專(zhuān)利名稱(chēng)：一種納米參芪扶正注射制劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米參芪扶正注射制劑的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
納米中藥主要是指運(yùn)用納米技術(shù)制造的，粒徑小于100納米的中藥有效成分、有效部位、原藥及復(fù)方制劑。納米中藥的制備是研究納米中藥最基礎(chǔ)、最重要的問(wèn)題。將納米技術(shù)引入中藥的研究時(shí)，必須考慮中藥組方的多樣性、中藥成分的復(fù)雜性。中藥的有效部位和有效成分又包括無(wú)機(jī)化合物和有機(jī)化合物、水溶性成分和脂溶性成分等。因此，針對(duì)不同的藥物，在進(jìn)行納米化時(shí)必須采用不同的技術(shù)路線。納米中藥與中藥新制劑關(guān)系十分密切，如何在中藥理論的指導(dǎo)下進(jìn)行納米中藥新制劑的研究，將中藥制成高效、速效、長(zhǎng)效、計(jì)量小、低毒、服用方便的現(xiàn)代制劑，也是進(jìn)行中藥納米化時(shí)必須考慮的問(wèn)題。
參芪扶正注射液是采用我國(guó)傳統(tǒng)扶正補(bǔ)氣藥物黨參、黃芪為主要原料，采用水提取醇沉淀的方法分離出有效成分配制而成的靜脈型大輸液，具有扶正固本、益氣補(bǔ)虛的功效，與化療合用有助于提高療效，保護(hù)血象，可改善患者免疫功能，改善氣虛癥狀及生存質(zhì)量。經(jīng)多年的臨床應(yīng)用表明，參芪扶正注射液有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，對(duì)氣虛型的晚期腫瘤患者有較好的治療效果，具有益氣健脾、補(bǔ)氣養(yǎng)血的扶正作用，可與化療配合，用于氣虛證肺癌、胃癌的輔助治療，是一種理想的抗腫瘤輔助中成藥。
由于腫瘤患者體質(zhì)虛弱，氣血不足的病理特點(diǎn)帶有普遍性和根本性，因此扶助正氣，補(bǔ)益氣血是治療腫瘤的根本法則。參芪扶正注射液用于氣虛證腫瘤病人的治療，可改善患者的氣虛癥狀，提高生存質(zhì)量。但是，參芪扶正注射液在臨床應(yīng)用中劑型為液體輸液，穩(wěn)定性較差，貯存一定時(shí)間后往往出現(xiàn)pH值的改變，引起外觀色澤變深，甚至出現(xiàn)渾濁和沉淀，使澄明度不合格；此外，參芪扶正注射液在臨床應(yīng)用中曾有少數(shù)患者出現(xiàn)低熱、口腔炎、嗜睡等不良反應(yīng)。這些癥狀可能與患者長(zhǎng)期患有癌癥，身體虛弱，對(duì)藥物耐受性差等因素有關(guān)。
申請(qǐng)?zhí)枮?1100151.8“納米參芪制劑藥物及其制備方法”的專(zhuān)利中只是單純的將黨參和黃芪兩味中藥粉碎成納米級(jí)顆粒，并沒(méi)有藥理試驗(yàn)證明該制劑的藥理作用，只是泛泛的說(shuō)生物利用度提高，實(shí)用性不強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述原因，本發(fā)明研究人員經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)研究，運(yùn)用中藥納米技術(shù)，將參芪扶正注射液制備成本發(fā)明納米注射制劑，該方法簡(jiǎn)便，易于大生產(chǎn)，采用本發(fā)明方法制備的制劑有明顯的靶向作用，溶解性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、載藥量大并且制劑穩(wěn)定性顯著提高，本發(fā)明制劑安全性更好、刺激性小，能顯著提高扶正固本、益氣補(bǔ)虛等功效。本發(fā)明制劑能顯著提高癌癥病人的生活質(zhì)量，減輕化療后癌癥病人的疾病痛苦。藥理研究表明該制劑在活血化瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)血、提高機(jī)體免疫力、輔助癌癥晚期的治療效果等藥效作用方面均有顯著性提高。
本發(fā)明旨在提供一種穩(wěn)定、安全、療效好、具有靶向作用的納米參芪扶正注射制劑。
本發(fā)明與參芪扶正注射液比較，其特征在于采用本發(fā)明工藝將黨參、黃芪有效部位制備成達(dá)到納米粒徑的制劑，采用本發(fā)明方法制備的納米制劑具有顯著的靶向性。
本發(fā)明旨在應(yīng)用納米技術(shù)將中藥復(fù)方制備成納米注射制劑，使其療效顯著提高。
本發(fā)明還提供了納米參芪扶正注射制劑的制備方法。
本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一、工藝制法(1)有效部位的制備按照中成藥部頒標(biāo)準(zhǔn)[ws-459(z-065)和ws-387(z-50)-99]項(xiàng)下的制備方法提取純化，黨參和黃芪最后濾液減壓回收乙醇至干，得到有效部位。
