專利名稱：基于癌抑制基因wt1的產物的癌抗原的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及以Wilms腫瘤的癌抑制基因WT1的產物為基礎的癌抗原。該癌抗原作為針對白血病、骨髓異形成綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血癌或實體瘤，例如胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞瘤、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等以及WT1表達的所有癌的抗癌疫苗上有用的。
背景技術：
用于排除異物的免疫機構一般包括與識別抗原作為抗原提示細胞作用的巨噬細胞、識別該巨噬細胞的抗原提示產生各種淋巴因子使其他T-細胞等活化的輔助T細胞、通過該淋巴因子的作用分化成抗體產生細胞的B淋巴細胞等有關的體液免疫以及接受抗原提示分化成的殺傷T細胞攻擊破壞靶細胞的細胞免疫。
現(xiàn)在，認為癌的免疫主要是與殺傷T細胞有關的細胞性免疫引起的。在殺傷T細胞引起的癌免疫中，識別以主要組織適合抗原(MajorHistocompatibility Complex，MHC)第I類與癌抗原形成的復合體形式提示的癌抗原的前體T細胞分化增殖生成的殺傷T細胞攻擊破壞癌細胞。這時，癌細胞在其細胞表面提示MHC第I類抗原與癌抗原形成的復合體，它成為殺傷T細胞的靶細胞(Cur.Opin，Immunol.，5，709，1993；Cur.Opin，Immunol.，5，719，1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev，146，167，1995)。
作為靶細胞的癌細胞上通過MHC第I類抗原提示的上述癌抗原可以認為是癌細胞內合成的抗原蛋白質被細胞內蛋白酶處理生成的約8～12個氨基酸構成的肽(Cur.Opin，Immunol.，5，709，1993；Cur.Opin.Immunol.，5，719，1993；Cell，82，13，1995；Immunol.Rev.，146，167，1995)。
現(xiàn)在，對于各種癌進行了抗原蛋白質的檢索，證明是癌特異抗原的物質較少。
Wilms腫瘤的癌抑制基因WT1(WT1基因)是根據(jù)對Wilms腫瘤、無紅彩、泌尿生殖器異常、精神發(fā)達遲滯等并發(fā)的WAGR綜合癥的解析，作為Wilms腫瘤的一種原因基因從染色體11p13分離出的物質(Gessler，M.等，Nature，Vol.343，p.774-778(1990))，基因組DNA通過約50kb由10個外顯子構成，其cDNA為約3kb。由cDNA推測出的氨基酸序列如序列號1所示(Mol.Cell.Biol.，11，1707，1991)。
WT1基因在人白血病中高度表達，用WT1反義低聚物(antisenseoligomer)處理白血病細胞能夠抑制其細胞增殖(特開平9-104627號公報)等提示W(wǎng)T1基因可以促進白血病細胞的增殖。而且，WT1基因在胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體瘤中高度表達(特愿平9-191635)，判斷出WT1基因是白血病和實體瘤中新的腫瘤標識物。但是，尚未證明WT1基因表達產物是作為癌疫苗有用的癌特異抗原。
發(fā)明公開因此，本發(fā)明確認了WT1基因表達產物作為癌抗原的可能性，提供了一種新型癌抗原。
本發(fā)明人為了解決上述問題進行了各種研究，結果合成了WT1基因表達產物的氨基酸序列中含有被預測在小鼠和人的I類MHC和II類MHC的結合中作為錨定氨基酸(anchor amino acid)起作用的至少1個氨基酸的連續(xù)7～30個氨基酸構成的多肽，確認這些肽與MHC蛋白質結合，同時確認與I類MHC抗原結合時誘導殺傷T細胞，而且對靶細胞具有殺細胞效果，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明提供小鼠WT1表達產物或含有其一部分的癌抗原。在優(yōu)選的方式中，本發(fā)明提供以與WT1的cDNA對應的序列號1所示的氨基酸序列中包括用于與MHC抗原結合的錨定氨基酸在內的6～30個氨基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原。
而且本發(fā)明提供以與人WT1的cDNA對應的序列號2所示的氨基酸序列中包括用于與MHC抗原結合的錨定氨基酸在內的7～30個氨基酸構成的肽作為活性成分的癌抗原。
本發(fā)明還提供含有上述癌抗原的癌疫苗。
附圖的簡單說明

圖1表示實施例1中用Db126肽免疫的細胞與非免疫細胞在流式細胞測量法中CD4+細胞與CD8+細胞的比例。
圖2是比較實施例2中用Db126肽免疫的細胞對于用Db126肽脈沖的靶細胞和未脈沖的靶細胞的殺細胞作用。
