專利名稱：一種表達(dá)trail蛋白質(zhì)的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌的醫(yī)療用途，具體地說(shuō)涉及一種表達(dá)TRAIL蛋白質(zhì)的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的主要疾病，目前在腫瘤治療上存在兩大難題一是腫瘤治療有效的手段與方法。傳統(tǒng)的腫瘤治療模式如手術(shù)切除，放、化療等，具有治療效果差，副反應(yīng)大等缺點(diǎn)，隨著分子生物學(xué)與基因工程學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多新的而有效的治療方法如單克隆抗體，促細(xì)胞凋亡因子，血管生成抑制劑，細(xì)胞因子及自殺基因等的應(yīng)用。這些方法的出現(xiàn)，給腫瘤治療帶來(lái)了新的契機(jī)，同時(shí)，也帶來(lái)了新的問(wèn)題，即腫瘤治療上的第二大難題——腫瘤治療的靶向性問(wèn)題，如何讓新的腫瘤治療試劑能在腫瘤特定的部位發(fā)揮更強(qiáng)大的作用，無(wú)疑會(huì)給腫瘤治療帶來(lái)一個(gè)飛躍性的發(fā)展。隨著對(duì)細(xì)菌的深入認(rèn)識(shí)，人們發(fā)現(xiàn)，很多細(xì)菌如梭狀芽胞桿菌、雙岐桿菌、霍亂弧菌、利斯特菌、沙門菌及大腸桿菌等具有特異的聚集于腫瘤組織，并可在腫瘤組織中生長(zhǎng)繁殖的特性，有些細(xì)菌還具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用(Pawelek J.M，LowK.B，Bermudes D.Bacteria as tumor-targeting vectors.Lancet Oncol，2003，4548-556.；Zhao Ming，Yang Meng，Xiao Ming，et aI.Tumor-targeting bacterial therapywith amino acid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium.PNAS，2005，102755-760)。利用這一特性，掀起了一場(chǎng)關(guān)于細(xì)菌在腫瘤靶向治療中應(yīng)用的重大變革。
厭氧菌屬的芽胞桿菌、雙岐桿菌和兼性厭氧屬的沙門氏菌用于腫瘤治療各有其本身的不足，要么就是毒性太大，要么就是其腫瘤靶向性受到腫瘤大小的限制。所以目前迫切的需要尋找一類即無(wú)毒又不受腫瘤大小的限制，同時(shí)又具有良好的腫瘤靶向性的細(xì)菌用于腫瘤方面的治療。
大腸桿菌(E.coli)屬革蘭陰性桿菌，是寄生于人類和動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群。目前常用的大腸桿菌工程菌主要有DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802、K803等，它們的基因組穩(wěn)定，遺傳背景清楚，更重要的是其無(wú)毒，廣泛用于基因工程的各個(gè)方面，如作為克隆載體或是某些效應(yīng)基因的表達(dá)載體等。大腸桿菌應(yīng)用于腫瘤的診斷及治療，除具有細(xì)菌本身的優(yōu)勢(shì)外，還有其獨(dú)有的特點(diǎn)首先，大腸桿菌屬胞外菌，比胞內(nèi)菌更易被抗生素清除；其次，非致病性大腸桿菌是無(wú)毒的細(xì)菌，不須先對(duì)細(xì)菌進(jìn)行減毒或弱毒改造即可應(yīng)用；再次，對(duì)大腸桿菌的基因組了解比較全面，改造起來(lái)更容易；最后，大腸桿菌是兼性厭氧菌，即可在腫瘤的壞死區(qū)域聚集，也可在氧性豐富的部位聚集，在腫瘤的選擇方面不受腫瘤大小及腫瘤內(nèi)是否缺氧的限制。
大腸桿菌也像其它細(xì)菌一樣，具有腫瘤靶向性，當(dāng)靜脈注射細(xì)菌于荷瘤小鼠體內(nèi)時(shí)，在注菌的第二天，即可在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌的存在，但大腸桿菌本身是否具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用則未見(jiàn)報(bào)道。研究還發(fā)現(xiàn)，原位接種MCF-7腫瘤的小鼠在靜脈給予大腸桿菌后，大腸桿菌不僅能到達(dá)原位腫瘤處，在對(duì)側(cè)的轉(zhuǎn)移瘤處也發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌的存在(Yong A Yu，Shahrokh Shabahang，Tatyana M Timiryasova，et al.Visualization of tumors and metastases in live animalswith bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins.nature biotechnology，2004，22(3)313-321)，提示大腸桿菌在腫瘤的診斷與發(fā)現(xiàn)上具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。
TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand)是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子(TNF)家族中的一個(gè)成員，其在結(jié)構(gòu)上與FasL非常相似，人與鼠的TRAIL分別有281和291個(gè)氨基酸，同源性達(dá)65％。人TRAIL分子量為32.5kD，為II型跨膜蛋白，由胞漿區(qū)(14個(gè)氨基酸)，跨膜區(qū)(26個(gè)氨基酸)和胞膜外區(qū)(241個(gè)氨基酸)組成?？扇苄訲RAIL分子(sTrail)由膜外區(qū)的95～281位氨基酸組成，參與特異性的受體結(jié)合，研究者發(fā)現(xiàn)，從95位、104位或114位殘基開(kāi)始構(gòu)建克隆表達(dá)出的蛋白質(zhì)均具有生物學(xué)活性。
