉(Talaromyces wortmannii)CGMCC No.1224。該菌種F-01-195已于2004年9月27日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CGMCC No.1224。
菌株來源產(chǎn)生菌株F-01-195是從我國云南省的土壤樣品中分離得到。
菌株鑒定該菌種在查氏瓊脂(CA)上，25℃，7天菌落直徑11-13mm，稍厚或較薄，表面平坦或有輕微溝槽，邊緣于培養(yǎng)基內(nèi)，不規(guī)則；質(zhì)地絨狀至輕微絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)稀疏，子囊果結(jié)構(gòu)較少，無滲出液和可溶性色素。
在查氏酵母膏瓊脂(CYA)上，25℃，7天菌落直徑10-15mm，表面有溝槽，淺或深，絨狀至絮狀，菌絲體在菌落邊緣為白色，向菌落中心逐漸變?yōu)榈S色、玉米黃色；子囊果生長層經(jīng)常不存在；分生孢子結(jié)構(gòu)稀疏至中等，有明顯的滲出液；無可溶性色素；背面黃棕色。在5℃，7天菌落直徑3-5mm；菌絲白色或淡黃色；背面黃棕色。在37℃不萌發(fā)。
在麥芽浸膏瓊脂(MEA)上，25℃，7天菌落直徑15-20mm，平坦，致密，絨狀至輕微絮狀；邊緣菌絲體淡黃色，中心區(qū)域玉米黃色，圍繞著密集的子囊果生長層。分生孢子結(jié)構(gòu)稀疏至中等，顏色同CYA；有淡黃色滲出液；無可溶性色素；背面黃棕色至深黃棕色。
子囊果生長在疏松交織的黃色菌絲中，10-15天成熟，直徑100-200um；子囊果單獨產(chǎn)生；子囊孢子淡黃色，3.5-5.0×3.0-3.2μm，表面有刺。分生孢子梗發(fā)生于表面或氣生菌絲，梗莖72-166×1.8-3.4μm，壁光滑至粗糙，帚狀枝二輪生；梗基4-6個，8-12×1.6-3.0μm；瓶梗細(xì)長，壁光滑至粗糙，每輪2-4個，8-10×1.5-2.4μm，瓶梗頸長；分生孢子橢圓形，2.2-2.4×1.2-1.5μm，壁有小刺，分生孢子鏈較長。
根據(jù)以上培養(yǎng)特征可以確定該菌種F-01-195為鄔氏黃絲曲霉Talaromyces wortmannii。
2.選擇性地在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，3.提供一種發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為本領(lǐng)域常用培養(yǎng)基，優(yōu)選加入黃豆粉的大米，4.將微生物在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，5.選擇性地對所得發(fā)酵液進(jìn)行分離和純化。
本發(fā)明的一個實施方案中，優(yōu)選在pH約為7的條件下發(fā)酵。本發(fā)明另一實施方案中，分離包括用溶劑提取菌體再除去溶劑，純化包括硅膠柱層析和選擇性的HPLC單組分制備。
本發(fā)明方法不受上述順序的限制，并且所述培養(yǎng)基成分可以在本領(lǐng)域技術(shù)人員可預(yù)見的范圍內(nèi)改變。
本發(fā)明另一方面提供了一種藥物組合物，其含有作為活性成分的上述化合物和可藥用載體。藥物組合物的制備方法為本領(lǐng)域常用方法。
本文所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的加成鹽或水合物可以利用各種給藥途徑或方式釋放至患者。適合的給藥途徑包括但不限于吸入、透皮、口服、直腸、經(jīng)粘膜、腸內(nèi)和腸胃外給藥，腸胃外給藥包括肌內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)注射。
本文所用的術(shù)語“給藥”可涵蓋所有直接與間接釋放化合物到其預(yù)期作用部位的手段。
本文所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和/或水合物可以單獨給藥，與其他本發(fā)明化合物聯(lián)合給藥，和/或以與其他已知治療劑聯(lián)合的形式給藥。
本發(fā)明的活性化合物可以本身形式給藥的，或者以藥物組合物形式給藥，其中活性化合物是與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑混合的。按照本發(fā)明使用的藥物組合物通常是按常規(guī)方式配制的，使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體，包含賦形劑和助劑，它們有利于將活性化合物加工成可以在藥學(xué)上使用的制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的給藥途徑。