(2)制劑處方重量份組成為有效部位1-5重量份，藥用載體6-30重量份；(3)主藥混懸液的制備方法取有效部位、乳化劑和脂質(zhì)，在通氮?dú)鈼l件下加熱至70-90℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油和poloxamer-188的水溶液，制成粗乳，在70-90℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)(或高速剪切乳勻)在35-45MPa壓力下乳勻5-7次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(4)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入氯化鈉或葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加入賦形劑，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑。
上述制備方法中，脂質(zhì)、乳化劑統(tǒng)稱(chēng)為載體。
本發(fā)明所用的脂質(zhì)可以選用脂肪酸甘油酯類(lèi)(包括三硬脂酸甘油酯、三棕櫚酸甘油酯、三肉豆蔻酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三窬酸甘油酯、Witepsol W35、Witepsol H35、Witepsol H42、單硬脂酸甘油酯)及脂肪酸類(lèi)(如硬脂酸、棕櫚酸)中的一種或幾種。
本發(fā)明所用乳化劑可以選用磷脂(包括大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂及磷脂酰膽堿等)、Pluronic F-68、泊洛沙姆、聚山梨醇、膽酸鹽、四丁酚醛中的一種或幾種。
本發(fā)明主藥混懸液制備方法中溫度優(yōu)選為75℃-85℃本發(fā)明的一種納米參芪扶正注射制劑的水針劑、輸液劑中加入少量PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，可以提高制劑的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的一種納米參芪扶正注射制劑的凍干粉針制劑的賦形劑為甘露醇、葡萄糖、乳糖、右旋糖酐、葡聚糖中的一種或兩種。
將主藥應(yīng)用納米技術(shù)制備成納米藥物，提高了藥物血腦屏障的透過(guò)率。但是透過(guò)率的大小與藥物的載體及制備溫度有密切關(guān)系，脂質(zhì)、乳化劑的選擇及其它們的比例關(guān)系，溫度的選擇都對(duì)藥物透過(guò)血腦屏障有很大的影響，為了確保本發(fā)明制劑能最大最有效的透過(guò)血腦屏障，本實(shí)驗(yàn)室研究人員對(duì)脂質(zhì)、乳化劑、溫度等相關(guān)條件進(jìn)行了優(yōu)選實(shí)驗(yàn)，最終得到本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑，該制劑在臨床治療方面得到了很好的臨床治療效果。
二、優(yōu)選試驗(yàn)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)驗(yàn)以藥物在腦脊液中的濃度為指標(biāo)。具體實(shí)驗(yàn)方法為取新西蘭家兔，體重約2.5kg，雌雄不限。靜脈注射納米參芪扶正注射液(生藥)1.2g/kg，于給藥后20分鐘抽取0.5ml腦脊液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取腦脊液0.25ml加溶劑混懸15min后，靜置15min，以10000r/min離心1min，取上清液20μl進(jìn)樣，以毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷為指標(biāo)，用高效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定。
1.不同脂質(zhì)對(duì)主藥透過(guò)血腦屏障的影響制備一系列藥物，其中主藥、乳化劑的種類(lèi)和用量相同，脂質(zhì)按下表的設(shè)計(jì)進(jìn)行安排，測(cè)定腦脊液中的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
為了比較方便，將測(cè)定的兔腦脊液中的最大濃度計(jì)為100％。
表1不同脂質(zhì)對(duì)主藥透過(guò)血腦屏障的影響

