專利名稱：銀杏葉提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及銀杏葉提取物的生產(chǎn)工藝及藥用制劑的制備方法，特別是涉及銀杏葉提取物注射液和凍干粉針劑的制備方法。
背景技術(shù)：
心腦血管、周邊血管等血液循環(huán)障礙性疾病是臨床最常見的疾病之一，是影響人民健康和長壽的一類主要疾病。銀杏葉提取物及其制劑在心腦血管、周邊血管疾病方面的作用越來越受到世界各國的重視。銀杏(Ginkgo bilobaL.)為古代遺孑植物，又名白果樹。銀杏是我國的稀有物種，也是世界上珍貴的藥用植物資源。尤其在最近四十年來，國內(nèi)外相繼對銀杏化學(xué)成分、藥理作用進(jìn)行了深入研究，大量的藥學(xué)、藥理、藥效、臨床研究表明銀杏葉提取物的主要活性成分是銀杏總黃酮醇苷類、萜內(nèi)酯類化合物，這兩類成分也是評判銀杏葉提取物質(zhì)量的重要指標(biāo)。臨床及藥理研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物具有增強(qiáng)心功能、改善微循環(huán)、降低血液粘稠性、拮抗血小板活化因子(PAF)，清除體內(nèi)自由基及明顯的纖維蛋白原溶解，抑制血流再灌注后的損傷，增強(qiáng)心臟細(xì)胞對缺血的耐受能力等。60-70年代，在國外尤其是德國、法國已有一定量銀杏葉提取物應(yīng)用于臨床并證明了其效果，目前已發(fā)展到歐、亞、美等幾十個國家。目前國內(nèi)外利用銀杏葉提取物開發(fā)出了許多能有效治療與預(yù)防心腦血管、周邊血管、神經(jīng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)疾病的藥物與保健食品，銀杏葉提取物及其制劑已在臨床與人們的生活中有了一定的應(yīng)用，但應(yīng)用程度不高，銀杏制劑主要作為輔助藥物用于臨床，主要原因是銀杏葉提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有效成分量偏低，影響了療效。當(dāng)前常用的用于治療目的銀杏葉提取物(Tebonin、Tanakan、Roekan或Egb761)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中銀杏黃酮苷24％、萜內(nèi)酯6％，烷基酚類化合物低于10ppm。應(yīng)用上述提取物所作的制劑已經(jīng)是某些專利的主題，如歐洲專利EP431 535、EP 431 536和US 5,389,370。九十年代，各國的科研人員都盡最大努力提高銀杏葉提取物中有效成分黃酮醇苷和銀杏萜內(nèi)酯的含量，同時盡量降低銀杏酸的含量，銀杏酸是銀杏葉提取物毒性作用的主要因素，因其能產(chǎn)生嚴(yán)重的胃腸道副作用、頭痛、皮膚刺激和引起水腫，臨床應(yīng)用可引起嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。美國專利(US4,428,965)涉及的主題即為對抗銀杏酸所致過敏的脫敏物質(zhì)和方法，中國專利CN1159022C的發(fā)明主題也是涉及高有效成分含量的銀杏葉提取物得制備方法。
由于現(xiàn)有技術(shù)的提取方法得到的均屬于低含量有效成分的銀杏葉提取物，不能滿足臨床的療效要求，尤其不適合用于注射制劑，造成銀杏葉提取物有效成分含量偏低的原因同銀杏葉提取物的生產(chǎn)工藝有很大關(guān)系，而銀杏葉的制劑如片劑、口服液、膠囊等雖然在臨床廣泛應(yīng)用，但口服制劑存在的缺點非常明顯，如吸收不快、生物利用度不高等，影響疾病的治療。例如99124228的專利披露的銀杏葉提取物注射液，采用將提取物在注射劑的制備中加入金屬離子絡(luò)合物和聚砜或聚乙烯為材料的中空纖維超濾的方式除去雜質(zhì)，該超濾除雜的方式的缺點是其以分離有機(jī)大分子物質(zhì)，膠體，超微粒子，細(xì)菌為主，主要針對大分子物質(zhì)。僅對深度降濁澄清和大分子物質(zhì)的濃縮等具有效果，超濾后的提取物如果應(yīng)用于注射劑還需要高溫滅菌。