圖3是與圖2含義相同的圖。
圖4中A表示實施例3中使用Db126肽誘導的CTL對于用Db126肽脈沖的T2細胞的殺細胞效果，B表示實施例3中使用WH187肽誘導的CTL對于用WH187肽脈沖的T2細胞的殺細胞效果。
圖5表示由Db126肽誘導的CTL的表面標識物通過FACS解析的結果(CD19細胞以及CD3細胞)。
圖6表示CD4細胞以及CD8細胞與圖5同樣的圖。
圖7表示CD56細胞與圖5同樣的圖。
圖8表示W(wǎng)H187肽誘導的CTL的表面標識物通過FACS解析的結果(CD19細胞和CD3細胞)。
圖9表示CD4細胞和CD8細胞與圖8同樣的圖。
圖10表示CD56細胞與圖8同樣的圖。
圖11表示抗HLA-A2.1抗體對Db126肽特異性CTL引起的對于用Db126肽脈沖的T2細胞的特異性細胞溶解的影響。
圖12是比較Db126肽特異性CTL對于表達WT1的靶細胞或不表達WT1的靶細胞的細胞溶解活性。a表示E∶T比為7.5∶1的情況下的結果，b表示E∶T比為15∶1的情況下的結果。
圖13是比較Db126肽特異性CTL對于先天表達WT1的腫瘤細胞(FBL3)或不表達WT1的腫瘤細胞(RMA)的細胞溶解效果。
圖14是比較Db126肽特異性CTL對于用WT1基因胞質轉移的細胞以及未進行胞質轉移的同一細胞的細胞溶解效果。
圖15表示I類抗H-2抗體對Db126肽特異性CTL的細胞毒性的影響。
圖16表示使用Db126肽作為疫苗使用，免疫小鼠時的體內免疫效果。
圖17表示將表達WT1的質粒作為DNA疫苗投給小鼠時的免疫效果。
圖18是圖17的對照，是表示投給不表達WT1的質粒時不產生免疫效果的圖。
發(fā)明的實施方式本發(fā)明中，作為設計癌抗原肽時的基礎，選擇小鼠I類MHC的Kb和Db，以及人HLA的A*0201，選擇預測與它們具有高親和性的肽。
根據(jù)Immunogenetics Vol.41，p.178-228(1995)的記載，預測與Kb結合的錨定氨基酸是5號的Phe和Tyr以及8號的Leu和Met等，另外預測與Db結合的錨定氨基酸是5號的Asn以及9號的Met和Ile等。
另外，已知癌細胞表面上I類MHC提示的癌抗原肽的大小為約8～12個。因此，本發(fā)明的癌抗原肽是序列號1所示W(wǎng)T1基因產物的氨基酸序列中包括錨定氨基酸在內的連續(xù)7～30個氨基酸構成的肽。氨基酸的數(shù)目優(yōu)選為8～12個，例如8或9個。
在本發(fā)明中，作為其具體例子，I類MHC與Kb結合的肽使用由8個氨基酸構成的下述肽Kb45 Gly Ala Ser AlaTyrGly SerLeu(序列號3)Kb330 Cys Asn Lys ArgTyrPheLysLeu(序列號4)I類MHC與Db結合的肽使用由9個氨基酸構成的下述肽Db126 Arg Met Phe ProAsnAla Pro Tyr Leu(序列號5)Db221 Tyr Ser Ser AspAsnLeu Tyr GlnMet(序列號6)Db235 Cys Met Thr TrpAsnGln Met Asn Leu(序列號7)上述序列中帶下劃線的氨基酸是被預測作為錨發(fā)揮作用的氨基酸。
其次，使用未提示抗原肽(empty)但表達Kb以及Db的細胞線測定這些肽中Kb45以及Kb330與I類MHC的Kb的結合性，Db126、Db221和Db235與I類MHC的Db的結合性。
也就是說，在26℃下培養(yǎng)RMA-S，使I類MHC高度表達，在37℃下培養(yǎng)該培養(yǎng)細胞與被測肽溶液1小時。這樣，不與肽結合的MHC分子變得不穩(wěn)定，從細胞表面消失，僅殘留與肽結合的I類MHG分子。其次，用識別I類MHC(Kb，Db)的熒光標識單克隆抗體給RMA-S細胞染色。最后，通過FACS解析，由每個細胞的平均熒光量計算結合解離常數(shù)(Immunol.Lett.，47，1，1995)。
結果，得到了下述結果。
Kb45-4.5784838(log)Kb330 -5.7617732Db126 -6.2834968Db221 -5.7545398Db235 -6.1457624如上所述，與Kb或Db具有強～中度的結合親和性(kd值)但顯示最高結合親和性的Db126肽在以后的實驗中被使用。
另外，對于人，根據(jù)Immunogenetics Vol.41，p，178-228(1995)的記載，預測與人HLA-A*0201結合的錨定氨基酸是N-末端至2號Leu和Met以及N-末端至9號Val和Leu。因此合成了人WT1蛋白質的氨基酸序列(Mol.Coll.Biol.Vol.11，p.1707-1712，1991)(序列號2)中符合上述條件的9個氨基酸構成的2種肽。
Db126；ArgMetPhe Pro Asn Ala Pro TyrLeu(序列號5)(與小鼠中Db126的序列相同)WH 187；SerLeuGly Glu Gln Gln Tyr SerVal(序列號8)(下劃線表示錨定氨基酸)如下所述測定上述肽與HLA-A*0201的結合能。