關(guān)于口服給藥，化合物可以是容易這樣配制的，將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。這類載體使本發(fā)明化合物能夠配制成片劑、丸劑、錠劑、膠囊劑、液體、凝膠、糖漿劑、漿液、懸液等，用于被所要治療的患者口服?？谟盟幬镏苿┛梢赃@樣得到，與固體賦形劑混合，可選地研磨所得混合物，加工顆粒的混合物，如果需要的話加入適合的助劑，得到片劑或錠劑芯。適合的賦形劑確切地是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖或甘露糖醇；纖維素制備物，例如玉米淀粉、小麥淀粉、稻米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的話，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。
可以口服的藥物制劑包括推入配合的膠囊劑，由明膠制成，以及軟的密封膠囊劑，由明膠和一種增塑劑制成，例如甘油。推入配合的膠囊劑可以含有活性成分與下列成分的混合物填充劑，例如乳糖；粘合劑，例如淀粉；和/或潤滑劑，例如滑石粉或硬脂酸鎂或微粉硅膠；和可選的穩(wěn)定劑。在軟膠囊劑中，活性化合物可以是溶解或懸浮在適合的液體中的，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。另外，可以加入穩(wěn)定劑。所有口服給藥制劑都應(yīng)當(dāng)是適合于這類給藥的劑量。
關(guān)于頰給藥，組合物可以采取片劑或糖錠劑的形式，按常規(guī)方式配制。
關(guān)于通過吸入給藥，按照本發(fā)明使用的化合物適宜以氣霧劑的形式從加壓包裝或霧化器中釋放出來，其中利用適合的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟代甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，通過提供計量釋放的閥門可以確定劑量單位。用在吸入器或吹入器內(nèi)的明膠膠囊和藥筒可以配制成含有化合物與適合的粉末基質(zhì)的粉末混合物，例如乳糖或淀粉。
化合物可以配制用于腸胃外給藥，通過注射，例如急推注射或連續(xù)輸注。注射用制劑可以是單位劑型，例如在安瓿或多劑量容器內(nèi)，其中加入防腐劑。組合物可以采取在油性或水性載體中的懸液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制用試劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，例如藻酸鈉。
腸胃外給藥用藥物制劑包括水溶性活性化合物的水溶液。酌情可以制備活性化合物的油性注射懸液。適合的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，例如芝麻油，或合成的脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體，水性注射懸液可以含有增加懸液粘性的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉葡聚糖?？蛇x地，懸液還可以含有適合的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的試劑，以便制備高濃縮的溶液。
或者，活性成分可以是粉末形式，在使用前用適合的載體再生，例如無菌無熱原的水。
化合物還可以配制成直腸組合物，例如栓劑或保留灌腸劑，例如含有常規(guī)的栓劑基質(zhì)，例如可可脂或其他甘油酯。
除了前述制劑以外，化合物還可以配制成藥庫制劑。這類長效制劑可以通過植入或經(jīng)皮釋放(例如皮下或肌內(nèi))、肌內(nèi)注射或透皮貼劑給藥。因而，例如，化合物可以與適合的聚合或疏水性材料(例如在可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂一起配制，或者配制成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。
藥物組合物還可以包含適合的固體或凝膠相載體或賦形劑。這類載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物，明膠、和聚合物，例如聚乙二醇。
優(yōu)選地，組合物是單位劑型，例如片劑或膠囊劑。
給藥方式以及有效劑量的選擇將尤其根據(jù)所治療的疾病而異。給藥方式和劑量的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。
本發(fā)明化合物的單位劑型通常將含有0.1至99重量％活性物質(zhì)，更通常為5至75重量％活性物質(zhì)。舉例來說，單位劑型可以含有1mg至1g化合物，更通常為10mg至500mg，例如在50mg與400mg之間，劑量通常為100mg至200mg。
每個劑量單位或每次口服給藥優(yōu)選地含有1至250mg(關(guān)于腸胃外給藥，優(yōu)選地含有0.1至25mg)結(jié)構(gòu)(I)或(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，本發(fā)明的化合物將按照有效提供所需治療效果的量給藥。提供所需治療效果所必要的濃度將尤其根據(jù)疾病的明確性質(zhì)、患者的年齡、體重和疾病的嚴(yán)重性而異。
給藥劑量優(yōu)選地將對患者是無毒的，不過在某些情況下所治療疾病的嚴(yán)重性可能迫使給以導(dǎo)致一些毒性跡象的量的化合物。