已經(jīng)報道的銀杏葉提取物現(xiàn)有工藝技術(shù)有樹脂吸附純化法、熱浸法、微波提取法、CO2超臨界提取法等?，F(xiàn)有技術(shù)存在的主要問題提取得有效成分總量不高、工藝路線不夠合理或工業(yè)化條件不具備以及有效成分不能直接用于注射劑型等。
如何得到適合注射用的高純度低雜質(zhì)高含量有效成分的銀杏葉提取物，成為業(yè)內(nèi)研究熱點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種高有效成分含量銀杏葉提取物的制備方法，由該方法制備的提取物銀杏總黃酮＞64％，銀杏總內(nèi)酯＞11％，同時具有較高抗氧化活性的原花青素類化合物含7-10％，毒性成分銀杏酸類化合物＜5ppm。該發(fā)明的創(chuàng)新點在于把先進(jìn)的陶瓷膜超濾技術(shù)應(yīng)用在提取物的制備工藝中，不僅大大提高了有效成分含量，還有效的除去了植物藥材中容易引起過敏反應(yīng)的植物性大分子，增加了所開發(fā)制劑的有效性和安全性。
本發(fā)明的另一創(chuàng)新點在于提供了提取物中另一有效成分原花青素類化合物得含量測定方法，進(jìn)一步確定了提取物中有效成分的組成，優(yōu)化了不同有效成分的比例。
本發(fā)明的還提出了銀杏葉提取物注射液和粉針劑的制備方法，通過該方法制得的制劑質(zhì)量穩(wěn)定，療效確切。
本發(fā)明提供了一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟干燥銀杏葉加入4-10倍量的50％-75％濃度的乙醇回流提取至少1次，將提取液合并過濾，減壓回收除去乙醇得到濃縮液；向濃縮液中加入等體積的水，放置，過濾或離心除去沉淀；濾液或上清液調(diào)節(jié)PH至8-10，放置使沉淀完全，過濾或離心除去沉淀(鞣質(zhì)和聚合多酚類雜質(zhì))；在濾液或上清液中加入酸調(diào)節(jié)PH至2.5-4.0(該P(yáng)H值為加入氨水前提取液的PH值)，再加入正己烷萃??；萃取后的水液過大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗脫，棄水洗液；再以60％-70％乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮去醇性溶媒，得到含醇5-10％的溶液；得到的溶液經(jīng)過膜超濾，截留分子量為0.7-5萬，超濾液經(jīng)減壓濃縮。
上述的制備方法，其中提取的乙醇優(yōu)選為60％濃度的乙醇；水優(yōu)選為去離子水；所述的濃氨水調(diào)PH值為9；調(diào)節(jié)PH值所采用的酸為鹽酸或者硫酸，優(yōu)選鹽酸，PH值為3；所述的洗脫用的乙醇濃度為70％。
為了達(dá)到提高有效成分含量，有效的除去植物藥材中容易引起過敏反應(yīng)的植物性大分子(如銀杏酸等)的含量，增加了所開發(fā)制劑的有效性和安全性，同時提高現(xiàn)有技術(shù)中公認(rèn)作為雜質(zhì)而在本發(fā)明中作為有效成分的丹寧特性的多酚類化合物(例如原花色素)的含量，上述銀杏葉提取物的提取方法中所述的超濾優(yōu)選為陶瓷膜超濾，截留分于量為1-3萬，這樣得到的提取物比其他膜超濾方法精制得到的提取物雜質(zhì)少，分子量分布更加集中，藥理藥效更加明顯，并且可以在制備針劑過程中不經(jīng)過高溫滅菌而達(dá)到藥典規(guī)定的注射劑的要求，這是我們在試驗篩選中發(fā)現(xiàn)的陶瓷膜應(yīng)用于注射用的銀杏葉提取物的一項優(yōu)勢，是其他膜超濾所不能替代的。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，所述的銀杏葉提取物的提取方法，包括以下步驟(1)取干燥銀杏葉20-40目粗粉，加入4-10倍量的60％的乙醇回流提取2-4次，將提取液合并過濾，減壓回收至總體積的1/10。
(2)濃縮液中加入相同體積的去離子水，陰涼環(huán)境中放置12hr，過濾或離心除去。
(3)充分?jǐn)嚢瑁?2)中得到的濾液或上清液中加入濃氨水，調(diào)節(jié)PH至8-10，放置1hr，過濾或離心除去沉淀雜質(zhì)。
(4)向(3)中的濾液或上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)PH至2.5-4.0，加正己烷萃取2-3次.