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同脂質(zhì)對(duì)主藥通過(guò)血腦屏障有影響，均可以增加主藥對(duì)于血腦屏障的通透性，其中三硬脂酸甘油酯和三月桂酸甘油酯的作用效果最好。
2.不同乳化劑對(duì)主藥透過(guò)血腦屏障的影響制備一系列藥物，其中主藥、脂質(zhì)的種類(lèi)和用量相同，乳化劑按下表的設(shè)計(jì)進(jìn)行安排，測(cè)定腦脊液中的藥物濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
為了比較方便，將測(cè)定的兔腦脊液中的最大濃度計(jì)為100％。
表2不同乳化劑對(duì)主藥透過(guò)血腦屏障的影響


由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，不同乳化劑對(duì)主藥通過(guò)血腦屏障有影響，均可以增加主藥對(duì)于血腦屏障的通透性，其中大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂的作用效果最好。
3.脂質(zhì)和乳化劑用量比例的選擇制備一系列藥物，脂質(zhì)和乳化劑用量按下表的設(shè)計(jì)進(jìn)行安排。測(cè)定了500個(gè)粒徑，計(jì)算平均粒徑。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3脂質(zhì)和乳化劑用量比例的選擇

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)脂質(zhì)和乳化劑、助乳化劑用量為4-6∶2時(shí)，粒徑較小。
4.溫度的選擇制備一系列藥物，主藥、脂質(zhì)、乳化劑的種類(lèi)和用量相同，在不同溫度下制備藥物，以包封率為指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表4。
表4溫度的選擇

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)溫度在65-90℃時(shí)，包封率較好；當(dāng)溫度為75-85℃時(shí)，包封率最好。
三、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版附錄XIX E“微囊、微球與脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則”中的方法。H-7000型透射電鏡儀(日本Hitachi公司)；Zetamaster光子相關(guān)光譜儀(英國(guó)Malvern公司)；LC-10A高效液相色譜儀(日本島津)；TGL-18G型臺(tái)式高速離心機(jī)。
1.形態(tài)觀察及粒徑將本專(zhuān)利納米藥物在透射電鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察，可見(jiàn)呈圓球體，大小較均勻，表面光滑，無(wú)粘連。根據(jù)納米藥物的光學(xué)顯微照片測(cè)定了500個(gè)，平均粒徑為55±10nm，最大粒徑為120nm，最小粒徑為45nm，且粒徑分布符合正態(tài)分布規(guī)律。
2.包封率和載藥量測(cè)定采用反相高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，并用下述公式計(jì)算包封率和載藥量包封率(％)＝(投藥量-游離藥物量)/投藥量×100％；載藥量(％)＝(投藥量-游離藥物量)/納米藥物的重量×100％。
結(jié)果包封率為90.8％，載藥量為8％-20％。
3.穩(wěn)定性考察將納米藥物分別置于小瓶?jī)?nèi)，密封。于冰箱(3-5℃)、室溫(20-25℃)和37℃(RH75％)的環(huán)境中放置，于0、1、2和3月觀測(cè)納米藥物的外觀、大小、再分散性等。結(jié)果均未見(jiàn)明顯變化，3種條件下的納米藥物再分散性保持良好，無(wú)聚合現(xiàn)象的發(fā)生。結(jié)果見(jiàn)表5。
表5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果