TRAIL具有較強(qiáng)的促細(xì)胞凋亡作用，體外實(shí)驗(yàn)表明，無(wú)論是膜結(jié)合型還是可溶性的TRAIL，都能迅速誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL特異受體的細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，通過(guò)受體的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑。迄今為止，人們已發(fā)現(xiàn)TRAIL的5種特異性受體TRAIL-R1(DR4)，TRAIL-R2(DR5)，TRAIL-R3(DcR1)，TRAIL-R4(DcR2)和osteoprotegerin(OPG)。其中，DR4和DR5是2種具有完整胞質(zhì)區(qū)的受體，與TRAIL結(jié)合可引起細(xì)胞凋亡，而DcR1和DcR2缺少完整的胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域，是2種缺陷型膜受體，同TRAIL結(jié)合后不能傳遞凋亡信號(hào)，且可競(jìng)爭(zhēng)抑制TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能(Sheridan JP，Marsters SA，Pitti RM.Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoyreceptors.Science，1997，277818-821.)。
體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TRAIL可以殺傷多種腫瘤細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞，惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞及HIV患者的淋巴細(xì)胞等(Griffith T S，Chin W A，Jackson G C.Intracellular regulation of TRAIL-inducedapoptosis in human melanoma cell.J Immunol，1998，161(6)2833～2840)。因此，TRAIL被認(rèn)為是一種很有前途的廣譜抗癌藥物。
TRAIL不僅在體外能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，在小鼠和非人類靈長(zhǎng)目類動(dòng)物的臨床前實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)TRAIL能特異性的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)正常組織和器官無(wú)毒副作用。但M.Jo等研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL在體外能引起人類肝細(xì)胞凋亡，而對(duì)大鼠、小鼠或恒河猴的肝細(xì)胞無(wú)毒，TRAIL在人體內(nèi)是否能引起肝損傷或其他臟器的損傷則尚無(wú)定論。故使TRAIL能在特定的部位發(fā)揮促腫瘤細(xì)胞凋亡的作用具有更為重要的生物學(xué)意義。
目前，把大腸桿菌與TRAIL聯(lián)系起來(lái)，利用大腸桿菌的腫瘤靶向性把TRAIL帶到腫瘤部位，在特定部位發(fā)揮TRAIL的抗腫瘤作用尚無(wú)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了使TRAIL能在腫瘤特定的部位發(fā)揮其抗腫瘤作用，解決TRAIL對(duì)正常組織與器官的毒性作用問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種具有腫瘤靶向性的大腸桿菌，該大腸桿菌攜帶TRAIL基因。
本發(fā)明還公開(kāi)了上述表達(dá)TRAIL蛋白質(zhì)的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途。
本發(fā)明的大腸桿菌包括大腸桿菌各個(gè)種及其經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的大腸桿菌工程菌如DH5α、BL21、JM109等。
本發(fā)明的大腸桿菌包含攜帶有TRAIL基因的載體。其中的TRAIL基因包括TRAIL全長(zhǎng)以及可溶性TRAIL(sTrail)的各個(gè)片段，包括95～281aa片段及114～281aa片段等。TRAIL全長(zhǎng)氨基酸序列如序列表中序列8所示。95～281aa片段及114～281aa片段的氨基酸序列如序列表中序列6和序列7所示。其中攜帶有TRAIL基因的載體為各種原核表達(dá)載體，如pGEX-KG、pET-28a(+)及pBV220等。
本發(fā)明所述的腫瘤為各種實(shí)體瘤，包括鼠黑色素腫瘤B16-F10-luc-G5、人乳腺癌MCF-7-luc-F5、人肝癌BEL-7405-luc及SMMC-7721-luc、人前列腺癌PC-3、鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6、鼠膀胱腫瘤MB-49及人纖維肉瘤HT1080等。
本發(fā)明的攜帶TRAIL基因的大腸桿菌的制備方法包括如下步驟1、合成引物，通過(guò)PCR反應(yīng)，制備如上所述的TRAIL全長(zhǎng)及sTrail片段；2、將獲得的TRAIL全長(zhǎng)及sTrail片段克隆入上述原核表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體；3、將獲得的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化上述的大腸桿菌，獲得攜帶TRAIL基因大腸桿菌。
其中獲得的重組原核表達(dá)載體包括由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的GST-sTrail融合蛋白pGEX-sTrail(95～281aa)載體或6His-sTrail融合蛋白pET-sTrail(95～281aa)載體或由溫度控制誘導(dǎo)表達(dá)非融合蛋白pBV220-sTrail(114～281aa)載體。