通常，本發(fā)明化合物的給藥量將在0.01mg/kg至100mg/kg體重的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為0.1mg/kg至10mg/kg體重，特別是1mg/kg至5mg/kg體重。
藥學(xué)上可接受的本發(fā)明化合物正常地將按照每日劑量方案對受治療者給藥。關(guān)于成年患者，這例如可以是結(jié)構(gòu)(I)或(II)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽的口服劑量在1mg與500mg之間，優(yōu)選在1mg與250mg之間，或者靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)劑量在0.1mg與100mg之間，優(yōu)選在0.1mg與25mg之間，按照游離化合物計算，化合物每天分1至4次給藥。因而，關(guān)于體重70kg的普通人，本發(fā)明化合物的典型每日劑量將在70mg至700mg的范圍內(nèi)。這樣一種劑量例如可以每日分二至四次給藥。
不過，給藥劑量的大小和給藥的頻率最終將由治療該患者的醫(yī)師來決定和判斷。
本發(fā)明的化合物還可以選擇性地與已知的治療糖尿病的藥物聯(lián)合給藥。在上述組合物中可以加入有效量的治療糖尿病的藥物。治療糖尿病的藥物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，優(yōu)選α-淀粉酶抑制劑、木糖醇或殼聚糖。
當(dāng)本發(fā)明化合物與已知治療糖尿病的藥物聯(lián)合給藥時，它們可以同時、分別或順序給藥。優(yōu)選將它們制成試劑盒的形式。
本發(fā)明的化合物可用于治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥，其中糖尿病并發(fā)癥選自下面并發(fā)癥所組成的組糖尿病腎病，糖尿病眼病、糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病心臟病、糖尿病動脈硬化和糖尿病微血管病，優(yōu)選糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)疾病或糖尿病微血管病。
本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明化合物與已知治療糖尿病的藥物聯(lián)合給藥時，它們可以同時、分別或順序給藥。本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物及含本發(fā)明化合物的組合物用于制備治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途，其中所述并發(fā)癥如上所述。
本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了含有治療糖尿病藥物的本發(fā)明組合物用于制備治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途，其中所述的糖尿病并發(fā)癥如上所述。
本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明化合物及含本發(fā)明化合物的組合物用于制備抗腫瘤的藥物中的用途，其中所述抗腫瘤藥物包括抗結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌等實體瘤的抗腫瘤藥物和抗白血病等腹水瘤藥物。本發(fā)明化合物可以與已知抗腫瘤的藥物聯(lián)合給藥，當(dāng)它已知抗腫瘤的藥物聯(lián)合給藥時，與它們可以同時、分別或順序給藥。
下面實施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但它們并非理解成對本發(fā)明范圍的任何限制。
儀器與試劑為本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的儀器與試劑除非特別說明，本發(fā)明中所說的％均為重量百分比紅外光譜儀Nicolet公司magna-IR 550型紫外光譜儀Pharmacia公司Ultrospec 2100 Pro型核磁共振儀Varian公司inova 500高分辨質(zhì)譜儀Bruker Daltonics公司Apex II FT-ICRMS旋光儀Perkin-elmer 241 polarimeter材料NADPH(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司)，新鮮豬眼球(石家莊肉聯(lián)廠)，巰基乙醇，PMSF(苯基甲基磺酰基氟化物)，(sigma公司)下面的操作均在0～4℃進(jìn)行。每批取豬的晶狀體約90g，于三倍體積的冷的0.05mol/L NaPi緩沖液中(含0.5mmol/LPMSF和0.5mmol/L EtSH)勻漿，10000×g離心50分鐘除去不溶物。上清中加入(NH4)2SO4至40％的飽和度，輕度攪拌15分鐘，離心除去沉淀，再加入(NH4)2SO4至50％的飽和度，輕度攪拌15分鐘，離心除去沉淀，加入(NH4)2SO4至75％的飽和度，輕度攪拌15分鐘離心收集沉淀，用冷的0.05mol/L的NaPi(含0.5mmol/LPMSF和0.5mmol/L EtSH)溶解，于0.05mol/L的NaPi溶液(含0.5mmol/LPMSF和0.5mmol/L EtSH)中透析過夜。