專利名稱：一種含有丹參和三七藥材的復方制劑的質量檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥質量檢測領域，具體來說涉及一種含有丹參和三七藥材的復方制劑的質量檢測方法。
背景技術：
含有丹參和三七的制劑，通常亦被稱為復方丹參制劑，在臨床上廣泛用于治療心血管疾病。常見的有復方丹參片，復方丹參滴丸，丹七片，冠心丹參片等。
丹參和三七是復方丹參制劑的兩個主要組成藥物?，F(xiàn)代研究表明丹參的活性成分主要為二萜醌類(如丹參酮IIA等)脂溶性及丹參酚酸類(如丹酚酸B等)水溶性有效成分，丹參酚酸類成分具抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗氧化及保護心臟微血管內皮細胞等作用；丹參酮等脂溶性成分能擴張冠狀動脈，提高冠脈血流，保護心肌及廣譜抑菌作用。三七皂苷類(如三七皂苷R1，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1)成分是三七的主要活性成分，具抗血栓形成，擴張血管及保護心肌等作用。
有關復方丹參制劑的質量標準不盡相同，丹七片及冠心丹參片沒有含量測定指標，復方丹參片的含量測定指標為丹參酮IIA和丹酚酸B，復方丹參滴丸為丹參素?？梢姀头降⒅苿┑馁|量標準差異大且不完善，復方丹參片質量標準較完善但也只是對丹參的脂溶性及水溶性成分分別進行質控。復方丹參制劑的質量標準中尚未有對其中三七活性成分的含量控制。相關的文獻報道的檢測方法有HPLC法測定復方丹參方中丹參3種脂溶性成分含量(北京中醫(yī)藥大學學報，2003年第26卷第4期)，HPLC法測定復方丹參中丹參的三種水溶性成分的含量(中草藥，2002年第33卷第10期)，HPLC測定復方丹參方中三七皂苷類成分的含量(中藥新藥與臨床藥理，2003年第14卷第2期)?，F(xiàn)有技術中都只能分開測定丹參或三七中某一類活性成分的含量，故建立一種能同時控制丹參和三七中多類有效成分含量的方法具有很大的意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有含丹參和三七藥材的復方制劑的質量控制缺陷，建立一種能夠同時測定此類復方制劑中丹參和三七兩味藥的多類活性成分含量的質量檢測方法。
本發(fā)明試驗采用了HPLC-DAD法同時測定復方丹參制劑中原兒茶醛，丹酚酸B，隱丹參酮，丹參酮IIA，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1的含量，本方法相對簡單，具良好的精密度，重現(xiàn)性和可靠性，可同時測定復方丹參制劑中丹參和三七的多類活性成分的含量，可用于復方丹參制劑的質量控制。
本發(fā)明的具體技術方案如下含有丹參和三七藥材的復方制劑的質量檢測方法，包括以下步驟分別制備供試品溶液和對照品溶液，用高效液相色譜法測定，其特征是對照品為選自原兒茶醛，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，丹酚酸B，人參皂苷Rb1，隱丹參酮或丹參酮IIA中的幾個；色譜條件為用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1％的磷酸水為流動相，其中A為0.1％的磷酸水，B為乙腈，A+B＝100％，采用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B；柱溫25-35℃；流速1ml/min(在22～28min時，流速為0.8ml/min)；DAD檢測器，檢測波長為203，270，281nm。在203nm處測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，在281nm處測定原兒茶醛，丹酚酸B，在270nm處測定隱丹參酮和丹參酮IIA。磷酸濃度為體積百分比。
優(yōu)選的柱溫是30℃。
上述質量檢測方法，優(yōu)選的對照品的制備方法為分別精密稱取對照品a、原兒茶醛，b、三七皂苷R1，c、人參皂苷Rg1，d、丹酚酸B，e、人參皂苷Rb1，f、隱丹參酮和g、丹參酮IIA適量，置棕色容量瓶中，加70％甲醇(隱丹參酮和丹參酮IIA加甲醇)溶解并定容，作為對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液，置棕色容量瓶中混合并加70％甲醇定容，形成混合對照品溶液，濃度范圍分別為a、1.32-210.40μg/ml，b、15.34-368.16μg/ml，c、14.76-590.40μg/ml，d、12.70-762.00μg/ml，e、30.06-601.20μg/ml，f、0.33-66.00μg/ml，g、0.32-64.56μg/ml。