本發(fā)明公開(kāi)的攜帶TRAIL基因的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途通過(guò)如下實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
1、首先制備小鼠腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型，上述模型是通過(guò)先培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，然后將腫瘤細(xì)胞接種小鼠制備的。其中小鼠為BALB/C小鼠和nu/nu裸鼠，腫瘤為上述的各種實(shí)體瘤；2、然后構(gòu)建發(fā)光細(xì)菌并進(jìn)行檢測(cè)，其中發(fā)光細(xì)菌是通過(guò)將發(fā)光質(zhì)粒pXen-1(luxABCDE)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中構(gòu)建，然后通過(guò)IVIS成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)；3、觀察細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的分布特征及腫瘤定位特性。將上述制備的發(fā)光細(xì)菌注射荷瘤小鼠，觀察到細(xì)菌分布于腫瘤組織，細(xì)菌可在腫瘤中定位。
4、將上述制備的攜帶TRAIL基因大腸桿菌尾靜脈注射于荷瘤小鼠，觀察大腸桿菌對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。實(shí)驗(yàn)證明上述大腸桿菌能延緩或抑制腫瘤生長(zhǎng)或使腫瘤消失。
5、將上述制備的攜帶TRAIL基因大腸桿菌注射小鼠轉(zhuǎn)移瘤模型，證明其具有定位于轉(zhuǎn)移瘤的能力。
本發(fā)明的攜帶TRAIL基因大腸桿菌，可以特異性定位于機(jī)體腫瘤及轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，將TRAIL帶到腫瘤特定的部位，發(fā)揮抗腫瘤作用。本發(fā)明的大腸桿菌加入藥學(xué)上可接受的輔料，以維持該大腸桿菌的活性及穩(wěn)定性，可以制備用于腫瘤診斷或治療的藥物。
該藥物可以制成適于本發(fā)明所述大腸桿菌發(fā)揮抗腫瘤作用的各種劑型，如片劑、散劑、膠囊劑、栓劑、注射劑、混懸劑等，優(yōu)選注射劑。給藥途徑為口服、肌肉注射、靜脈注射等多種，優(yōu)選靜脈注射。
本發(fā)明利用大腸桿菌的腫瘤靶向性，把TRAIL帶到腫瘤部位，這樣解決了TRAIL對(duì)正常組織與器官的毒性作用，也使TRAIL能在腫瘤局部發(fā)揮更強(qiáng)、更持久的作用，同時(shí)發(fā)揮了大腸桿菌的抗腫瘤作用，用于制備腫瘤診斷或治療的藥物，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。


圖1為發(fā)光細(xì)菌在正常小鼠中的分布圖。其中A圖是尾靜脈注射E.coliDH5α(1×109cfu/100ul/鼠)于正常小鼠10～20分鐘后的成像情況，可見(jiàn)發(fā)光細(xì)菌分布于小鼠的雙肺，B圖是尾靜脈注射E.coli DH5α(1×109cfu/100ul/鼠)3天后的成像情況，可見(jiàn)發(fā)光細(xì)菌分布于小鼠的肝臟，其他大腸桿菌工程菌在正常小鼠或裸鼠中的分布情況與此相類似。
圖2為發(fā)光細(xì)菌在荷瘤小鼠中的分布圖。其中A圖是尾靜脈注射E.coliDH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠1天時(shí)的成像情況，B圖是尾靜脈注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠2天時(shí)的成像情況，圈中所示的是小鼠腫瘤接種的部位，即腫瘤接種于小鼠右后腿皮下，發(fā)光的區(qū)域是發(fā)光細(xì)菌聚集于腫瘤組織，其他大腸桿菌工程菌在黑色素瘤小鼠或荷有其他實(shí)體瘤小鼠中的分布情況與此相類似。
圖3為尾靜脈注射E.coli DH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠13天后小鼠的解剖情況。其中A圖是不同器官的曝光情況1-肝臟，2-肺臟，3-心臟，4-腎臟，5-脾臟，6-胃及腸，曝光時(shí)間300s，所有器官未見(jiàn)有發(fā)光細(xì)菌的存在。B圖是整個(gè)腫瘤的曝光情況，曝光時(shí)間30s，可見(jiàn)有大量發(fā)光細(xì)菌的存在。C圖是一切為二的腫瘤曝光情況，曝光時(shí)間30s，從C圖可以看出發(fā)光細(xì)菌主要存在于腫瘤的邊緣區(qū)域，在腫瘤中間的壞死區(qū)域則存在的很少。其他大腸桿菌工程菌在荷有黑色素瘤或其他實(shí)體瘤小鼠中的情況與此相類似。
圖4為大腸桿菌DH5α(GST-sTrail)對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用圖，此工程菌對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤的作用與此相類似。
圖5為大腸桿菌BL21(6his-sTrail)對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用圖，此工程菌對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤的作用與此相類似。
圖6為大腸桿菌JM109(GST-sTrail)對(duì)荷有黑色素瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用圖，此工程菌對(duì)荷有其他實(shí)體瘤小鼠腫瘤的作用與此相類似。