在37℃下培養(yǎng)上述肽與具有empty的HLA-A*0201的T2細胞(J.Immunol.，150，1763，1993；Blood，88，2450，1996)1小時后，用識別HLA-A2.1的熒光標識單克隆抗體給T2細胞染色，通過FACS解析，由每個細胞的平均熒光量計算結合解離常數(shù)。
結合能

2種肽均具有中度以上的結合親和性。
使用上述Db126以及WH187作為與人MHC對應的肽，進行以下試驗。
本發(fā)明還涉及以上述抗原為有效成分的癌疫苗。該疫苗可以用于WT1基因的表達水平上升伴有的癌，例如白血病、骨髓異形成綜合癥、多發(fā)性骨髓瘤、惡性淋巴瘤等血癌，胃癌、大腸癌、肺癌、乳腺癌、胚細胞癌、肝癌、皮膚癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌等實體瘤的預防或治療。該疫苗可以通過口服給藥或非口服給藥，例如腹腔內給藥、皮下給藥、皮內給藥、肌肉內給藥、靜脈內給藥、鼻腔內給藥等形式給藥。
而且，作為本發(fā)明疫苗的給藥方法，也可以從患者的末梢血收集單核細胞，從中取出分葉細胞，用本發(fā)明的肽脈沖，通過給患者皮下給藥等返回到患者中的方法。
疫苗除上述作為有效成分給藥的肽之外，還可以含有可藥用的載體，例如適當?shù)淖魟?，例如氫氧化鋁等礦物膠；溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇等表面活性劑；聚陰離子；肽；或油乳濁液?；蛘?，也可以混合到脂質體中，或含有多糖和/或疫苗中配合的其它集合體。給藥量一般每天0.1μg～1mg/kg。
另外本發(fā)明中編碼上述多肽疫苗的DNA也可以作為疫苗(DNA疫苗)使用。也就是說，通過將編碼WT1或其一部分的核酸，優(yōu)選將DNA插入適當?shù)妮d體，優(yōu)選插入表達載體中后，投給動物，可以產生癌免疫。其具體例子如實施例9所示。
實施例其次結合實施例說明本發(fā)明的肽作為癌抗原和癌疫苗是有用的。
實施例1在C57BL/6小鼠的腹腔內每周注射2次Db126肽100μg、來源于豬的乳酸脫氫酶(LDH)200μg以及弗羅因德不完全佐劑0.5ml，進行免疫處理。該免疫處理1周后摘出小鼠的脾臟，配制脾臟細胞的懸浮液。另一方面，在37℃下，培養(yǎng)用Db126肽脈沖的同系小鼠的放射線照射脾細胞和含有肽50μg/ml的溶液30分鐘，作為抗原提示細胞。
將上述免疫處理后的脾細胞與放射線照射脾細胞混合，一同培養(yǎng)5日，誘導配制殺傷T細胞。另一方面，用Db126肽脈沖(與100μg/ml的肽溶液在37℃下培養(yǎng)30分鐘)的Europium標記EL-4細胞(表達Kb和Db)作為靶細胞，采用常規(guī)方法，按照下述操作進行Killing分析(表1)。
結果，以Db126脈沖的EL-4細胞作為靶時可見殺細胞效果，但以未用Db126脈沖的EL-4細胞作為靶時，幾乎見不到殺細胞效果。
表1

E/T比 40∶1其次，將Killing分析中具有顯著殺細胞效果的脾細胞試樣用熒光標識的抗CD4抗體和抗CD8抗體染色，通過流式細胞測量法解析CD4和CD8的表達。
結果，如圖1所示，與非免疫對照細胞相比，用Db126肽進行免疫處理的脾細胞中，殺傷T細胞代表的CD8+細胞增加，CD8+細胞對于輔助T細胞等代表的CD4+細胞的比例反向增加。
實施例2如下所述配制來源于C57BL/6小鼠骨髓的分葉細胞(dendriticcells，DC)。按照常規(guī)方法，在GM-CSF存在下培養(yǎng)骨髓細胞，配制來源于骨髓的分葉細胞(J.Exp.Med.182，255，1995)。
將培養(yǎng)7天后的分葉細胞與10μM的OVAII(Ovalbumin II)以及1μM的Db126肽一同培養(yǎng)3小時后，洗凈。
其次，將上述DC細胞由皮內注射到C57B1/6小鼠的foot pads和hands上，第5日取出所屬淋巴結，配制細胞懸浮液。另一方面，配制用Db126肽脈沖、放射線照射的B7.1-RMA-S細胞(轉染編碼Co-stimulatory molecule——B7.1的基因的RMA-S細胞)。
其次，通過混合培養(yǎng)上述來源于淋巴結的細胞懸浮液和B7.1-RMA-S細胞，在體外進行再刺激。
其次，在體外進行再刺激的第5天，以51Cr標記的RMA-S細胞作為靶，進行Killing分析。以再刺激第5天回收的淋巴細胞總體的1/8用作效應細胞時作為最大E/T比(1.0)。
如圖2和圖3所示，用Db126肽免疫的來源于小鼠淋巴結的效應細胞殺死了用該肽脈沖的靶細胞，相反卻沒有殺死未用該肽脈沖的靶細胞。
另外，與實施例1同樣用流式細胞測量法解析CD4+細胞和CD8+細胞的比為CD4∶CD8＝1∶1.4～1.7，與非免疫小鼠細胞(對照)相比，用Db126肽免疫的小鼠細胞中CD8+細胞增加，CD4+細胞∶CD8+細胞的比(對照細胞中為約2∶1)在免疫的細胞中逆轉。