4.加速實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定參芪扶正注射液(麗珠集團(tuán)制藥廠生產(chǎn))；本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑(按本發(fā)明制備工藝制備，由北京聯(lián)合偉華藥業(yè)中藥實(shí)驗(yàn)室提供)；將以上制劑分別置40℃，RH75％條件下放置6個(gè)月，分別測(cè)定制劑中的成分毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，考察加速條件下納米參芪扶正制劑含量的變化(以0月含量為100％計(jì)算)。結(jié)果見(jiàn)表6。
表6制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明在加速實(shí)驗(yàn)過(guò)程中參芪扶正注射液的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量下降明顯，而采用本發(fā)明方法制備的納米參芪扶正注射制劑變化較小，說(shuō)明本發(fā)明納米參芪扶正制劑的制備方法顯著提高了制劑的質(zhì)量和穩(wěn)定性，具有重要的實(shí)際意義。
結(jié)論通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)表明，本專(zhuān)利納米藥物具有很好的穩(wěn)定性，充分說(shuō)明本發(fā)明工藝具有實(shí)際意義。
四、藥理和耙向試驗(yàn)試藥與動(dòng)物參芪扶正注射液(麗珠集團(tuán)利民制藥廠生產(chǎn))；本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑(按本發(fā)明制備工藝制備，由北京聯(lián)合偉華藥業(yè)中藥實(shí)驗(yàn)室提供)；Wistar大鼠，體重180-220g；健康昆明種小鼠，體重18-22g；瘤株小鼠S180，小鼠肝癌Heps、人中分化胃癌細(xì)胞株MKN-45(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤所動(dòng)物中心)。
1.抗腫瘤試驗(yàn)1.1對(duì)小鼠移植性肝癌Heps的影響和靶向作用無(wú)菌抽取接種后第7d的肝癌Heps荷瘤小鼠腹水，加4倍量生理鹽水混勻，立即接種于小鼠右前肢腋窩處皮下，每只接種0.2ml，接種后24h隨機(jī)分組，每組10只，小鼠尾靜脈注射給藥，給藥劑量相當(dāng)于1.2g生藥/kg，給藥容積同為0.2ml/只，對(duì)照組給予等量生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)給藥10d，于末次給藥后24h脫頸處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤稱(chēng)重，取腫瘤細(xì)胞然后按組織∶生理鹽水為1∶1.5(W/V)的比例勻漿，離心10min(2000rpm)，取上清液用HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。同時(shí)末次給藥后1h取血測(cè)定血清中的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的濃度。結(jié)果見(jiàn)表7、表8。
表7對(duì)移植性肝癌Heps小鼠的影響

注與生理鹽水組比較**P＜0.01，與參芪扶正注射液組比較ΔP＜0.01表8對(duì)移植性肝癌Heps的靶向作用

結(jié)果表明本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑能顯著抑制小鼠移植性肝癌Heps的生長(zhǎng)，具有比參芪扶正注射液更好的藥理作用，本發(fā)明納米注射制劑與參芪扶正注射液比較血清中藥物濃度相當(dāng)，而腫瘤細(xì)胞中有效成分含量顯著增加，表明本發(fā)明納米注射制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的靶向性。
1.2對(duì)人中分化胃癌細(xì)胞株MKN-45的影響和靶向作用無(wú)菌抽取接種后第7d的胃癌細(xì)胞株MKN-45荷瘤小鼠腹水，加4倍量生理鹽水混勻，立即接種于小鼠右前肢腋窩處皮下，每只接種0.2ml，接種后24h隨機(jī)分組，每組10只，小鼠尾靜脈注射給藥，給藥劑量相當(dāng)于1.2g生藥/kg，給藥容積同為0.2ml/只，對(duì)照組給予等量生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)給藥10d，于末次給藥后24h脫頸處死小鼠，剝?nèi)∧[瘤稱(chēng)重，取腫瘤細(xì)胞然后按組織∶生理鹽水為1∶1.5(W/V)的比例勻漿，離心10min(2000rpm)，取上清液用HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。同時(shí)末次給藥后1h取血測(cè)定血清中的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的濃度。結(jié)果見(jiàn)表9、表10。
表9對(duì)人中分化胃癌細(xì)胞株MKN-45小鼠的影響

