專利名稱：一種治療慢性肝病的復(fù)方中藥及制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療肝病的中藥領(lǐng)域，具體為一種治療慢性肝病的復(fù)方中藥及制劑。
背景技術(shù)：
慢性肝病是嚴(yán)重危害人們健康的常見病，常用的治療藥物有護(hù)肝片、乙肝靈、利肝隆、金牡蠣、板蘭根沖劑等多種中成藥，還有各種專利治肝中藥、偏方等，由于肝病是一種頑固的疾病，各種藥物的效果不一，目前常用的治肝藥物還是以西藥為主，但許多治肝西藥存在副作用較大、效果不穩(wěn)定且成本較高的不足。
阻斷和延緩肝纖維化的發(fā)展，是治療慢性肝病的重要方式，是國際肝病研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。目前，肝纖維化中醫(yī)基本病機(jī)屬血瘀、正虛兩方面的理論已基本達(dá)成共識。因此，抗肝纖維化的中醫(yī)藥研究主要在基本病機(jī)認(rèn)識基礎(chǔ)上針對中藥復(fù)方(經(jīng)驗(yàn)方，古典方)、單味中藥、探尋有效組分或單體成分展開。大量的研究結(jié)果雖然研究深度不一，但不同程度地證實(shí)了中藥抗肝纖維化的有效性。現(xiàn)階段抗肝纖維化方藥的立法組方主要集中在活血和補(bǔ)益兩大類的結(jié)合。少見將清熱解毒、舒肝解郁與活血補(bǔ)益相結(jié)合的組方。
見諸報(bào)道的有效方藥，除臨床使用的湯藥外，大部分的劑型為片劑和膠囊劑，該類劑型在治則上符合中醫(yī)治療慢性疾病的用藥習(xí)慣，但存在每次單劑量服用的生藥量不足的弊端。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種清熱解毒、舒肝解郁與活血補(bǔ)益相結(jié)合的組方治肝病藥物，包含葉下珠、馬鞭草在內(nèi)的12味肝病復(fù)方藥劑，單次服用劑量相當(dāng)于生藥5g以上，其對治療肝纖維化、慢性肝損傷有很好療效。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的一種治療慢性肝病的復(fù)方中藥及制劑，所述復(fù)方中藥及制劑所用的原料包括葉下珠、馬鞭草、苦參、白花蛇舌草、三七、丹參、桃仁、柴胡、熟地、人參、茯苓、甘草等12味中藥(藥材、炮制品、提取物)；其中12味中藥配比在1％-99％范圍按一定比例搭配，各味中藥所占比例在總量的2％-15％之間。復(fù)方中藥及制劑加工先將述12味荮材切段后，置于熱回流提取濃縮器中，提取至回流液無色，得濃縮液，過濾至澄清，超濾，噴霧干燥，干法制粒成每顆粒含生藥量10g的顆粒，包裝即得。
所述12味藥材或是炮制品、藥材提取物、中藥材與炮制品、中藥材與藥材提取物、藥材炮制品與藥材提取物等任意組合，其各種藥材的使用量在總藥物量的1％-99％間任意搭配，一般為2％-15％。
該復(fù)方中藥制作經(jīng)過提取、濃縮、干燥步驟，也可是不經(jīng)干燥步驟制備的固體或液體提取物，添加或不添加輔料，經(jīng)必要的制劑步驟制成不同的劑型。
所述提取步驟可采用常規(guī)的熱回流技術(shù)、微波提取技術(shù)、超聲波提取技術(shù)、二氧化碳超臨界萃取技術(shù)和低溫超微提取技術(shù)，一般常用低溫超微提取技術(shù)；提取時(shí)使用的溶媒可以是乙醇、水、丙酮等化學(xué)溶劑，常用一定濃度的乙醇水溶液或水，以盡量使中藥材中的有效成分被完整地提取出來，并保持與藥材物理化學(xué)性質(zhì)的同一性。
所述濃縮步驟可以采用蒸發(fā)濃縮、冷凍濃縮及膜濃縮，一般采用膜濃縮方式，同時(shí)在比較小的范圍內(nèi)控制提取液和濃縮液的溫度，溫度可控制在45℃以下，一般為15±5℃，以盡量保持提取液的物理、化學(xué)性質(zhì)，使?jié)饪s液與藥材的物理、化學(xué)性質(zhì)具有同一性。
濃縮前或濃縮后的精制方法，可采用各種沉淀法、酶解法、樹脂吸附法及多級膜過濾法，一般采用樹脂吸附法與多級膜過濾法的集成，使?jié)饪s液中的有效成分高度富集，其濃度應(yīng)達(dá)到與生藥比的為1∶(1～25)，一般為1∶8與1∶12間。
濃縮液可直接使用，如直接無菌灌封、制成合劑或糖漿劑、凝膠劑、注射液、大輸液等液體制劑或半固體制劑；也可干燥后使用，如制成片劑、膠囊劑、顆粒劑、粉針劑等固體制劑。