(5)經(jīng)步驟(4)萃取后的水液過大孔吸附樹脂柱，先以2倍柱床體積的去離子水洗脫，棄水洗液；再以3倍柱床體積的60％-70％乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮去醇性溶媒，得到含醇5-10％的溶液。
(6)經(jīng)步驟(5)得到的溶液用陶瓷膜超濾，截留分子量為1-3萬，超濾液經(jīng)減壓濃縮，濃縮液噴霧干燥后即得到銀杏葉提取物。
本發(fā)明還提供了一種銀杏葉提取物，該銀杏葉提取物采用上述方法制得，其中銀杏葉有效成分的總重量含量為80％以上(80％-95％，優(yōu)選80％-85％)，該提取物至少包括總黃酮、萜內(nèi)酯和原花青素，該總黃酮的含量為64％以上(例如64％-70％)，萜內(nèi)酯的含量為11％以上(例如11％-15％)，原花青素的含量為7％(例如7％-10％)；其中，該銀杏葉提取物還包括銀杏酸，其重量含量不超過5ppm(例如2-4ppm)。
本發(fā)明還提供一種含有上述銀杏葉提取物的藥物組合物，其中，該組合物為注射用制劑，包括注射液和凍干粉針劑。
上述的注射用制劑包括1份銀杏葉提取物，15-25份山梨醇或者甘露醇。
本發(fā)明還提供了銀杏葉提取物中總黃酮的含測方法，其操作步驟如下(1)對照品溶液的制備精密稱取干燥蘆丁適量，用70％乙醇定容于容量瓶中，得對照品儲備溶液。
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取不同量的對照品儲備液至容量瓶中，加入定量的水、pH為4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、0.1mol/L的氯化鋁溶液，然后用70％乙醇定容，在270nm處測定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(3)樣品測定精密稱取適量樣品，用70％乙醇定容于容量瓶中，按上述相同的方法處理，在270nm處測定吸收值，按無水物以蘆丁計算總黃酮的量。應(yīng)為標(biāo)示量的90～110％。
本發(fā)明提供了銀杏總內(nèi)酯的含量測定方法，其操作步驟如下(1)對照品溶液的配制精密稱取銀杏內(nèi)酯A，B，C及白果內(nèi)酯對照品，置于容量瓶中，加甲醇超聲溶解后，冷至室溫，以流動相稀至刻度，搖勻，為貯備液。精密量取0.5ml，1ml貯備液，移入5ml容量瓶，以流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。
(2)樣品溶液的制備精密稱取提取物適量，置于燒杯中，加乙醇超聲使溶解，溶液精密轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，以水飽和乙酸乙酯萃取，共兩次，分取乙酸乙酯層置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘留物用少量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至容量瓶中，以流動相稀釋并定容至刻度，搖勻，備用。
(3)精密量取對照與供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀中，用兩點法對數(shù)方程計算出供試品中總內(nèi)酯的含量。
本發(fā)明提供了測定銀杏葉提取物中總黃酮醇苷的方法，具體步驟如下(1)對照品溶液的制備精密稱取槲皮素適量，用甲醇溶解后定容到容量瓶中，作為對照品溶液。