圖7為注射表達(dá)有GST-sTrail的E.coliDH5α(1×108cfu/100ul/鼠)于荷有黑色素瘤小鼠28天后腫瘤生長(zhǎng)的情況。其中A圖為空載體組小鼠即注射E.coliDH5α(pGEX-KG)的小鼠，圈中所示小鼠腫瘤長(zhǎng)的很大，且出現(xiàn)潰爛、壞死的現(xiàn)象；B圖是實(shí)驗(yàn)組小鼠即注射E.coliDH5α(GST-sTrail))的小鼠，圈中所示小鼠腫瘤明顯縮小，僅能在皮下看到一小團(tuán)黑色腫瘤細(xì)胞。
圖8為E.coli DH5α定位于裸鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移灶。其中A圖是取自注菌4天后的黑色素瘤轉(zhuǎn)移模型裸鼠的肺臟，可見(jiàn)肺上布滿了大大小小的黑色腫瘤轉(zhuǎn)移灶；B圖是將左圖的肺臟，曝光120s后，可見(jiàn)發(fā)光細(xì)菌定位于肺臟的腫瘤轉(zhuǎn)移灶，而在沒(méi)有腫瘤轉(zhuǎn)移灶的其他臟器，則未見(jiàn)有發(fā)光細(xì)菌的存在。其他大腸桿菌工程菌在轉(zhuǎn)移瘤中的定位情況與此相類似。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 動(dòng)物腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型的建立一、材料(一)細(xì)胞、細(xì)菌及培養(yǎng)基腫瘤細(xì)胞B16-F10-luc-G5、MCF-7-luc-F5、BEL7405-luc及SMMC7721-luc購(gòu)于Xenogen公司，PC-3、C6、MB-49及HT1080購(gòu)于ATCC公司，E.coli DH5α、BL21、JM109市購(gòu)，本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、DMEM，胎牛血清為Sigma公司產(chǎn)品。細(xì)菌培養(yǎng)基LB中各成分蛋白胨、酵母提取物購(gòu)于OXOID公司，氯化鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。
(二)質(zhì)粒、載體及文庫(kù)pXen-1(luxABCDE)質(zhì)粒購(gòu)于Xenogen公司，pGEX-KG、pET-28a(+)及pBV220市購(gòu)，由本實(shí)驗(yàn)室保存，人乳腺cDNA文庫(kù)購(gòu)于Clotech公司。
(三)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C小鼠和nu/nu裸鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。BALB/C小鼠均為雄性，nu/nu BALB/C裸鼠雌雄各半，5～6周齡，體重在20±5g。
(四)儀器設(shè)備IVIS成像系統(tǒng)(Xenogen公司)；UV-1601型紫外分光光度計(jì)(Bio Rad公司)；Steri-cycle CO2培養(yǎng)箱(Thermo ELECTRON公司)；低溫超速離心機(jī)(Sigma公司)；OLYMPUS顯微鏡；PCR儀(Biometra公司)(五)引物設(shè)計(jì)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程醫(yī)學(xué)研究所合成以下引物pGEX-TRAIL引物設(shè)計(jì)如下P1如序列表中序列1所示；P2如序列表中序列2所示。pGEX-sTrail(95～281aa)及pET-sTrail(95～281aa)引物設(shè)計(jì)如下P1如序列表中序列3所示；P2同TRAIL全長(zhǎng)的P2引物設(shè)計(jì)。酶切位點(diǎn)為BamH1和XholI。
pBV220-sTrail(114～281aa)的引物設(shè)計(jì)如下P1如序列表中序列4所示；P2如序列表中序列5所示。
酶切位點(diǎn)為EcoRI和PstI。
二、方法(一)腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)及制備B16-F10、MCF-7、PC-3、MB-49及HT1080細(xì)胞的培養(yǎng)基組成成分與比例為DMEM 90％，F(xiàn)BS 10％。C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤、BEL7405及SMMC7721細(xì)胞的培養(yǎng)基組成成分與比例為RPMI-1640 90％，F(xiàn)BS 10％。將細(xì)胞置于37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行換液或傳代。
常規(guī)方法消化、收集細(xì)胞，1200rpm離心10min，棄上清，并用生理鹽水洗細(xì)胞三次，最后以血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。最終將細(xì)胞重懸于生理鹽水中，使其終濃度為5×107cell/ml或5×106cell/ml。
(二)腫瘤模型及轉(zhuǎn)移瘤模型的建立BALB/C小鼠及裸鼠腫瘤模型均采用右后腿皮下接種腫瘤細(xì)胞(5×106cell/100μl/鼠)，裸鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移模型均采用尾靜脈注入腫瘤細(xì)胞的方式(5×105cell/100μl/鼠)。
三、結(jié)果BALB/C小鼠及裸鼠的腫瘤模型在接種腫瘤細(xì)胞的7～10天后即能形成可觸及的腫瘤；裸鼠的轉(zhuǎn)移瘤模型在靜脈注入腫瘤的細(xì)胞的7～14天后形成，轉(zhuǎn)移部位肺轉(zhuǎn)移占80％以上，其他如肝、淋巴結(jié)、脂肪、骨等也可有轉(zhuǎn)移灶。
實(shí)施例二 發(fā)光細(xì)菌的構(gòu)建及檢測(cè)一、材料同實(shí)施例一。
二、方法(一)發(fā)光細(xì)菌的制備細(xì)菌培養(yǎng)基LB按常規(guī)配制，大腸桿菌DH5α，BL21，JM109等感受態(tài)細(xì)胞按常規(guī)制備。