透析后，將上述酶液加入甘油至40％的濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 實施例1菌種的培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基淀粉2％，葡萄糖1％，熱榨黃豆餅粉0.2％，麥牙粉0.6％，酵母粉0.3％，NaCl 0.2％，MgSO4.7H2O 0.1％，CaCO30.2％pH7.0發(fā)酵培養(yǎng)基大米培養(yǎng)基為每100g大米中加入豆粉2.5g。由真菌F-01-195斜面，接種于種子培養(yǎng)基，27℃，72hr培養(yǎng)后，接入內(nèi)含量為100g大米培養(yǎng)基的750ml三角瓶中，PH約為7于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天。
實施例2.化合物Wortmannilactone A、B、C、D的分離及結(jié)構(gòu)確認(rèn)F-01-195固體培養(yǎng)物2kg，用4000ml乙酸乙酯浸泡2小時，乙酸乙酯層經(jīng)無水Na2SO4脫水后，濃縮抽干后，得到褐色物質(zhì)40g。
取38g樣品，用少量甲醇溶解后，使用硅膠柱(φ2.5×25cm)色譜進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，層析柱的洗脫條件為100％的CHCl3至100％MeOH的階段洗脫，收集合并活性組分，CHCl3∶MeOH為5∶1部分濃縮抽干后得褐色固體320mg，使用ODS反相柱(PHENOMENEX ODS Φ20×250mm)在制備型HPLC(購自Waters公司，pump515，Detector996，Injector752i)上進(jìn)行單組分的制備(流動相為40％CH3CN，流速為6ml/min，檢測波長為271nm)得到四個淡黃色物質(zhì)WortmannilactoneA(61.2mg)、B(8.1mg)、C(11.2mg)、D(6.1mg)，保留時間分別為15.4，20.5，17.8和22.3分鐘。
各化合物的理化分析數(shù)據(jù)如下Wortmannilactone A淡黃色固體，分子量(FAB-MS)418，高分辨質(zhì)譜HSFAB-MS測定值441.2247(M+Na)，理論值C24H34O6Na441.2239，分子式C24H34O6[α]D20-52°(c0.8CH3OH)；UVλmaxmeOH225(ε4.80)，261(ε4.91)，271(ε4.95)nm.IR(KBr)(cm-1)3519，1696。
13C-NMR(δ，ppm)165.9(2-C)，145.17(4-C)，140.86(6-C)，137.61(15-C)，136.67(8-C)，135.69(19-C)，132.05(17-C)，130.68(7-C)，130.48(18-C)，129.09(16-C)，127.84(5-C)，127.22(20-C)，120.17(3-C)，70.0(22-C)，68.03(14-C)，66.28(10-C)，64.77(12-C)，62.8(24-C)，47.57(11-C)，47.06(13-C)，43.33(9-C)，42.82(23-C)，37.24(21-C)，24.33(25-C)。
1H-NMR(δ，ppm)7.01(1H，dd，J＝15，11Hz)(4-H)，6.38(1H，dd，J＝15，11Hz)(6-H)，6.23(1H，dd，J＝15，11Hz)(5-H)，6.12(1H，m)(7-H)，6.12(1H，m)(16-H)，6.10(1H，m)(18-H)，5.99(1H，dd，J＝15，11Hz)(17-H)，5.92(1H，dd，J＝15，11Hz)(19-H)，5.84(1H，m)(8-H)，5.73(1H，d，J＝15Hz)(3-H)，5.59(1H，dt，J＝15，7.5Hz)(20-H)，5.33(1H，dd，J＝15，7.5Hz)(15-H)，4.99(1H，m)(22-H)，4.59(1H，brs)(10-OH)，4.53(1H，brs)(14-OH)，4.47(1H，brs)(23-OH)，4.36(1H，brs)(12-OH)，4.12(1H，m)(14-H)，3.85(1H，m)(10-H)，3.60(1H，m)(24-H)，3.27(1H，m)(12-H)，2.19(1H，m)，2.42(1H，m)(21-H)，2.06(1H，m)，2.55(1H，m)(9-H)，1.56(1H，m)，1.68(1H，m)(23-H)，1.34(1H，m)，1.51(1H，m)(11-H)，1.18(1H，m)，1.58(1H，m)(13-H)，1.05(3H，d，J＝6Hz)(25-H)。
Wortmannilactone B 淡黃色固體；分子量(FAB-MS)432，高分辨質(zhì)譜HSFAB-MS測定值455.2420(M+Na)。理論值455.2410，C25H36O6Na。分子式C25H36O6。[α]D20-35°(c0.52CH3OH).UVλMaxMeOH224.7(ε4.83)，60.9(ε4.92)，270.9(ε4.98)nm.IR(KBr)(cm-1)3520，1696。