注與生理鹽水組比較**P＜0.01，與參芪扶正注射液組比較ΔP＜0.01表10對(duì)人中分化胃癌細(xì)胞株MKN-45的靶向作用

結(jié)果表明本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑能顯著抑制人中分化胃癌細(xì)胞株MKN-45的生長(zhǎng)，具有比參芪扶正注射液更好的藥理作用，本發(fā)明納米注射制劑與參芪扶正注射液比較血清中藥物濃度相當(dāng)，而腫瘤細(xì)胞中有效成分含量顯著增加，表明本發(fā)明納米注射制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較好的靶向性。
1.3對(duì)小鼠S180腫瘤的抑制作用和靶向作用取接種傳代小鼠S180，在勻漿器中加入生理鹽水，制成小鼠S180瘤勻漿液，再以生理鹽水1∶3稀釋?zhuān)缓笕?.2ml注入小鼠左腋皮下，24小時(shí)稱(chēng)重，分組，每組10只，給藥組小鼠每日尾靜脈給藥一次，給藥劑量為1.2g生藥/kg，給藥容積同為0.2ml/只，對(duì)照組給予等量生理鹽水，共7天。停藥次日處死小鼠，稱(chēng)體重并細(xì)心剝離皮下瘤塊，于EM50電子天平稱(chēng)取瘤重，并計(jì)算抑瘤率，將稱(chēng)重后的瘤塊按組織∶生理鹽水為1∶1.5(W/V)的比例勻漿，離心10min(2000rpm)，取上清液，用HPLC法測(cè)定腫瘤組織和血清中的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。同時(shí)末次給藥后1h取血測(cè)定血清中的毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的濃度。結(jié)果見(jiàn)表11、表12。
表11對(duì)小鼠S180腫瘤生長(zhǎng)抑制作用

注與生理鹽水組比較**P＜0.01，與參芪扶正注射液比較ΔP＜0.01表12對(duì)小鼠S180腫瘤的靶向作用

結(jié)果表明本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑能顯著抑制小鼠腫瘤S180生長(zhǎng)，具有比參芪扶正注射液更好的藥理作用，本發(fā)明納米注射制劑與參芪扶正注射液比較血清中藥物濃度相當(dāng)，而腫瘤細(xì)胞中有效成分顯著增加，表明本發(fā)明納米注射制劑具有較好的靶向性。
1.4對(duì)荷瘤S180小鼠死亡率和存活時(shí)間的影響取接種傳代小鼠S180，在勻漿器中加入生理鹽水，制成小鼠S180瘤勻漿液，再以生理鹽水1∶3稀釋?zhuān)缓笕?.2ml注入小鼠左腋皮下，于接種腫瘤后一周，小鼠尾靜脈注射給藥，給藥劑量相當(dāng)于1.2g生藥/kg，給藥容積同為0.2ml/只，對(duì)照組給予等量生理鹽水，每日給藥1次，讓其自然死亡，待對(duì)照組動(dòng)物全部死亡后，比較死亡率，并比較90天各組動(dòng)物的存活時(shí)間差異，設(shè)給藥組與對(duì)照組，每組小鼠20只，結(jié)果見(jiàn)表13。
表13對(duì)小鼠死亡率和存活時(shí)間的影響

注與生理鹽水組比較**P＜0.01，與參芪扶正注射液組比較ΔP＜0.05結(jié)果表明本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑能顯著降低荷瘤小鼠死亡率，延長(zhǎng)荷瘤小鼠存活時(shí)間，與參芪扶正注射液比較作用更顯著。
2.對(duì)小鼠白細(xì)胞減少癥的影響取體重18-22g的昆明種小鼠50只，隨機(jī)分5組，每組10只，雌雄各半，即正常對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組、參芪扶正注射液組、本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑組。除正常對(duì)照組外均給予環(huán)磷酰胺100g/kg腹腔注射，每日1次，連續(xù)3日，同時(shí)各給藥組分別靜脈給藥，給藥劑量相當(dāng)于生藥1.2g/kg，每天給藥2次，連續(xù)8天，分別于第4天和第8天由眼眶靜脈取血，鏡檢白細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表14。
表14對(duì)小鼠白細(xì)胞減少癥的影響