所述干燥步驟可采用烘干法、冷凍干燥法和各種噴霧干燥法，一般采用二流體或壓力式噴霧干燥法。
制劑加工過程中添加必要的輔料，輔料可以是各種淀粉類賦形劑如藥用淀粉、預(yù)膠化淀粉、糊精和麥芽糊精等，也可以是各種不含蔗糖的甜味劑如三氯蔗糖、羅漢果甜素、甜菊素、阿斯巴甜等。
該制劑常用的劑型是口服使用的合劑、糖漿劑和顆粒劑，最佳的劑型是口服顆粒劑，可以一次或分次溶于水中飲用或直接咀嚼吞服，以適應(yīng)不同類型肝纖維化的臨床治療方案。
本發(fā)明所述的治療慢性肝病的復(fù)方中藥及制劑，其在試驗(yàn)小鼠、大鼠肝損傷模型應(yīng)用中效果顯著，對治療人體肝病同樣具有很好的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。


圖1為Con A急性肝損傷模型小鼠肝組織光鏡下病理學(xué)觀察(×200)圖2為D-GalN急性肝損傷模型小鼠肝組織光鏡下病理學(xué)觀察(×200)圖3為大鼠肝組織學(xué)，V.G染色，(×200)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合列表和附圖具體說明實(shí)施例1按下列配比選取中草藥，葉下珠 12％ 馬鞭草 12％ 苦 參 10％ 白花蛇舌草 12％三 七 6％ 丹 參 12％ 桃 仁 10％ 柴 胡 6％熟 地 10％ 人 參 4％ 茯 苓 4％ 甘 草 2％
加工制法將以上12味中藥材切段，然后置于熱回流提取濃縮器中，提取至回流液無色，得濃縮液，過濾至澄清，超濾，噴霧干燥，干法制粒成每g顆粒含生藥量10g的顆粒，包裝即得。
所述的復(fù)方中藥及制劑可以是單劑量包裝的，也可以是多劑量包裝。復(fù)方中藥及其制劑為固體或半固體狀、也可以是液體狀態(tài)。使用時(shí)，復(fù)方中藥及其制劑可內(nèi)服、注射，也可以通過皮膚、粘膜滲透。
藥效學(xué)研究對刀豆蛋白A(Con A)致免疫性肝損傷和D-氨基半乳糖(D-GalN)致化學(xué)性肝損傷兩種動(dòng)物模型的保護(hù)作用1材料與方法1.1動(dòng)物NIH小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22g。
1.2藥物用時(shí)以蒸餾水配成所需濃度；聯(lián)苯雙酯滴丸，每丸含聯(lián)苯雙酯7.5mg，試驗(yàn)時(shí)以30g/L的二甲基亞砜溶解，再用蒸餾水稀釋至所需濃度；刀豆蛋白A(Con A)為美國華盛頓生物藥品公司產(chǎn)品；D-氨基半乳糖(D-GalN)由重慶醫(yī)科大學(xué)生化教研室生產(chǎn)，批號050326。
1.3主要試劑與儀器谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒；超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒。分光光度計(jì)；臺式冷凍離心機(jī)；顯微鏡。
1.4對Con A致小鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用60只NIH小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為正常對照組，模型組，本中藥復(fù)方高、中、低劑量組(分別相當(dāng)于10倍、5倍和2.5倍臨床用藥劑量)，聯(lián)苯雙酯(150mg/kg，相當(dāng)于40倍臨床用藥劑量)治療組；除正常對照組外，其他組小鼠于實(shí)驗(yàn)首日上午尾靜脈注射Con A20mg/kg，各給藥組于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃給藥1次，末次給藥后4h，模型組和各給藥組小鼠再次尾靜脈注射Con A20mg/kg，禁食不禁水，8h后摘眼球取血，分離血清待檢；斷頭處死動(dòng)物，取肝左葉組織，一部分用體積分?jǐn)?shù)為40％甲醛溶液固定，另一部分制成勻漿待檢。
1.5.對D-GalN致小鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用分組和劑量設(shè)計(jì)同1.4，各治療組小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)4天。末次給藥后1h，除正常對照組外，其余組小鼠均以D-GalN 800mg/Kg腹腔注射，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，分離血清待檢；斷頭處死動(dòng)物，取肝左葉組織，一部分用體積分?jǐn)?shù)為40％甲醛溶液固定，另一部分制成勻漿待檢。