1H(500Hz，DMSO-d6)data，5.71(1H，d，15)(H-2)，6.99(1H，dd，15，11)(H-3)，6.23(1H，m)(H-4)，6.25(1H，m)(H-5)，5.95(1H，dd，15，11)(H-6)，5.85(1H，m)(H-7)，2.1(1H，m)(H-8a)，2.55(1H，m)(H-8b)，3.89(1H，m)(H-9)，1.3(1H，m)(H-10a)，1.5(1H，m)(H-10b)，3.11(1H，m)(H-11)，1.1(1H，m)(H-12a)，1.56(1H，m)(H-12b)，3.71(1H，m)(H-13)，5.33(1H，dd，15，7.5)(H-14)，6.20(1H，m)(H-15)，6.24(1H，m)(H-16)，6.15(1H，m)(H-17)，5.85(1H，m)(H-18)，5.70(1H，m)(H-19)，2.25(1H，m)(H-20a)，2.45(1H，m)(H-20b)，5.01(1H，m)(H-21)，1.56(1H，m)(H-23a)，1.65(1H，m)(H-23b)，3.60(1H，m)(H-24)，1.09(3H，d，6)(H-25)，3.072(3H，s)(H-26)，4.36(1H，d，7)(9-OH)，4.55(1H，d，4.5)(11-OH)，4.53(1H，d，5)(23-OH).13C NMR(125Hz，DMSO-d6)data，165.76(C-1)，120.03(C-2)，145.50(C-3)，127.52(C-4)，141.11(C-5)，131.19(C-6)，137.06(C-7)，43.42(C-8)，65.96(C-9)，48.02(C-10)，64.02(C-11)，44.66(C-12)，78.96(C-13)，133.34(C-14)，133.08(C-15)，131.73(C-16)，130.27(C-17)，135.46(C-18)，127.88(C-19)，36.62(C-20)，69.87(C-21)，42.1(C-23)，62.76(C-24)，24.41(C-25)，55.13(C-26)。
Wortmannilactone C 淡黃色固體；分子量(FAB-MS)418，高分辨質(zhì)譜HSFAB-MS測定值441.2249(M+Na)，理論值C24H34O6Na 441.2239，分子式C24H34O6[α]D20-9.2°(c0.85CH3OH)；UVλmaxMeOH224.7(ε4.78)，260.9(ε4.88)，270.9(ε4.91)nm.IR(KBr)(cm-1)3520，1711.1H NMR(500Hz，DMSO-d6)5.62(1H，d，15)(H-2)，7.06(1H，dd，15，11)(H-3)，6.13(1H，dd，15，11)(H-4)，6.55(1H，dd，15，11)(H-5)，6.05(1H，m)(H-6)，5.88(1H，m)(H-7)，2.21(1H，m)(H-8a)，2.31(1H，m)(H-8b)，3.73(1H，m)(H-9)，1.21(1H，m)(H-10a)，1.54(1H，m)(H-10b)，3.48(1H，m)(H-11)，2.07(1H，m)(H-12a)，2.21(1H，m)(H-12b)，5.43(1H，m)(H-13)，5.92(1H，m)(H-14)，5.99(1H，m)(H-15)，5.99(1H，m)(H-16)，5.78(1H，15，11)(H-17)，5.47(1H，dd，m)(H-18)，3.84(1H，m)(H-19)，1.75(1H，m)(H-20a)，1.85(1H，m)(H-20b)，5.17(1H，m)(H-21)，1.54(2H，m)(H-23)，3.54(1H，m)(H-24)，1.03(3H，d，6)(H-25)，4.61(1H，d，5)(9-OH)，4.50(1H，d，4.5)(11-OH)，4.68(1H，d，5)(19-OH)，4.58(1H，d，5)(24-OH)，.13C NMR(125Hz，DMSO-d6)data，166.00(C-1)，120.38(C-2)，144.75(C-3)，128.39(C-4)，140.63(C-5)，132.94(C-6)，135.53(C-7)，39.5(C-8)，66.58(C-9)，40.40(C-10)，67.32(C-11)，40.53(C-12)，130.23(C-13)，132.70(C-14)，132.33(C-15)，133.38(C-16)，129.92(C-17)，137.46(C-18)，70.91(C-19)，43.47(C-20)，69.66(C-21)，44.88(C-23)，62.71(C-24)，24.14(C-25)。