按常規(guī)方法將pXen-1(luxABCDE)分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，BL21，JM109中，涂板后采用IVIS成像系統(tǒng)觀察克隆的發(fā)光情況及效率。
(二)實(shí)驗(yàn)前細(xì)菌的處理①在給小鼠注菌的前一天，挑取發(fā)光效率較高的單克隆菌落于帶有Amp抗性的LB中培養(yǎng)過(guò)夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接該菌，繼續(xù)搖至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期即OD600＝0.6～1.0。
②按1OD＝8×108cfu/ml計(jì)算菌量，然后離心，去除LB，并用無(wú)菌生理鹽水徹底洗三遍，最終稀釋到1×109cfu/ml。
③從制備好的菌液中取100μl用于小鼠的尾靜脈注射。
(三)注菌于荷瘤小鼠當(dāng)小鼠接種腫瘤7～10天后，以尾靜脈注射的方式給小鼠注菌，注菌劑量是1×108cfu/100μl/鼠。
三、結(jié)果通過(guò)以上方法制備的發(fā)光細(xì)菌，發(fā)光效率較高，注入到動(dòng)物體內(nèi)后，可在活體情況下，觀察細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的分布，從而追蹤細(xì)菌的定位(見(jiàn)附圖1～2)。
實(shí)施例三 細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的分布特征及腫瘤定位特性研究一、材料同實(shí)施例一。
二、方法與結(jié)果(一)細(xì)菌在正常小鼠中分布的特點(diǎn)靜脈給予2×109cfu/100μl/鼠或1×109cfu/100μl/鼠細(xì)菌于正常小鼠體內(nèi)的10～20min內(nèi)，可見(jiàn)細(xì)菌分布于肺，然后細(xì)菌漸向肝臟聚集，并定位于肝臟(見(jiàn)附圖1)。大部分小鼠不能耐受大于1×109cfu/100μl/鼠劑量的細(xì)菌，多數(shù)小鼠于注菌的第二天死亡，尸檢結(jié)果顯示細(xì)菌主要聚集于小鼠的肺臟與肝臟，未死或數(shù)天后死亡的小鼠尸檢結(jié)果則顯示細(xì)菌只分布于肝臟。靜脈注射1×108cfu/100μl/鼠細(xì)菌的小鼠則能全部存活，且細(xì)菌的分布最終也只分布于肝臟。
(二)細(xì)菌在荷瘤小鼠中分布的特點(diǎn)靜脈注射1×108cfu/100μl/鼠細(xì)菌于荷瘤小鼠，注菌之初，細(xì)菌在荷瘤小鼠體內(nèi)的分布與在正常小鼠中的分布類似，但在注菌的第二天，荷瘤小鼠的腫瘤部位即有光的存在(見(jiàn)附圖2)。解剖小鼠，分別取正常組織與腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)只有腫瘤部位有較強(qiáng)的光，正常組織如肝、肺、心、腎及胃腸等則無(wú)光，提示細(xì)菌全部分布在腫瘤組織。而且我們也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于較大的腫瘤，細(xì)菌主要分布于腫瘤組織的周邊，在腫瘤中心的壞死區(qū)域，細(xì)菌則分布的較少，說(shuō)明大腸桿菌主要聚集于氧份比較豐富的腫瘤區(qū)域(見(jiàn)附圖3)。我們的研究還發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射1×107cfu/100μl/鼠細(xì)菌的荷瘤小鼠在注菌的第二天進(jìn)行解剖后，腫瘤部位就有光的存在，而在正常組織則無(wú)光，提示較少的細(xì)菌也可在腫瘤中定位。以上的結(jié)果也提示轉(zhuǎn)化有pXen-1的大腸桿菌并未改變其腫瘤靶向性。
實(shí)施例四 表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)一、材料同實(shí)施例一。
二、方法與結(jié)果(一)pGEX-TRAIL、pGEX-sTrail(95～281aa)及pET-sTrail(95～281aa)克隆的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)(1)PCR反應(yīng)以人乳腺cDNA文庫(kù)為模板，按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)①94℃預(yù)變性1min；②94℃變性1min；③55℃退火1min；④72℃延伸1min；⑤72℃延伸10min；⑥4℃停止②③④循環(huán)30次，整個(gè)反應(yīng)體系50μl，所加的酶是Taq DNA聚合酶。
(2)高效表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建將PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，回收所需片段，用BamH1和XholI雙酶切，電泳后回收Trail或sTrail片段分別克隆入原核表達(dá)載體pGEX-KG和pET-28a(+)的BamH1和XholI位點(diǎn)，構(gòu)建成pGEX-sTrail(95～281aa)及pET-sTrail(95～281aa)重組體，分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α和BL21，在含有抗性篩選標(biāo)記的LB培養(yǎng)板上挑取單菌落，30℃搖床培養(yǎng)8h后，行菌落PCR，批出目的基因片段的菌株即為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的菌液轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，用BamH1和XholI雙酶切，進(jìn)一步鑒定出目的菌株，最后通過(guò)DNA測(cè)序確定陽(yáng)性克隆。