實施例3共同培養(yǎng)與肽Db126或WH187(40μg/ml)培養(yǎng)1小時后用放射線照射的T2細胞2×104個與具有HLA-A*0201的健康人末梢單核細胞1×106個。一周后，在上述共同培養(yǎng)體系中加入與肽(20μg/ml)培養(yǎng)1小時后用放射線照射的T2細胞，進行再刺激。第二天，在培養(yǎng)液中加入人IL-2(最終濃度100JRU/ml)。
以后，用肽脈沖后經(jīng)放射線照射的T2細胞反復刺激5次后，以肽被脈沖的T2細胞或肽未被脈沖的T2細胞作為靶，進行Killing分析。另外，對誘導的CTL的表面標識物進行FACS解析。
Killing分析按照常規(guī)方法以用Europium標記的T2細胞脈沖肽得到的物質作為靶進行。
Effector∶Target比(E/T比)為10∶1共同培養(yǎng)時間3小時培養(yǎng)液中的肽濃度5μg/ml結果如圖4所示。圖4中A表示用Db126肽誘導的CTL對Db126肽脈沖的T2細胞的殺細胞效果，圖4中B表示用WH187肽誘導的CTL對WH187脈沖的T2細胞的殺細胞效果。
在任何一種場合下，對于用肽脈沖的T2細胞均可見較強的殺細胞效果。
FACS解析的結果如圖5～10所示。圖5～7表示用Db126肽誘導的人CTL的結果，幾乎所有的細胞都為CD8陽性。圖8～圖10表示W(wǎng)H187肽誘導的人CTL的結果。CD4陽性細胞和CD8陽性細胞數(shù)目幾乎相同。
實施例4為了對Db126肽特異性CTL的細胞溶解活性的MHC限制性進行試驗，使用抗HLA-A2.1單克隆抗體以阻滯CTL對于用肽脈沖的T2細胞的細胞毒性活性。在E/T比為5∶1時，在對HLA-A2.1分子的阻滯單克隆抗體(BB7.2)存在下或不存在下，測定用Db126肽脈沖的T2細胞的特異性細胞溶解。
結果如圖11所示。該圖中符號*表示用抗H-2Kb單克隆抗體代替抗HLA-A2.1單克隆抗體的結果。如該圖說明的那樣，通過添加60μg/ml的抗HLA-A2.1單克隆抗體，細胞毒性下降至T2細胞的細胞溶解底數(shù)。同型的無關單克隆抗體(抗H-2Kb單克隆抗體Y3)對T2細胞的溶解沒有效果。
實施例5對于Db126肽特異性CTL是否能殺死先天表達WT1的HLA-A2.1陽性白血病細胞進行試驗。使用TF1細胞(表達WT-1，HLA-A2.1陽性)、JY細胞(不表達WT1，HLA-A2.1陽性)以及Molt-4細胞(表達WT1，HLA-A2.1陰性)作為靶細胞，在E∶T比為7.5∶1(a)或15∶1(b)時，測定細胞毒性。
結果如圖12所示。Db126肽特異性CTL對于先天表達WT1的HLA-A2.1陽性的白血病細胞TF1具有顯著的細胞毒性，但對于Molt-4(表達WT1，HLA-A2.1陰性)或JY細胞(不表達WT1，HLA-A2.1陽性)顯示底數(shù)水平的細胞溶解。
實施例6對于Db126肽特異性CTL是否能識別并溶解先天表達WT1的腫瘤細胞進行試驗。對于表達WT1的腫瘤細胞(FBL3)或不表達WT1的腫瘤細胞(RMA)(圖13)，或者轉染W(wǎng)T1基因的C1498細胞或未轉染W(wǎng)T1基因的C1498細胞(圖14)，以圖13和圖14所示E/T比測定特異性細胞溶解。
如圖13所示，Db126肽特異性CTL溶解先天表達WT1的FBL3細胞，不溶解不表達WT1的RMA細胞。而且如圖14所示，與不表達WT1的母C1498細胞相比，Db126肽特異性CTL可以殺死轉染小鼠WT1基因的C1498細胞。這樣，由于CTL引起的殺細胞可以確認靶向的分子確實是WT1肽。這些結果表明Db126肽特異性CTL可以通過WT1蛋白質的細胞內加工天然產生，而且可以識別WT1表達細胞的H-2Db分子上存在的Db126肽或有關的肽。
實施例7為了對CTL的細胞溶解活性是否為MHC限制性進行試驗，在I類H-2分子的抗體存在下進行測定。也就是說，在對H-2Kb(28.13.3S)、H-2Db(28.11.5S)或H-2Ld(MA143)的調整了效價的單克隆抗體存在下，測定Db126肽特異性CTL引起的對于用Db126肽脈沖的RMA-S細胞的細胞溶解活性。使用同型的單克隆抗體作為對照單克隆抗體。
結果如圖15所示。隨著H-2Db的抗體濃度增加，抑制CTL對于用Db126肽脈沖的RMA-S細胞的細胞溶解活性，但是H-2Kb或H-2Ld的抗體不抑制CTL的細胞溶解活性。這些結果表明CTL發(fā)揮H-2Db限制性細胞溶解活性。
實施例8對于Db126肽引起的積極免疫是否會導致生物體內腫瘤免疫進行試驗。用Db126肽脈沖的LPS活化脾細胞(圖16中的實線)、單純LPS活化脾細胞(網(wǎng)線)或單純磷酸緩沖液(PBS)(虛線)使小鼠1周免疫1次。進行3周的免疫后，在腹腔內注射3×107個FBL3白血病細胞。