注與正常對(duì)照組比較**P＜0.01，與參芪扶正注射液組比較ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)于環(huán)磷酰胺所致的白細(xì)胞減少癥，本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑組與參芪扶正注射液比較具有更好的升高白細(xì)胞作用。
3.血管刺激性考察取家兔8只，隨機(jī)均分2組，每組4只，分別于左耳把家兔置于固定器中，且頭用兔頭固定儀固定，用酒精將皮膚消毒后，于右側(cè)耳緣靜脈注射參芪扶正注射液和本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑，給藥劑量相當(dāng)于生藥1.2g/kg，于另一側(cè)對(duì)應(yīng)部位注射同一體積的生理鹽水作為對(duì)照，每日注射1次，連續(xù)1周，觀察兔耳緣靜脈反應(yīng)，每日觀察注射部位血管有無(wú)發(fā)紅、水腫、周?chē)袩o(wú)滲血，觸摸血管有無(wú)變硬現(xiàn)象，左右耳比較觀察。于末次給藥后24h，將動(dòng)物處死，取下兩耳，進(jìn)行組織切片檢查，切片部位為進(jìn)針部位的向心端，距進(jìn)針部位1-4cm，分1-2.5cm和2.5-4cm兩段取樣。
觀察指標(biāo)及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)觀察方法包括肉眼觀察和顯微鏡下病理觀察。觀察給藥血管及其周?chē)M織的變化，顯微鏡下觀察耳緣靜脈有無(wú)血栓形成、內(nèi)皮損傷及血管周?chē)M織的病理變化情況。對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)評(píng)分。①血管變化肉眼觀察無(wú)明顯充血記0分，輕度充血發(fā)紅、紋路清晰記1分，充血發(fā)紅、紋路不清記2分，重度充血、呈紫紅色記3分；顯微鏡觀察血管內(nèi)皮及血管壁完整記0分，有內(nèi)皮損傷記1分，有血栓栓塞記2分，血管破裂記3分。②血管周?chē)M織變化肉眼觀察無(wú)明顯水腫記0分，輕微水腫記1分，明顯水腫記2分，嚴(yán)重水腫記3分；顯微鏡觀察周?chē)M織正常記0分，水腫記1分，出血記2分，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記3分。將每組4只家兔各項(xiàng)觀察指標(biāo)得分累加，計(jì)算各組平均得分值，見(jiàn)表15。
表15刺激性試驗(yàn)結(jié)果

由以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑與參芪扶正注射液比較刺激性具有明顯改善。
4.溶血毒性考察2％紅細(xì)胞混懸液的制備取兔耳緣靜脈取血10-20ml，放入盛有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10分鐘，除去纖維蛋白原，使成脫纖血。加10倍量的生理鹽水溶液，搖勻，離心，除去上清液，沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水溶液洗滌2-3次，至上清液不呈紅色時(shí)為止。將所得的紅細(xì)胞用生理鹽水配成濃度為2％的混懸液，即得。
試驗(yàn)方法取試管6支，按表中的配比量依次加入2％紅細(xì)胞混懸液和生理鹽水溶液，混勻，于37℃恒溫箱中放置30分鐘，分別加入不同量的藥液(以第6管為空白對(duì)照)，搖勻后，置37℃恒溫箱中，開(kāi)始每隔15分鐘觀察1次，1小時(shí)后，每隔1小時(shí)觀察1次，共觀察2小時(shí)。結(jié)果見(jiàn)表16。
表16溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果以第3試管為準(zhǔn)，各管均未染有紅色，顯微鏡下觀察未見(jiàn)有紅細(xì)胞破裂，說(shuō)明本品不溶血，安全性好。
5.急性毒性實(shí)驗(yàn)取Wistar大鼠80只，雌雄各半。禁食24h，隨機(jī)分4組，每組20只。濃縮成相同的生藥濃度，各組分別尾靜脈注射藥物，給藥劑量按生藥量折算相當(dāng)于1.2g生藥/kg，每天給藥3次，連續(xù)7天，觀察小鼠死亡情況，結(jié)果見(jiàn)表17。
表17急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果