(2)精密稱取干燥的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)提取物適量，置圓底磨口燒瓶中，用甲醇溶解，再加入25％鹽酸，混勻，置沸水浴上回流水解1小時，放冷至室溫，定量轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
(3)分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各10μl，在上述色譜條件下注入液相色譜儀，測定，以下式計算總黃酮醇苷的含量。
總黃酮醇苷(mg)＝(Q×2.51+K×2.64×1.05+I×2.39×0.95)×R×稀釋倍數(shù)/1000Q＝槲皮素峰面積K＝山奈素峰面積I＝異鼠李素峰面積 本發(fā)明提供了測定銀杏葉提取物中銀杏酸的方法，具體步驟如下(1)對照品溶液的配制 精密稱取銀杏酸對照品適量以甲醇定容到適宜濃度濃度，作為對照品溶液。
(2)樣品溶液的配制 精密稱取提取物適量，置具塞試管中，加入無水乙醇，超聲使溶解，冷卻至室溫后，加入適量正己烷和飽和硫酸鈉(以硫酸調(diào)節(jié)pH值至3)及適量硅藻土。振蕩，靜置，待分層后，精密吸取上層有機(jī)相于另一試管中，在氮氣的保護(hù)下除去萃取液，殘渣溶于甲醇中，作為供試品溶液。
(3)采用液相色譜儀進(jìn)行測定，記錄色譜圖，計算總銀杏酸的含量不得過百萬分之五。
藥理藥效學(xué)實驗1銀杏葉提取物抗心肌缺氧的實驗研究對小鼠關(guān)閉氣管心電消失時間的影響取60只經(jīng)檢測合格的小鼠，隨機(jī)分為六組，每組10只，1.5％濃度戊巴比妥鈉腹腔注射30mg/kg麻醉，仰位固定于小鼠解剖臺上，頸部剪毛、手術(shù)分離氣管，用心電圖電極插入小鼠四肢，采集標(biāo)II導(dǎo)聯(lián)心電圖，小鼠尾靜脈注射給藥，第一組注射等容積生理鹽水，第二組尾靜脈注射金鈉多注射液17.5mg/kg，第三～五組分別經(jīng)小鼠尾靜脈注射銀杏葉20mg/kg、10mg/kg、5mg/kg，第六組灌胃銀杏葉提取物10mg/kg，注射藥物后30分鐘關(guān)閉小鼠氣管(小動脈夾夾住小鼠氣管)，記錄每組每只小鼠關(guān)閉氣管至小鼠心電消失的時間，試驗資料顯著性測定用組間t檢驗處理，結(jié)果表明銀杏葉提取物對小鼠夾閉氣管后，心電圖消失時間與生理鹽水組比較具明顯差異，可以明顯延長心電消失時間P＜0.05。金鈉多注射液同樣具有延長心電消失時間P＜0.05。同等劑量的銀杏葉提取物組比較，差異不顯著。灌胃銀杏葉提取物10mg/kg組小鼠與生理鹽水組比較，差異不顯著。
2銀杏葉提取物對缺血心肌的保護(hù)作用銀杏葉提取物對垂體后葉素誘發(fā)大鼠心肌缺血ECG的影響取Wistar大鼠60只，雌雄各半，體重250-300g，平均體重271.3±18.0g，隨機(jī)分為六組，每組10只。第一組大鼠由尾靜脈注射等容積生理鹽水；第二組大鼠注射金鈉多注射液8.5mg/kg；第三～五組大鼠由尾靜脈注射銀杏葉提取物10mg/kg、5mg/kg和2.5mg/kg，第六組大鼠灌胃銀杏葉提取物5mg/kg，連續(xù)注射2天，末次給藥后30分鐘，分別由尾靜脈注射腦垂體后葉素0.6μ/kg，記錄V3，標(biāo)II導(dǎo)聯(lián)心電圖在注垂體后葉素的第15、30、45秒，1、1.5、2、5分鐘心電圖變化，分析ST，T波變化，所得試驗資料用t檢驗，比較給藥組與生理鹽水組的差異，結(jié)果表明大鼠靜脈注射垂體后葉素后，ST段、T波有明顯增高，而給予銀杏葉提取物后，抬高的ST段有明顯恢復(fù)，T波呈下降式恢復(fù)，在注射垂體后葉素2分鐘后，ST段、T波基本趨于正常，給藥組和對照組比較，無明顯差異。