本發(fā)明的質量檢測方法，其中優(yōu)選的供試品溶液的制備方法為取含有丹參和三七藥材的復方制劑，去糖衣或薄膜衣，研磨成粉末，精密稱取0.25g～2.0g置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。超聲提取30min，放冷，加入70％甲醇補足重量。搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
上述制備的供試品和對照品的進樣量為10μl；記錄時間80min。當只測定原兒茶醛，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，丹酚酸B，人參皂苷Rb1時，記錄時間為60～65min即可。
上述的質量檢測方法，其中檢測波長可以僅為203,281nm。
本發(fā)明的質量檢測方法，其中復方制劑選自含有丹參和三七的所有復方制劑，如丹七片、復方丹參片、復方丹參滴丸或冠心丹參片等。
本發(fā)明的含有丹參和三七藥材的復方制劑質量檢測方法，采用DAD檢測器，在203nm處測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，在281nm處測定原兒茶醛，丹酚酸B，在270nm處測定隱丹參酮和丹參酮IIA。
本發(fā)明的含有丹參和三七藥材的復方制劑質量檢測方法，含量測定指標適當減少，如測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、丹酚酸B和丹參酮IIA的含量仍體現(xiàn)本發(fā)明的實質。
本發(fā)明的含有丹參和三七藥材的復方制劑質量檢測方法，檢測波長為203nm和281nm，即在203nm處測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，在281nm處測定原兒茶醛，丹酚酸B，隱丹參酮和丹參酮IIA。仍能達到本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的復方丹參制劑質量檢測方法相比的進步性如下本方法克服了現(xiàn)有國家標準檢測方法未有三七有效成分含量測定指標的缺陷，通過采用HPLC-DAD方法，實現(xiàn)了對丹參和三七中多類活性成分含量的同時測定。經(jīng)試驗表明，所測的多種成分分離度好，線性關系，重現(xiàn)性，精密度，穩(wěn)定性，回收率均較好。本方法準確，先進，操作簡便，能夠更有效、更全面的控制產(chǎn)品的質量。
具體實施例方式
實施例11.儀器與試藥Agilent 1100型系列高效液相色譜儀，包括G1312A四元梯度泵、G1313A自動進樣器、G1316A柱溫箱，G1315A DAD檢測器；Chemstation 6.01色譜工作站。
復方丹參制劑丹七片(丹參∶三七＝1∶1)湖南安邦制藥有限責任公司(批號040803)；復方丹參片(丹參∶三七＝450∶141)廣東白云山制藥廠(批號03121024)，南京同仁堂制藥有限責任公司(批號040602)，浙江胡慶余堂制藥有限責任公司(批號050308)；復方丹參滴丸天津天士力制藥有限責任公司(批號20020921，20030604，20040303)。
對照品原兒茶醛，丹酚酸B，丹參酮IIA，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1購自中國藥品生物制品檢定所；隱丹參酮，購于成都思科華生物技術有限公司。純度均＞98％。
甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純，德國Merck公司)、Milli-Q超純水。其余試劑為分析純。
2.色譜條件色譜柱C18色譜柱(ZORBAX ODS 4.6×250mm ID，5μm)和預柱(4.6×12.5mm ID，5μm)；流動相，A為0.1％的磷酸水；B為乙腈；A+B＝100％，采用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B。柱溫30℃；流速1ml/min(22-28min，0.8ml/min)；檢測波長203nm，270nm，281nm，在203nm處測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，在281nm處測定原兒茶醛，丹酚酸B，在270nm處測定隱丹參酮和丹參酮IIA。記錄時間80min。
3.實驗方法與結果3.1供試品溶液的制備取丹七片(去糖衣)和復方丹參片20片，稱重，計算平均片重，并研磨成粉未，精密稱取0.5g，置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。取復方丹參滴丸75粒(約2g)，精密稱定，研成粉未，去除薄膜衣，用70％甲醇溶解并轉移到25ml棕色容量瓶中定容。超聲提取30min，放冷，加入70％甲醇補足重量。
溶液濾過，取續(xù)濾液，即得。
3.2對照品溶液的制備分別精密稱取對照品(1)原兒茶醛2.63mg，(2)三七皂苷R1 7.67mg，(3)人參皂苷Rg1 12.30mg，(4)丹酚酸B 2.54mg，(5)人參皂苷Rb1 12.53mg，置5ml棕色容量瓶中，加70％甲醇，(6)隱丹參酮2.75mg，(7)丹參酮IIA 2.69mg，置5ml棕色容量瓶中，加甲醇，溶解并定容，作為對照品貯備液。