急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑與參芪扶正注射液比較安全性更好。
6.靶向組織中藥物含量的測(cè)定取大鼠40只，體重約180-220g，雌雄不限，分為4組。靜脈注射本發(fā)明制劑和參芪扶正注射液1.2g/kg，30min后立即斷頭處死，取血漿和腦組織，取血漿離心10min(2000rpm)，取血清分析測(cè)定含量。取出的腦組織用生理鹽水輕輕沖洗，用濾紙吸干，腦膜血管剝離干凈后取兩側(cè)大腦皮層處組織，稱(chēng)重。然后按組織∶生理鹽水＝1∶1.5(W/V)的比例勻漿，離心10min(2000rpm)，取上清液分析測(cè)定含量，計(jì)算結(jié)果以血清中用毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的絕對(duì)含量為1，計(jì)算其他組織中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表18。
表18各組織中毛蕊異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷含量的測(cè)定(℃)

結(jié)果血清中藥物濃度相當(dāng)，而靶向組織中藥物濃度顯著提高，說(shuō)明本發(fā)明制劑具有一定靶向性。
小結(jié)以上藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑藥理作用顯著好于參芪扶正注射液，且本發(fā)明納米參芪扶正注射制劑具有更好的靶向性和安全性。
五、制備實(shí)施例實(shí)施例1取黨參、黃芪藥材各400g，粉碎成粗粉，加入去離子水加熱提取3此，每次加水量分別為8倍、6倍、6倍。煎煮時(shí)間分別為1小時(shí)、1小時(shí)、0.5小時(shí)，合并3次提取液，濃縮至每1ml中含生藥量約為1.0-1.5g，攪拌下加入乙醇，使含乙醇量達(dá)60％，充分?jǐn)嚢韬箪o置24小時(shí)，過(guò)濾，濾液回收乙醇并濃縮至每1ml含生藥量1.8-2.2g，攪拌下加入乙醇，使含乙醇量達(dá)80％，充分?jǐn)嚢韬罄涮?2-10℃)靜置24小時(shí)，過(guò)濾，濾液減壓回收乙醇至干，濃縮至每1ml中含生藥量為1.8-2.2g，得到本發(fā)明參芪扶正有效部位。
實(shí)施例2(1)取有效部位5g、大豆卵磷脂12g和三月桂酸甘油酯18g，在通氮?dú)鈼l件下加熱至75℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油4g和poloxamer-188 20g的水溶液，制成粗乳，在80℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)(或高速剪切乳勻)在41.4MPa壓力下乳勻6次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑1000支；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入氯化鈉調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑500瓶；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加入甘露醇，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑1000支。
將上述納米制劑進(jìn)行檢測(cè)，其納米粒徑為45-120納米實(shí)施例3
(1)取有效部位10g、蛋黃卵磷脂24g和三硬脂酸甘油酯36g，在通氮?dú)鈼l件下加熱至84℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油6g和poloxamer-188 35g的水溶液，制成粗乳，在88℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)(或高速剪切乳勻)在42MPa壓力下乳勻4次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑1000支；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑500瓶；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加入葡萄糖，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑1000支。
將上述納米制劑進(jìn)行檢測(cè)，其納米粒徑為45-120納米實(shí)施例4(1)取有效部位8g、磷脂酰膽堿15g和三棕櫚酸甘油酯25g，在通氮?dú)鈼l件下加熱至82℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油4g和poloxamer-188 25g的水溶液，制成粗乳，在85℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)(或高速剪切乳勻)在41.5MPa壓力下乳勻6次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑1000支；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑500瓶；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加乳糖，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑1000支。