3銀杏葉提取物對急性心肌梗塞大鼠心肌梗塞面積的影響Wistar大鼠，雌雄各半，體重240-290g，隨機(jī)分為七組，每組10只，在手術(shù)后隨時去除冠脈分布異常和在結(jié)扎前出現(xiàn)病理性Q波者以及24小時內(nèi)死亡鼠，最后保證有70只大鼠供試驗用。
試驗時分別由尾靜注射生理鹽水或銀杏葉提取物，連續(xù)給藥兩天，末次給藥后30分鐘，腹腔注射1.5％戊巴比妥鈉30mg/kg，仰位固定于手術(shù)臺上，取正中切口，切開皮膚，沿胸骨正中向左，純性分離肌肉，暴露第3、4肋骨，貼胸骨左緣切斷，以小型開胸器擴(kuò)開切口使心臟暴露良好，以眼科鑷輕輕提起心包，小心剪開，用止血鉗提起左心耳，用眼科縫針于冠脈前降支距冠脈出口下方3.0mm處和5mm處，雙重結(jié)扎冠脈前降支，然后迅速將心臟送回胸腔，縫合關(guān)胸，斷頭處死大鼠，取血，測其血清中FFA、CPK含量，見表6。摘取心臟，在生理鹽水液中洗靜余血，沿冠狀溝剪去心房及大血管，在扭力天平上稱心室重量，然后將心室切成4-5片，置N-BT(硝基四氮唑藍(lán)染色液中37℃恒溫條件下染色15分鐘(正常心肌染成暗藍(lán)色，梗塞心肌不著色)，用剪刀或手術(shù)刀剪去著色部分，剩下為梗塞心肌，計算梗塞區(qū)占心臟面積的百分率。將給藥組與生理鹽水組進(jìn)行比較，用統(tǒng)計學(xué)計算差異的顯著性。結(jié)果表明銀杏葉制劑可保護(hù)受損心肌，無論是心肌梗塞重量或是心肌梗塞面積，與生理鹽水組比較均有顯著性差異P＜0.01。
4銀杏葉提取物對血小板聚集和體內(nèi)血栓的影響銀杏葉提取物對兔血小板聚集的影響取禁食12小時的家兔，用戊巴比妥鈉30mg/kg耳靜脈注射麻醉，手術(shù)分離頸總動脈，剪口插入聚乙烯管放血到事先裝有3.8％枸櫞酸鈉溶液硅化試管中，血與抗凝劑的比例為9∶1，將血液與抗凝劑輕輕混勻，1000rpm離心4分鐘，吸取上層米黃色的液體，得到富血小板血漿(PRP)，將剩余的血液再離心3000rpm 10分鐘，吸取上清液，得到貧血小板血漿(PPP)。
接通血小板聚集儀和記錄儀電源，使之予熱30分鐘，同時調(diào)節(jié)聚集儀恒溫旋鈕，使之恒溫在37±0.5℃，先將PPP予溫3-5分鐘，觀察指針在70-90之間，不得超過100Abs，按下“E”鍵，“Z”鍵燈亮，取出PPP管，將PRP管置于測試孔中，加入攪拌棒，按下“STIRRER”鍵，聽到沙沙攪拌聲后，按下“E”鍵，機(jī)器開始打印實驗報告圖，打印完畢后，先加入銀杏葉提取物20μg、10μg、5μg和金鈉多注射液10μg，1分鐘后加入ADP液200μl(20μg)，按下“START”鍵，5分鐘后即打印出實驗曲線及數(shù)據(jù)。
各組試驗結(jié)束后，根據(jù)數(shù)據(jù)中A(max)最大聚集率，計算出抑制百分率(％)，給藥組與生理鹽水組比較并進(jìn)行t檢驗。結(jié)果見下表表銀杏葉提取物對兔血板聚集的影響

注樣本數(shù)n＝10**與生理鹽水對照組比較P＜0.01***與生理鹽水對照組比較P＜0.001由上表試驗數(shù)據(jù)表明，銀杏葉提取物對兔血小板聚集有非常明顯的抑制作用P＜0.001。
本發(fā)明提出了銀杏葉提取物凍干粉針的制備方法，包括以下步驟配液準(zhǔn)確稱取處方量的山梨醇加5％的乙醇4500ml，攪拌使完全溶解，加入處方量的銀杏葉提取物，攪拌使完全溶解，以20％NaOH適量，調(diào)pH約為5.5，最后補(bǔ)加5％的乙醇溶液至規(guī)定體積，攪拌使混合均勻。
過濾分別經(jīng)0.45μm和0.2μm微孔濾膜加壓濾過。
灌裝將濾過的藥液按每支5.1-5.2ml無菌灌裝于已處理過的安瓿瓶中。