(3)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)取工程菌單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液(含抗性篩選標(biāo)記)30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新鮮LB中，繼續(xù)在30℃搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600為0.4～0.6)，在終濃度為0.1mmol/l的IPTG誘導(dǎo)下，20℃搖菌14～16h，離心收集菌體，以超聲裂菌法裂菌，并行SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物及表達(dá)形式。
誘導(dǎo)表達(dá)后，pGEX-sTrail(95～281aa)SDS-PAGE顯示在約46KD處有一條新生條帶，而pET-sTrail(95～281aa)SDS-PAGE顯示在約26KD處有一條新生條帶，表達(dá)量均約占菌體總蛋白的60％，表達(dá)形式為部分可溶性表達(dá)。
(二)pBV220-sTrail(114～281aa)克隆的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)(1)PCR反應(yīng)以pGEX-sTrail(95～281aa)載體為模板，按上述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
(2)重組載體的構(gòu)建將PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，回收所需片段，并與T載體相連，于16℃連接2～4h。
(3)高效表達(dá)載體和工程菌的構(gòu)建將連接后的T載體用EcoRI和PstI雙酶切，電泳后回收sTrail片段克隆入原核表達(dá)載體pBV220的EcoRI和PstI位點(diǎn)，構(gòu)建成pBV220-sTrail重組體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α或JM109，在含Amp的LB培養(yǎng)板上挑取單菌落，30℃搖床培養(yǎng)8h后，行菌落PCR，批出目的基因片段的菌株即為陽(yáng)性克隆。將陽(yáng)性克隆的菌液轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，用EcoRI和PstI雙酶切，進(jìn)一步鑒定出目的菌株，最后通過(guò)DNA測(cè)序確定陽(yáng)性克隆。
(4)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)取工程菌單菌落接種于5ml LB培養(yǎng)液(含Amp 100mg/L)，30℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到含Amp的培養(yǎng)液中，繼續(xù)在30℃搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(OD600為0.4～0.6)，迅速升溫至39℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心收集菌體，以超聲裂菌法裂菌，并行SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物及表達(dá)形式。
誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE顯示在約18.5KD處有一條新生條帶，表達(dá)量約占菌體總蛋白的20％，表達(dá)形式為部分可溶性表達(dá)。
實(shí)施例五 基因工程改造菌對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用一、材料同實(shí)施例一。
二、方法與結(jié)果在接種腫瘤的第7～10天，將15只小鼠隨機(jī)的分為三組，分別是空白對(duì)照組，空載體組及實(shí)驗(yàn)組，每組5只。其中空白對(duì)照組給予100ul生理鹽水/鼠，空載體組分別給予1×108cfu/100μl/鼠DH5α(pGEX-KG)、DH5α(pBV220)、BL21(pET-28a(+))或JM109(pGEX-KG)，實(shí)驗(yàn)組對(duì)應(yīng)空載體組分別給予1×108cfu/100μl/鼠DH5α(pGEX-sTrail)、DH5α(pBV220-sTrail)、BL21(pET-sTrail)或JM109(pGEX-sTrail))，觀察攜帶sTrail的E.coli對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的作用。觀測(cè)的指標(biāo)是小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)變化，腫瘤體積的計(jì)算公式為V＝L×W2×0.5(其中L為腫瘤的長(zhǎng)軸，W為腫瘤的短軸)。統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，進(jìn)行樣本均數(shù)的兩兩比較，方法采用的是Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，即q檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠腫瘤體積的增長(zhǎng)變化在空載體組與對(duì)照組間無(wú)明顯差別(P＞0.05)，但在實(shí)驗(yàn)組與空載體組間或是與對(duì)照組間則差別明顯(P＜0.05)。靜脈注射攜帶sTrail的E.coliDH5α(pGEX-sTrail)的小鼠，其腫瘤生長(zhǎng)較空載體組及對(duì)照組緩慢，在注菌后的第21天，實(shí)驗(yàn)組的5只小鼠中，有3只小鼠的腫瘤體積縮小、變平的較為明顯，到了第27天，腫瘤幾乎完全消退，僅在小鼠接種腫瘤處的皮下見(jiàn)一點(diǎn)黑色素瘤細(xì)胞；另外2只小鼠的腫瘤體積雖未完全消退，但也有減小的趨勢(shì)，而對(duì)照組與空載體組小鼠的腫瘤體積則持續(xù)增長(zhǎng)，且有的小鼠腫瘤出現(xiàn)潰爛壞死之現(xiàn)象，見(jiàn)附圖7。提示體外誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)GST-sTrail，當(dāng)以靜脈注射的方式將細(xì)菌打到小鼠體內(nèi)時(shí)，大腸桿菌可以將sTrail特異地帶到腫瘤部位，使其發(fā)揮強(qiáng)大的抗腫瘤作用。其他攜帶有sTrail的工程菌如DH5α(pBV220-sTrail)、BL21(pET-sTrail)、JM109(pGEX-sTrail)等也有不同程度的延緩或抑制小鼠各類腫瘤生長(zhǎng)的作用(見(jiàn)附圖4～6)。