將上述納米制劑進(jìn)行檢測(cè)，其納米粒徑為45-120納米實(shí)施例5(1)取有效部位15g、泊洛沙姆30g和三肉豆蔻酸甘油酯50g，在通氮?dú)鈼l件下加熱至80℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油10g和poloxamer-188 40g的水溶液，制成粗乳，在85℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)(或高速剪切乳勻)在41MPa壓力下乳勻5次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑1000支；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑500瓶；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加入右旋糖酐，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑1000支。
將上述納米制劑進(jìn)行檢測(cè)，其納米粒徑為45-120納米實(shí)施例6(1)取有效部位3g、聚山梨醇6g和三窬酸甘油酯10g，在通氮?dú)鈼l件下加熱至85℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油2g和poloxamer-188 10g的水溶液，制成粗乳，在90℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)(或高速剪切乳勻)在41.8MPa壓力下乳勻4次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液。
(2)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑1000支；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入氯化鈉調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑500瓶；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加入葡聚糖，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑1000支。
將上述納米制劑進(jìn)行檢測(cè)，其納米粒徑為45-120納米
權(quán)利要求
1.一種納米參芪扶正注射制劑，其特征在于該藥物組成包括有效部位1-5重量份，藥用載體6-30重量份；其特征還在于納米參芪扶正注射制劑中納米粒徑為45-120納米；
2.如權(quán)利要求1所述的納米參芪扶正注射制劑的制備方法，其特征包括以下步驟(1)制劑處方重量份組成為有效部位1-5重量份，藥用載體6-30重量份；(2)主藥混懸液的制備方法取有效部位、乳化劑和脂質(zhì)，在通氮?dú)鈼l件下加熱至70-90℃，在攪拌條件下加入相同溫度甘油和poloxamer-188的水溶液，制成粗乳，在70-90℃通氮?dú)鈼l件下用高壓乳勻機(jī)在35-45MPa壓力下乳勻5-7次，充氮?dú)夥盅b后，迅速冷卻形成主藥混懸液；(3)制劑的制備水針制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正水針制劑；輸液制劑的制備取上述混懸液，加PVP適量，加注射用水至全量，攪勻，加入氯化鈉或葡萄糖調(diào)等滲，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，滅菌，制備成本發(fā)明納米參芪扶正輸液制劑；凍干粉針制劑的制備取上述混懸液，加入賦形劑，加注射用水調(diào)整濃度，調(diào)pH值為6.5-7.5，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，冷凍干燥，制備成本發(fā)明納米參芪扶正凍干粉針制劑；
3.如權(quán)利要求1所述的納米參芪扶正注射制劑的制備方法，其特征在于所述的脂質(zhì)為三硬脂酸甘油酯和三月桂酸甘油酯；
4.如權(quán)利要求1所述的納米參芪扶正注射制劑的制備方法，其特征在于所述的乳化劑為大豆卵磷脂和蛋黃卵磷脂；
5.如權(quán)利要求1所述的納米參芪扶正注射制劑的制備方法，其特征在于所述的脂質(zhì)與乳化劑的用量比是4-6∶2；
6.如權(quán)利要求1所述的一種納米參芪扶正注射制劑的制備方法，其特征在于所述的溫度為75℃-85℃；
7.如權(quán)利要求1所述的一種納米參芪扶正注射制劑，其特征在于用作氣虛型癌癥的輔助治療；
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種納米參芪扶正注射制劑的制備方法及其應(yīng)用，將黨參和黃芪的總提取物與適宜的藥用輔料采用本發(fā)明工藝方法制成納米載體，并制備成水針劑、凍干粉針劑和輸液劑。采用本發(fā)明方法制備的制劑有明顯的靶向作用，溶解性好、理化性質(zhì)穩(wěn)定、載藥量大并且制劑穩(wěn)定性顯著提高；本發(fā)明制劑安全性更好、刺激性小，能顯著提高扶正固本、益氣補(bǔ)虛等功效。本發(fā)明制劑能顯著提高癌癥病人的生活質(zhì)量，減輕化療后癌癥病人的疾病痛苦。藥理研究表明該制劑在活血化瘀、補(bǔ)氣養(yǎng)血、提高機(jī)體免疫力、輔助癌癥晚期的治療效果等藥效作用方面均有顯著性提高。
文檔編號(hào)A61P37/02GK1923223SQ200510098530
公開(kāi)日2007年3月7日 申請(qǐng)日期2005年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月2日
發(fā)明者張樹(shù)祥, 闞迎昕 申請(qǐng)人:北京聯(lián)合偉華藥業(yè)有限公司