本發(fā)明銀杏葉提取物注射液的制備方法，包括以下步驟配液準(zhǔn)確稱取處方量的甘露醇加5％的乙醇適量，攪拌使完全溶解，加入處方量的銀杏葉提取物，攪拌使完全溶解，再加入處方量的十二水磷酸氫二鈉，以20％NaOH適量，調(diào)pH約為6.0，最后補(bǔ)加5％的乙醇溶液至規(guī)定體積，攪拌使混合均勻。
過濾分別經(jīng)0.45μm和0.2μm微孔濾膜加壓濾過。
灌裝將濾過后的藥液按每支3.1ml灌裝于已經(jīng)處理過的西林瓶中。
凍干本品的上述溶液我們通過測定其的共熔點溫度為-23℃。所以我們在低于共熔點溫度-30℃預(yù)凍5小時，可以將本品充分冷凍完全。在放置真空凍干機(jī)中，凍干機(jī)真空度控制約為0.1～0.3毫巴，冷凝器溫度為-40℃。隔板溫度為-30℃保持5小時后升溫至-10℃保持15小時，再將溫度升至30℃保持8小時。壓蓋出箱。
本發(fā)明提出的銀杏葉提取物注射液和粉針劑的制備方法，銀杏葉提取物的提取工藝路線更合理，提取、除雜、純化、萃取、分離與精制過程符合大生產(chǎn)要求；生產(chǎn)成本低；有效成分提取率高(該生產(chǎn)工藝得到的銀杏葉提取物總黃酮苷＞64％，萜內(nèi)酯＞11％，原花青素≥7％，銀杏酸類成分＜5ppm，達(dá)到中藥注射用原料的要求)；具備工業(yè)化生產(chǎn)的條件。本發(fā)明的銀杏葉提取物注射液和粉針劑的制備方法，經(jīng)穩(wěn)定性試驗研究表明，制備工藝穩(wěn)定可行，增加了劑型，滿足了臨床需要。安全性試驗表明本發(fā)明的銀杏葉提取物注射液和粉針劑均無過敏反應(yīng)和溶血作用，靜脈注射對血管無刺激性。在心血管疾病領(lǐng)域具有廣泛的作用。
本發(fā)明也做了大量對比實驗，證明以現(xiàn)有文獻(xiàn)記載的制備方法得到的銀杏葉提取物中總有效成分均低于80％，對原花青素的含量沒有明確記載，如果達(dá)到了過敏物質(zhì)銀杏酸類成分＜5ppm，則產(chǎn)物中的鉛離子即超標(biāo)，根本無法用于注射用制劑的成分；而本發(fā)明采用篩選過的濃度的乙醇提取，系列除雜，以及上大孔吸附樹脂的精制，和陶瓷膜過濾，得到的提取物中總黃酮苷＞64％，萜內(nèi)酯＞11％，原花青素≥7％，銀杏酸類成分＜5ppm，完全達(dá)到中藥注射用原料的要求。
具體實施例方式
實施例1銀杏葉提取物的制備將試驗量的干燥銀杏葉粉碎過40目篩子，得到藥材粗粉，加入8倍量的60％乙醇，加熱回流1.5hr，濾出提取液，加入相同體積的60％乙醇進(jìn)行第2次提取，合并2次提取液過濾，減壓回收揮去溶媒，至濃縮液體積為總體積的1/10(即固體物含量為20～30％的濃縮液)，加入相同體積的去離子水，陰涼環(huán)境中放置12hr，充分析出不溶物，過濾或離心除去沉淀；在充分?jǐn)嚢璧臈l件下往濾液或上清液中加入濃氨水，調(diào)節(jié)PH至9，陰涼環(huán)境中放置1hr，過濾或離心除去沉淀；往濾液或上清液中加入硫酸調(diào)節(jié)PH至3(該P(yáng)H值加入氨水前提取液的PH值)，V/3體積的正己烷萃取，萃取3次；水相揮去溶媒即得銀杏葉粗提物。D101型大孔吸附樹脂上樣，1.5kg(銀杏葉藥材)/kg(樹脂)；上樣后先以2倍柱床體積的去離子水洗脫，棄水洗液；再以3倍柱床體積的70％乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮去溶媒，再經(jīng)過陶瓷膜超濾，截留分子量為1-3萬，得到銀杏葉提取物。
實施例2銀杏葉提取物注射液的制備稱取200g山梨醇加5％的乙醇4500ml，攪拌使完全溶解，加入10g銀杏葉提取物，攪拌使完全溶解，以20％NaOH適量，調(diào)pH約為5.5，最后補(bǔ)加5％的乙醇溶液至規(guī)定體積，攪拌使混合均勻。