實(shí)施例六 基因工程改造菌在轉(zhuǎn)移瘤發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用一、材料同實(shí)施例一。
二、方法與結(jié)果按上述方法構(gòu)建裸鼠黑色素瘤、肝癌及乳腺癌等轉(zhuǎn)移瘤模型，1～2周后，按0.1ml/10g腹腔注射底物，活體成像后，可以判斷轉(zhuǎn)移瘤模型是否構(gòu)建成功。
當(dāng)模型構(gòu)建成功后，按上述方法，尾靜脈注菌，觀察基因工程改造E.coli是否具有定位于轉(zhuǎn)移瘤的能力。
結(jié)果尾靜脈注射黑色素瘤，肝癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)，10天后活體成像可見(jiàn)肺臟轉(zhuǎn)移瘤構(gòu)建成功，尾靜脈注入1×108cfu/100μl/鼠的大腸桿菌3～4天后，解剖小鼠可見(jiàn)肺臟布滿了大小不同的黑色轉(zhuǎn)移灶，成像顯示，在肺臟轉(zhuǎn)移灶有發(fā)光細(xì)菌存在，說(shuō)明大腸桿菌可定位于腫瘤的轉(zhuǎn)移灶(見(jiàn)附圖8)。
序列表<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心<120>一種表達(dá)TRAIL蛋白質(zhì)的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途<130>
<160>8<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>
<400>1cgggatccat ggctatgatg gaggtcc 27<210>2<211>29<212>DNA<213>
<400>2ccgctcgagt tagccaacta aaaaggccc 29<210>3<211>29<212>DNA<213>
<400>3cgggatccac ctctgaggaa accatttct 29<210>4<211>32<212>DNA<213>
<400>4gcgaattcat ggtgagagaa agaggtcctc ag 32<210>5<211>30<212>DNA<213>
<400>5cgctgcagtt agccaactaa aaaggccccg30<210>6<211>187<212>PRT<213>
<400>6Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile1 5 10 15
Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile20 25 30Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys35 40 45Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg50 55 60Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu65 70 75 80Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe85 90 95Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met100 105 110Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu115 120 125Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly130 135 140Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp145 150 155 160Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His165 170 175Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly180 185<210>7<211>168<212>PRT<213>
<400>7Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr1 5 10 15Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys20 25 30Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His35 40 45Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His50 55 60Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
65 70 75 80Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr85 90 95Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser100 105 110Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser115 120 125Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe130 135 140Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser145 150 155 160Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly165<210>8<211>281<212>PRT<213>