結果如圖16所示。用Db126肽免疫的小鼠克服了腫瘤挑戰(zhàn)并生存下來，非免疫小鼠以及僅用LPS活化脾細胞免疫的小鼠不能拒絕腫瘤挑戰(zhàn)而死亡。免疫小鼠和非免疫小鼠兩者均在上述腹腔內接種腫瘤細胞后3天觀察到腹水。非免疫小鼠的腹水繼續(xù)增加，而且小鼠死亡。另一方面，免疫小鼠的腹水緩慢減少，小鼠完全拒絕腫瘤挑戰(zhàn)，并生存下來。非免疫小鼠時刻可以觀察到自然的退化(regression)。預測這種退化是特異性CTL對Friend白血病病毒(FBL3白血病細胞是由該病毒進行胞質轉移形成的)的自然誘導產生的。這是因為這種CTL誘導在C57BL/6小鼠中時刻可以觀察到。
實施例9 DNA疫苗給6～8周齡的C57BL/6小鼠每隔10天肌肉注射100μg表達WT1的質粒DNA(將小鼠WT1cDNA(Molecular and Cellular Biology，Vol.11，No.3，p.1701-1712(1991)，p.1709的左欄)的Sau 3AI片斷連接在CMV-IE啟動子上，制作持續(xù)表達WT1的質粒)(Proc.Natl.Acod.Su，USA.，92，11105-11109(1995))，共計3次。最后肌肉注射的10天后，取出小鼠的脾，調整脾細胞，與表達WT1的mWT1C1498細胞(40Gy放射線照射)在37℃下共同培養(yǎng)6天后，使用表達WT1的C1498(PM5G-mWT1)和不表達WT1的C1498(PM5G)作為靶細胞，進行Killing分析(用Europium標記)。另外，C1498是不表達WT1的小鼠骨髓性白血病細胞株。
誘導產生了細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，它可以殺死表達WT1的C1498(PM5G-mWT1)細胞，但不殺死不表達WT1的細胞。
結果如圖17所示。
作為對照，進行與上述相同的試驗，用不表達WT1(不具有WT1cDNA)的質粒代替表達WT1的質粒給小鼠肌肉注射。與上述試驗同樣采取脾細胞，用表達WT1的C1498(PM5G-mWT1)體外刺激后，進行killing分析。
如圖18所示，不具有WT1cDNA的對照質粒DNA的肌肉注射沒有誘導WT1蛋白特異性CTL。
上述結果證明本發(fā)明的肽確實發(fā)揮癌抗原的作用，誘導增殖針對癌細胞的殺傷T細胞(癌細胞傷害性T細胞)。因此，本發(fā)明的癌抗原肽作為針對伴有WT1基因表達上升的白血病和實體瘤的癌疫苗是有用的。
序列表<110>
<120>基于腫瘤抑制基因WT1的癌抗原<130>983279<160>8<210>1<211>449<212>PRT<213>小鼠<400>1Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala20 25 30Arg Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala35 40 45Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro50 55 60Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly65 70 75 80Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe85 90 95Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe115 120 125Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile130 135 140Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr145 150 155 160Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Gln His Ser Phe165 170 175Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln180 185 190Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser195 200 205Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp210 215 220Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln225 230 235 240Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser245 250 255Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu260 265 270Ser Glu Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile275 280 