過濾分別經(jīng)0.45μm和0.2μm微孔濾膜加壓濾過。
灌裝將濾過藥液按每支5.1-5.2ml無菌灌裝于已經(jīng)處理過的安剖瓶中。
實施例3銀杏葉提取物粉針劑的制備稱取150g甘露醇加5％的乙醇適量，攪拌使完全溶解，加入10g銀杏葉提取物，攪拌使完全溶解，再加入26g十二水磷酸氫二鈉，以20％NaOH適量，調(diào)pH約為6.0，最后補(bǔ)加5％的乙醇溶液至規(guī)定體積，攪拌使混合均勻。
過濾分別經(jīng)0.45μm和0.2μm微孔濾膜加壓濾過。
灌裝將濾過后的藥液按每支3.1ml灌裝于已經(jīng)處理過的西林瓶中。
凍干本品的上述溶液共熔點溫度為-23℃。在低于共熔點溫度-30℃預(yù)凍5小時，可以將本品充分冷凍完全。在放置真空凍干機(jī)中，凍干機(jī)真空度控制約為0.1～0.3毫巴，冷凝器溫度為-40℃。隔板溫度為-30℃保持5小時后升溫至-10℃保持15小時，再將溫度升至30℃保持8小時。壓蓋出箱。
實施例4銀杏葉提取物注射液處方銀杏葉提取物 8.0-12.0g山梨醇300-500g5％乙醇 加至5000ml共制1000支(1)稱取處方量的山梨醇加5％的乙醇4500ml，攪拌使完全溶解，加入處方量的銀杏葉提取物，攪拌使完全溶解，以20％NaOH適量，調(diào)pH約為5.0-6.0，最后補(bǔ)加5％的乙醇溶液至規(guī)定體積，攪拌使混合均勻。
(2)過濾分別經(jīng)0.45μm和0.2μm微孔濾膜加壓濾過。
(3)灌裝將濾過后的藥液按每支5.1-5.2ml無菌灌裝于已經(jīng)處理過的安剖瓶中。
實施例5銀杏葉提取物注射粉針劑處方銀杏葉提取物 8.0-12.0g甘露醇120-180g十二水磷酸氫二鈉 20-30g5％乙醇 加至3000ml共制1000瓶
(1)稱取處方量的甘露醇加5％的乙醇適量，攪拌使完全溶解，加入處方量的銀杏葉提取物，攪拌使完全溶解，再加入處方量的十二水磷酸氫二鈉，以20％NaOH適量，調(diào)pH約為5.5-7.0，最后補(bǔ)加5％的乙醇溶液至規(guī)定體積，攪拌使混合均勻。
(2)過濾分別經(jīng)0.45μm和0.2μm微孔濾膜加壓濾過。
(3)灌裝將濾過后的藥液按每支3.1ml灌裝于已經(jīng)處理過的西林瓶中。
(4)凍干在低于共熔點溫度預(yù)凍一定時間，將本品充分冷凍完全。在放置真空凍干機(jī)中，凍干機(jī)真空度控制約為0.1～0.5毫巴，冷凝器溫度為-30--50℃。隔板溫度為-20--30℃保持4-6小時后升溫至-5--10℃保持12-18小時，再將溫度升至25-30℃保持8小時，壓蓋出箱。
權(quán)利要求
1.一種銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)干燥銀杏葉加入4-10倍量的50％-75％濃度的乙醇回流提取至少1次，將提取液合并過濾，減壓回收除去乙醇得到濃縮液；(2)向濃縮液中加入等體積的水，放置，過濾或離心除去沉淀；(3)濾液或上清液調(diào)節(jié)PH至8-10，放置使沉淀完全，過濾或離心除去沉淀；(4)在濾液或上清液中加酸調(diào)節(jié)PH至2.5-4.0，再加入正己烷萃取；(5)萃取后的水液過大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗脫，棄水洗液；再以60％-70％乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮去醇性溶媒，得到含醇5-10％的溶液；(6)經(jīng)步驟(5)得到的溶液經(jīng)過膜超濾，截留分子量為0.7-5萬，超濾液經(jīng)減壓濃縮。