分別精密吸取一定量的對照品貯備液，置棕色容量瓶混合并加70％甲醇定容，形成混合對照品溶液。各對照品濃度分別為(1)105.2μg/ml，(2)184.08μg/ml，(3)381.0μg/ml，(4)295.2μg/ml，(5)100.20μg/ml，(6)33.0μg/ml，(7)21.52μg/ml。
3.3含量測定方法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測定。結果見表1。
表1三種復方丹參制劑含量測定結果(檢測波長203nm，270nm，281nm)


ND未檢測到實施例2檢測波長為203nm和281nm，在203nm處測定三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1，在281nm處測定原兒茶醛，丹酚酸B，隱丹參酮和丹參酮IIA。記錄時間80min。其它同實施例1。實驗結果如表2表2三種復方丹參制劑含量測定結果(檢測波長203nm，281nm)


ND未檢測到實驗例3方法學考察1.線性關系分別精密稱取對照品(1)原兒茶醛2.63mg，(2)三七皂苷R17.67mg，(3)人參皂苷Rg112.30mg，(4)丹酚酸B 2.54mg，(5)人參皂苷Rb112.53mg，(6)隱丹參酮2.75mg和(7)丹參酮IIA 2.69mg，置5ml棕色容量瓶中，加70％甲醇(隱丹參酮和丹參酮IIA加甲醇)溶解并定容，作為對照品貯備液。分別精密吸取一定量的對照品貯備液，置棕色容量瓶混合并加70％甲醇定容，形成10個濃度的混合對照品溶液，濃度分別為(1)1.32，2.63，5.26，7.89，13.15，26.30，52.60，105.20，157.80，210.40μg/ml，(2)15.34，30.68，38.35，46.02，61.36，122.72，184.08，245.44，306.80，368.16μg/ml，(3)29.52，44.28，59.04，73.80，98.40，196.80，295.20，393.60，492.00，590.40μg/ml，(4)12.70，25.40，38.10，63.50，127.00，254.00，381.00，508.00，635.00，762.00μg/ml，(5)30.06，45.09，60.12，75.15，100.20，200.40，300.60，400.80，501.00，601.20μg/ml，(6)0.33，0.66，1.32，2.64，5.28，8.25，11.00，16.50，33.00，66.00μg/ml，(7)0.32，0.65，1.35，2.69，5.38，10.76，16.14，21.52，32.28，64.56μg/ml。
在“實施例1”色譜條件下，各濃度對照品溶液分別進樣10μl。以峰面積(y)對濃度(x，mg·L-1)進行線性回歸，得回歸方程，見表3和表4。
表3線性關系實驗結果(203，270，281nm)(n＝10)


y峰面積x濃度(mg·L-1)。
表4線性關系實驗結果(203，281nm)(n＝10)

2.精密度實驗取“線性關系”項下1/2濃度梯度點，連續(xù)進樣6次，以峰面積計算，7個化合物日內精密度分別為1.25％，1.05％，0.71％，1.12％，0.61％，0.46％，0.61％。連續(xù)分析4天，7個化合物日間精密度分別為1.13％，1.78％，0.85％，1.76％，1.29％，0.91％，2.16％。
3.重復性實驗取丹七片、復方丹參片(050308)及復方丹參滴丸(20040303)，每個樣品6份，按照實施例1方法制備供試品溶液并分析，結果7個化合物色譜峰面積的RSD分別為(1)2.61％，2.17％，1.49％；(2)2.99％，4.32％，2.92％；(3)1.28％，2.32％，1.62％；(4)1.58％，2.31％，2.67％；(5)3.19％，2.70％，2.04％；(6)9.73％，1.59％，6.52％；(7)9.59％，1.84％，6.18％。
4.穩(wěn)定性實驗取“重復性試驗”項下丹七片、復方丹參片及復方丹參滴丸供試品溶液各一份，分別于0，2，4，6，8，12小時進行測定，7個化合物色譜峰面積的RSD分別為(1)2.15％，1.72％，1.25％；(2)2.27％，4.16％，2.09％；(3)1.32％，2.03％，1.37％；(4)1.23％，2.72％，2.17％；(5)2.79％，2.21％，1.67％；(6)9.09％，1.45％，5.78％；(7)8.90％，1.55％，5.28％。