285His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser290 295 300Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys305 310 315 320Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro340 345 350Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp355 360 365Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln370 375 380Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr385 390 395 400His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys405 410 415Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val420 425 430Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala435 440 445Leu449<210>2<211>449<212>PRT<213>人<400>2Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro5 10 15Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala20 25 30Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr35 40 45
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<220>
<223>合成肽<400>3Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu1 5<210>4<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>4Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>5Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合在肽<400>6Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met1 5<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>7Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu1 5<210>8<211>9<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>合成肽<400>8Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val1 權利要求
1.一種癌疫苗，其中包含由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的7-30個毗鄰氨基酸組成的肽作為活性成分，該肽中包含結合MHC分子所需的錨定氨基酸，并可結合MHC分子。
2.權利要求1的癌疫苗，其中所述肽由SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的9個毗鄰氨基酸組成，并且其中第2位的氨基酸殘基是Leu或Met，第9位的氨基酸殘基是Val或Leu。
3.權利要求2的癌疫苗，其中所述肽是下述之一Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu(SEQ ID NO5)Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu(SEQ ID NO7)，和Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val(SEQ ID NO8)。
全文摘要
本發(fā)明涉及Wilms腫瘤癌抑制基因WT1的產物，以該氨基酸序列中包括與I類主要組織適合性抗原(MHC)結合的錨定氨基酸在內的連續(xù)7～30個氨基酸構成的肽作為有效成分的癌抗原，以及含有它們的癌疫苗。
文檔編號A61P35/00GK1762490SQ20051009951
公開日2006年4月26日 申請日期1999年7月30日 優(yōu)先權日1998年7月31日
發(fā)明者岡芳弘, 杉山治夫 申請人:杉山治夫