Wortmannilactone D 淡黃色固體；分子量(FAB-MS)432，高分辨質(zhì)譜HSFAB-MS測定值455.2418(M+Na)，理論值C24H34O6Na 455.2410，分子式C25H36O6。[α]D20-3.2°(c0.35CH3OH)；UVλmaxMeOH224.7(ε4.79)，260.9(ε4.89)，270.9(ε4.93)nm.IR(KBr)(cm-1)3519，1708。1H(500Hz，DMSO-d6)5.61(1H，d，15)(H-2)，7.04(1H，dd，15，11)(H-3)，6.12(1H，dd，15，11)(H-4)，6.55(1H，dd，15，11)(H-5)，6.05(1H，m)(H-6)，5.84(1H，m)(H-7)，2.21(1H，m)(H-8a)，2.32(1H，m)(H-8b)，3.72(1H，m)(H-9)，1.1(1H，m)(H-10a)，1.54(1H，m)(H-10b)，3.50(1H，m)(H-11)，2.08(1H，m)(H-12a)，2.19(1H，m)(H-12b)，5.45(1H，m)(H-13)，5.95(1H，m)(H-14)，5.95(1H，m)(H-15)，5.84(1H，m)(H-16)，5.83(1H，m)(H-17)，5.31(1H，dd，15，9)(H-18)，3.47(1H，m)(H-19)，1.85(1H，m)(H-20a)，1.95(1H，m)(H-20b)，5.17(1H，m)(H-21)，1.54(2H，m)(H-23)，3.56(1H，m)(H-24)，1.03(3H，d，6)(H-25)，3.06(3H，s)(H-26)，4.40(1H，d，5)(9-OH)，4.62(1H，d，4.5)(11-OH)，4.51(1H，d，5)(23-OH).13C NMR(125Hz，DMSO-d6)data，166.00(C-1)，120.25(C-2)，144.94(C-3)，128.36(C-4)，140.63(C-5)，132.94(C-6)，135.53(C-7)，39.5(C-8)，66.47(C-9)，40.27(C-10)，67.18(C-11)，39.8(C-12)，130.95(C-13)，133.71(C-14)，132.19(C-15)，133.39(C-16)，129.69(C-17)，133.07(C-18)，80.84(C-19)，41.46(C-20)，69.86(C-21)，44.78(C-23)，62.78(C-24)，24.22(C-25)，55.51(C-26)。
結(jié)構(gòu)解析Wortmannilactone AUV譜中224.7nm(ε4.80)，260.9nm(ε4.91)，270.9nm(ε4.95)為最大吸收值，提示出該化合物中有較強(qiáng)的共軛系統(tǒng)存在。IR譜中顯示有酯羰基(1695.9cm-1)。
13CNMR譜中顯示該化合物中有24個碳，其中165.9ppm的碳顯示為酯羰基的特征；120.1～145.7ppm的12個碳顯示為雙鍵次甲基的特征；62.8～70.0ppm的5個碳顯示為連氧亞甲基的特征；37.2～47.6ppm的5個碳為脂肪亞甲基的特征；24.3ppm為甲基碳。1HNMR譜中，該化合物有34個氫存在，在5.53～7.01ppm的12個氫為雙鍵次甲基上氫的信號，仔細(xì)辨別其偶合常數(shù)可以推定雙鍵的偶合方式為反式偶合。
WortmannilactoneA的結(jié)構(gòu)主要通過1H-1H COSY和HMBC可以推出各個碳?xì)涞逆溄雨P(guān)系，從而確定該化合物的結(jié)構(gòu)。根據(jù)δH5.73和羰基碳(C-1 atδc165.9)的在HMBC上的相關(guān)以及它的偶合常數(shù)J＝15Hz，可以把該氫歸位于3位，H2～7及H14～19可以通過COSY譜和氫譜的偶合常數(shù)確定為相鄰的非取代的三烯結(jié)構(gòu)，HMBC譜也支持這一推斷。同時該化合物的UV譜也支持這一推斷。在δC68.03(C-13)連氧次甲基可以通過δH5.33(H-14)和δH4.12(H-13)以及δH4.12(H-13)和δH1.18(H-12a)的COSY相關(guān)確定和亞甲基δC47.06(C-12)和δC137.61(C-14)烯碳相連。而同時δH1.18(H-12a)，δH1.58(H-12b)和C-13(δC68.03)以及δH5.33(H-14)和δC68.03(C-13)在HMBC譜上的相關(guān)也支持該推斷。H9～H12和H20～H25的相鄰關(guān)系也可以同樣通過COSY和HMBC關(guān)系確定。氫譜中在偏低場的4.99ppm(H-21)的氫和其相應(yīng)的70.0ppm(C-21)的碳的化學(xué)位移表明該化合物形成了一個內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，這種連接方式可以被C-1(δC165.9)的化學(xué)位移以及在HMBC譜中H-21和C-1的相關(guān)所證明。δH4.36，4.59，4.53，4.47的羥基氫可以通過δH4.36和δH3.85(H-9)，δH4.59和δH3.27(H-11)，δH4.53和δH4.12(H-13)以及δH4.47和δH3.60(H-24)的相關(guān)關(guān)系歸位為9，11，13，24-OH。所以該化合物被確定為一個22元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯化合物，被命名為Wortmannilactone A。