<400>8Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys1 5 10 15Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala20 25 30Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys35 40 45Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr50 55 60Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val65 70 75 80Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser85 90 95Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro100 105 110Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly115 120 125Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu130 135 140
Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile165 170 175His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe180 185 190Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln195 200 205Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys210 215 220Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr225 230 235 240Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile245 250 255Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala260 265 270Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly275 280
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)TRAIL蛋白質(zhì)的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中大腸桿菌為大腸桿菌各個(gè)種及其在此基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)遺傳工程改造的大腸桿菌工程菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述用途，其中大腸桿菌為DH5α、BL21或JM109。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中大腸桿菌包含攜帶有TRAIL基因的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述用途，其中TRAIL基因?yàn)門RAIL全長(zhǎng)或其可溶性TRAIL的各個(gè)片段，TRAIL全長(zhǎng)氨基酸序列如序列表中序列8所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用途，其中TRAIL基因?yàn)門RAIL的95～281aa片段或114～281aa片段，其氨基酸序列分別如序列表中序列6和序列7所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述用途，其中載體為原核表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述用途，其中載體為pGEX-KG、pET-28a(+)或pBV220。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述用途，其中腫瘤為實(shí)體瘤。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或9所述用途，其中腫瘤為鼠黑色素腫瘤B16-F10-luc-G5、人乳腺癌MCF-7-luc-F5、人肝癌BEL-7405-luc、人肝癌SMMC-7721-luc、人前列腺癌PC-3、鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6、鼠膀胱腫瘤MB-49或人纖維肉瘤細(xì)胞HT1080。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)TRAIL蛋白質(zhì)的大腸桿菌在制備腫瘤治療藥物中的用途。本發(fā)明利用大腸桿菌的腫瘤靶向性，制備了攜帶TRAIL基因大腸桿菌，該大腸桿菌可以定位于機(jī)體腫瘤及轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，在腫瘤組織集聚，把TRAIL帶到腫瘤部位，避免了TRAIL對(duì)正常組織與器官的毒性作用，也使TRAIL能在腫瘤局部發(fā)揮更強(qiáng)、更持久的作用。本發(fā)明表達(dá)TRAIL蛋白質(zhì)的大腸桿菌能抑制或延緩腫瘤組織的生長(zhǎng)，可以用于制備腫瘤治療的藥物，具有非常廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)A61K35/66GK1903373SQ20051008711
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者張學(xué)敏, 張海英, 梁冰 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心