2.如權(quán)利要求1所述的銀杏葉提取物的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的水醇混和液為60％濃度的乙醇；步驟(2)中的水為去離子水；步驟(3)中用濃氨水調(diào)PH值為9；步驟(4)中所述的酸為鹽酸，PH值為3；步驟(5)中所述的洗脫用的乙醇濃度為70％。
3.如權(quán)利要求1所述的銀杏葉提取物的提取方法，其特征在于，步驟(6)中所述的超濾為陶瓷膜超濾，截留分子量為1-3萬。
4.如權(quán)利要求1所述的銀杏葉提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步驟(1)取干燥銀杏葉20-40目粗粉，加入4-10倍量的60％的乙醇回流提取2-4次，將提取液合并過濾，減壓回收至總體積的1/10；(2)濃縮液中加入相同體積的去離子水，陰涼環(huán)境中放置12hr，過濾或離心除去；(3)充分?jǐn)嚢?，?2)中得到的濾液或上清液中加入濃氨水，調(diào)節(jié)PH至8-10，放置1hr，過濾或離心除去沉淀雜質(zhì)；(4)向(3)中的濾液或上清液中加入鹽酸調(diào)節(jié)PH至2.5-4.0，加正己烷萃取2-3次；(5)經(jīng)步驟(4)萃取后的水液過大孔吸附樹脂柱，先以2倍柱床體積的去離子水洗脫，棄水洗液；再以3倍柱床體積的60％-70％乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓揮去醇性溶媒，得到含醇5-10％的溶液；(6)經(jīng)步驟(5)得到的溶液用陶瓷膜超濾，截留分子量為1-3萬，超濾液經(jīng)減壓濃縮，濃縮液噴霧干燥后即得到銀杏葉提取物。
5.一種銀杏葉提取物，其特征在于，該銀杏葉提取物采用權(quán)利要求1所述的方法制得，其中銀杏葉有效成分的總重量含量為80％以上，該提取物至少包括總黃酮、萜內(nèi)酯和原花青素。
6.如權(quán)利要求5所述的銀杏葉提取物，其特征在于，所述的總黃酮的含量為64％以上，萜內(nèi)酯的含量為11％以上，原花青素的含量為7％。
7.如權(quán)利要求5所述的銀杏葉提取物，其特征在于，所述的銀杏葉提取物還包括銀杏酸，其重量含量不超過5ppm。
8.一種含有權(quán)利要求5-7任一項所述銀杏葉提取物的藥物組合物，其中，該組合物為注射用制劑。
9.如權(quán)利要求8所述的藥用組合物，其中，所述的注射用制劑為注射液和凍干粉針劑。
10.如權(quán)利要求8所述的藥用組合物，其中，所述的注射用制劑包括1份銀杏葉提取物，15-25份山梨醇或者甘露醇。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種銀杏葉提取物的制備方法，其中包括銀杏葉粉碎成粗粉，用含水醇溶液加熱回流提取，提取液減壓揮去溶媒，加入氨水沉淀除去聚合多酚類物質(zhì)，正己烷萃取除去銀杏酸類成分；處理后的提取液通過大孔吸附樹脂柱色譜，分離、精制，洗脫液采用陶瓷膜超濾技術(shù)進(jìn)行超濾，進(jìn)行除大分子雜質(zhì)和有效成分富集，超濾液經(jīng)噴霧干燥后得銀杏葉提取物。該銀杏葉提取物中有效成分總含量達(dá)到80％以上。本發(fā)明同時公開了由上述銀杏葉提取物制備注射液和凍干粉針劑的方法。
文檔編號A61P43/00GK1911257SQ200510090129
公開日2007年2月14日 申請日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日
發(fā)明者張樹祥, 劉文輝, 崔娜娜 申請人:北京聯(lián)合偉華藥業(yè)有限公司