Wortmannilactone C和Wortmannilactone A有相同的分子式(m/z 441.2249，calcd for C24H34O6Na[M+Na]+，HRFABMS)，根據(jù)13C，1H NMR譜的信號可以確定該化合物同樣為大環(huán)內(nèi)酯類化合物。Wortmannilactone C的大致結(jié)構(gòu)也是通過COSY和HMBC NMR譜推導(dǎo)出的，并發(fā)現(xiàn)和Wortmannilactone A有許多相似之處。但在δC70.91(C-19)連氧次甲基可以通過δH3.84(H-19)和5.47(H-18)，δH3.84(H-19)和δH1.75(H-20a)以及δH1.75(H-20a)和δH5.17(H-21)的COSY相關(guān)確定和亞甲基δC43.47(C-20)和δC137.46(H-18)烯碳相連。而同時δH1.85(H-20b)和δC70.91(C-19)以及5.78(H-17)和δC70.91(C-19)在HMBC譜上的相關(guān)也支持該推斷。δH4.61，4.50，4.68，4.38的羥基氫可以通過4.36 to δH3.73(H-9)，δH4.50 to δH3.48(H-11)δHδH4.38 to δH3.84(H-19)以及4.38to δH3.54(H-24)的相關(guān)關(guān)系歸位為9，11，19，24-OH。
13C，1H NMR譜的信號顯示W(wǎng)ortmannilactone B，D分別是Wortmannilactone A，C的甲酯衍生物。通過一維和二維NMR譜可以確定Wortmannilactone B為Wortmannilactone A-14甲酯，Wortmannilactone D為Wortmannilactone D-19甲酯。
從而確定化合物Wortmannilactones的結(jié)構(gòu)如下
其中R1＝OH時，為化合物Wortmannilactone A，R1＝OCH3時，為化合物Wortmannilactone B。
其中，R2＝OH時，為化合物Wortmannilactone C，R2＝OCH3時，為化合物WortmannilactoneD。
實施例3化合物Wortmannilactone A、B、C、D的活性測定(1)測定方法及實驗數(shù)據(jù)的處理與本申請人在2003年7月10日申請的申請?zhí)枮?3146651.6發(fā)明名稱為醛糖還原酶抑制劑，其制備方法和用途中公開的方法相同。
取化合物Wortmannilactone適量，用甲醇配制成20mg/ml溶液，并逐級稀釋至10mg/ml、5ml/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml。分別取出50微升加入共1000微升的測活體系中，其終濃度分別為1mg/ml(2.39mmol/L)，0.5mg/ml(1.19mmol/L)，0.25mg/ml(0.60mmol/L)，0.125mg/ml(0.30mmol/L)，0.0625mg/ml(0.15mmol/L)，測定其對醛糖還原酶的抑制活性。
測活反應(yīng)的樣品管加入60mmol/L NaPi緩沖液(pH6.2)和適量的酶液，50μl樣品的甲醇溶液；對照孔加入60mmol/L NaPi緩沖液(pH6.2)和適量的酶液，50μl甲醇；空白孔加入60mmol/L NaPi緩沖液(pH6.2)，50μl甲醇。樣品孔、對照孔和空白孔均在37℃保濕15分鐘，各管加入334μl 1.2mol/LLi2SO4、83μl 36mmol/L DL-甘油醛和83μl 1.5mmol/L NADPH開始反應(yīng)，用生化分析儀(RBT 815上海第三分析儀器廠)于340nm波長處測定37℃每分鐘的光密度減少值(ΔOD/min)。
結(jié)果如表1表1

本發(fā)明的實施例中為了簡便起見，A、B、C、D分別代表化合物Wortmannilactone A、Wortmannilactone B、Wortmannilactone C、Wortmannilactone D。
實施例4化合物WortmannilactoneA、C的活性測定(2)體內(nèi)實驗參照Dvornik等的方法并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。(Science1821146-1148 1973)雌性SD大鼠(120～140g)靜脈注射鏈尿霉素70mg/kg，形成試驗性糖尿病大鼠。在三周內(nèi)，大鼠被連續(xù)使用對照食物以及含有本藥物0.8％的食物(1.5g藥物/kg每天)進(jìn)行喂養(yǎng)，每組動物12只。處死大鼠，取出大鼠的晶狀體。測定晶狀體內(nèi)葡萄糖，山梨醇和果糖的濃度。葡萄糖，果糖濃度的測定采用市售試劑盒(德國拜發(fā)公司產(chǎn)品)，山梨醇濃度的測定參照Bergmeyer等的方法。(Clin.Biochem.2，373(1969))。結(jié)果見表2，表中數(shù)據(jù)為減去正常小鼠相應(yīng)值后的數(shù)據(jù)。
表2

P＜0.05從大鼠的體內(nèi)實驗可以看出，上述化合物可以明顯的降低糖尿病大鼠的山梨醇和果糖的積累，從而達(dá)到對糖尿病并發(fā)癥的治療效果，同時對組織內(nèi)葡萄糖沒有影響。
實施例5化合物Wortmannilactone A、B、C、D的活性測定(3)我們按照目前通用的抗腫瘤活性測定方法進(jìn)行了抗腫瘤活性的測定。采用的細(xì)胞系和實驗用材料均能夠很方便購得。RPMI1640和磺酰羅丹明B均購自Sigma公司。