5.加樣回收率試驗精密稱取已知含量的丹七片(0.25g)、復方丹參片(0.25g，批號050308)及復方丹參滴丸(40丸，批號20040303)，共5份，分別加入7個對照品(1)0.1000，0.0500，2.0000mg；(2)0.9375，0.9375，1.5625mg；(3)3.0180，2.8168，3.2192mg；(4)1.4157，5.2272，1.6335mg；(5)3.1578，2.1606，2.8254mg；(6)0.0372，0.3720，0.0372mg；(7)0.0385，0.3850，0.0385mg。按照實施例1方法制備供試品溶液并分析，得7個化合物的平均回收率分別為(1)98.5％，99.8％，96.7％；(2)102.1％，97.4％，95.2％；(3)102.6％，102.1％，100.4％；(4)96.9％，101.0％，97.2％；(5)99.0％，98.1％，99.3％；(6)103.3％，97.1％，97.2％；(7)104.9％，94.4％，95.8％。RSD分別為(1)3.89％，3.89％，1.50％；(2)4.60％，4.60％，3.57％；(3)3.52％，3.52％，4.07％；(4)4.07％，4.07％，2.05％；(5)4.43％，4.43％，2.22％；(6)2.97％，2.97％，4.59％；(7)4.45％，4.45％，4.19％。
綜上，本發(fā)明所建立的HPLC-DAD法同時測定復方丹參制劑中原兒茶醛，丹酚酸B，隱丹參酮，丹參酮IIA，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1的含量，具良好的精密度，重現(xiàn)性，可靠性，方法先進簡單，可同時測定復方丹參制劑中多類活性成分的含量，可更有效、更全面的控制含有丹參和三七的復方制劑的質量。
權利要求
1.一種含有丹參和三七藥材的復方制劑的質量檢測方法，包括以下步驟分別制備供試品溶液和對照品溶液，用高效液相色譜法測定，其特征是對照品為選自原兒茶醛，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，丹酚酸B，人參皂苷Rb1，隱丹參酮或丹參酮IIA中的幾個；色譜條件為用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；乙腈-0.1％的磷酸水為流動相，其中A為0.1％的磷酸水，B為乙腈，A+B＝100％，采用梯度洗脫0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B；柱溫25-35℃；流速1ml/min，當22～28min時，流速改為0.8ml/min；DAD檢測器，檢測波長為203，270，281nm。
2.權利要求1的質量檢測方法，其中對照品為原兒茶醛，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，丹酚酸B，人參皂苷Rb1，隱丹參酮或丹參酮IIA。
3.權利要求1的質量檢測方法，其中柱溫是30℃。
4.權利要求1的質量檢測方法，其中對照品的制備方法為分別精密稱取對照品a、原兒茶醛，b、三七皂苷R1，c、人參皂苷Rg1，d、丹酚酸B，e、人參皂苷Rb1，加70％甲醇定容，f、隱丹參酮和g、丹參酮IIA加甲醇定容，作為對照品貯備液；分別精密吸取對照品貯備液，置容量瓶中混合并加70％甲醇定容，形成混合對照品溶液，濃度范圍分別為a、1.32-210.40μg/ml，b、15.34-368.16μg/ml，c、14.76-590.40μg/ml，d、12.70-762.00μg/ml，e、30.06-601.20μg/ml，f、0.33-66.00μg/ml，g、0.32-64.56μg/ml。
5.權利要求1的質量檢測方法，其中供試品溶液的制備方法為取含有丹參和三七藥材的復方制劑，去糖衣或薄膜衣，研磨成粉末，精密稱取0.25g～2.0g置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容，超聲提取30min，放冷，加入70％甲醇補足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。
6.權利要求1的質量檢測方法，高效液相色譜的進樣量為10μl；記錄時間80min。
7.權利要求1的質量檢測方法，其中檢測波長為203，281nm。
8.權利要求1的質量檢測方法，其中復方制劑選自丹七片、復方丹參片、復方丹參滴丸或冠心丹參片。
全文摘要
本發(fā)明涉及中藥質量檢測領域，具體來說涉及一種含有丹參和三七藥材的復方制劑的質量檢測方法。采用了HPLC－DAD法同時測定復方丹參制劑中原兒茶醛，丹酚酸B，隱丹參酮，丹參酮IIA，三七皂苷R1，人參皂苷Rg1，人參皂苷Rb1的含量，本方法相對簡單，具良好的精密度，重現(xiàn)性和可靠性，可同時測定復方丹參制劑中丹參和三七的多類活性成分的含量，可用于復方丹參制劑的質量控制。
文檔編號A61P9/10GK1772041SQ200510095179
公開日2006年5月17日 申請日期2005年11月2日 優(yōu)先權日2005年11月2日
發(fā)明者李萍, 韋英杰, 李松林 申請人:中國藥科大學