取指數(shù)生長期細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(RPMI1640)配成細(xì)胞數(shù)為2.5×104/ml的懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，加入待試藥物。于培養(yǎng)后72小時后使用磺酰羅丹明B(SRB)法測定藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
磺酰羅丹明B(SRB)法的測定方法為用1％醋酸配成0.4％溶液。細(xì)胞在加藥培養(yǎng)結(jié)束后用終濃度為10％三氯醋酸固定細(xì)胞，放置1小時。用去離子水洗5遍，甩干，空氣干燥。每孔加入100ul SRB染料。結(jié)合的SRB用150μl 10mmol/L非緩沖Tris堿液(pH10.5)溶解。用酶標(biāo)儀測定其在515nm處的吸光度。
實驗結(jié)果見表3表3化合物的抗腫瘤活性IC50(μmol/L)

由以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的化合物有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
實施例6化合物Wortmannilactone A、C的活性測定(4)實驗方法將S180腫瘤細(xì)胞(購自武漢細(xì)胞所)腹腔注射昆明小鼠(KM小鼠)體內(nèi)生長6-8天后，抽取小鼠的腹水，用生理鹽水洗滌并稀釋(107/ml)后，接種到體重均一的KM小鼠腋下(0.2ml/只)，24小時后，將小鼠隨機(jī)分為陰性對照組、陽性藥對照組、受試物各劑量組，每組10只，各組小鼠平均體重相差＜1g，接種瘤株24小時后開始給藥，連續(xù)給藥7天.結(jié)束給藥后5天處死小鼠剝離瘤塊，并稱重，計算抑瘤率.
抑瘤率＝(1-實驗組小鼠平均瘤重/對照組小鼠平均瘤重)*100％實驗結(jié)果見表4
表4

P＜0.05實驗結(jié)論受試品在該實驗條件下，對S180荷瘤小鼠具有較強(qiáng)的抑瘤作用。
權(quán)利要求
1.如下式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥 其中R1＝OH時，為化合物Wortmannilactone A，R1＝OCH3時，為化合物Wortmannilactone B。
2.權(quán)利要求1所述的化合物的同分異構(gòu)體及可藥用鹽、溶劑化物、立體異構(gòu)體或前藥，如下式(II) 其中，R2＝OH時，為化合物Wortmannilactone C，R2＝OCH3時，為化合物WortmannilactoneD。
3.一種制備權(quán)利要求1或2所述的化合物的方法，其包括培養(yǎng)產(chǎn)生式(I)或(II)的化合物的微生物，然后對所得發(fā)酵液進(jìn)行分離和純化。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述的微生物為鄔氏黃絲曲霉(Talaromyceswortmannii)CGMCC No.1224。
5.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1或2的化合物作為活性成份和可藥用載體。
6.權(quán)利要求1或2的化合物或權(quán)利要求5所述的藥物組合物，制備用于醛糖還原酶抑制劑可預(yù)防和/或治療的疾病的藥物中的用途。
7.權(quán)利要求1或2的化合物或權(quán)利要求5所述的藥物組合物，制備用于治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述的糖尿病并發(fā)癥選自由下面并發(fā)癥組成的組糖尿病腎病、糖尿病眼病、糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病心臟病、糖尿病動脈硬化和糖尿病微血管病。
9.權(quán)利要求1或2的化合物或權(quán)利要求5所述的藥物組合物，制備用于抗腫瘤藥物中的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述的腫瘤為以下之一結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、白血病。
全文摘要
本發(fā)明提供了下面分子式(I)的化合物Wortmannilactone A、B及其同分異構(gòu)體C、D如分子式(II)所示，其制備方法和含有它們的藥物組合物，所述化合物及含有它們的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防糖尿病并發(fā)癥及治療癌癥。其中，R
文檔編號A61P3/10GK1796382SQ20051008427
公開日2006年7月5日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月27日
發(fā)明者賀建功, 張華 , 董悅生, 任曉, 林潔, 劉梅, 路新華, 崔小蘭, 李韶菁, 朱京童, 白玉 申請人:華北制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司