1.6血漿ALT、AST活性檢測 采用賴氏法，按試劑盒說明操作，用752型紫外分光光度計(jì)于波長505nm處檢測吸光值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算成ALT、AST值。
1.7肝組織SOD活性測定 將肝組織制成100g/L勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，按試劑盒說明操作。
1.8病理組織學(xué)觀察 體積分?jǐn)?shù)為40％甲醛溶液固定肝組織，石蠟包埋切片，常規(guī)蘇木素伊紅(HE)染色，光鏡下觀察、拍照。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組計(jì)量資料分析采用One way ANOVA，多重比較采用LSD。
2.結(jié)果2.1對Con A致小鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用表1對Con A致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝組織SOD活性的影響(X±S)

**P＜0.01，與正常組比較；△△P＜0.01，與模型組比較(下同)
由表1可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常組明顯升高、肝組織SOD活性較正常組明顯降低，差異均具有顯著性意義(P＜0.01)。中藥高、中劑量組ALT、AST活性均明顯低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.01)，而與聯(lián)苯雙酯組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。中藥高、中劑量組肝組織中SOD的活性明顯高于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05)，但中劑量組與聯(lián)苯雙酯組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)。
肝組織病理學(xué)觀察光鏡下見正常組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇未見異常。模型組全部小鼠肝組織均出現(xiàn)明顯病變，小葉內(nèi)大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松化，有的呈氣球樣變，可見凋亡小體、明顯的點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，壞死灶可見大量炎性細(xì)胞浸潤；匯管區(qū)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞炎性浸潤尤為明顯，肝竇內(nèi)可見紅細(xì)胞瘀積。該復(fù)方高、中劑量組和聯(lián)苯雙酯組部分肝組織可見散在點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，肝細(xì)胞損傷程度明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤顯著減少(圖1)。
2.2對D-GalN致小鼠急性肝損傷模型的保護(hù)作用表2.對D-GalN所致肝損傷小鼠血清ALT，AST及肝組織SOD活性的影響(X±S)

由表2可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常組明顯升高、肝組織SOD活性較正常組明顯降低，差異均具有顯著性意義(P＜0.01)。中藥中劑量組血清ALT、AST活性降低、肝組織SOD活性升高，與模型組比較有顯著性差異(均P＜0.05或＜0.01)，與聯(lián)苯雙酯組比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。
肝臟病理組織學(xué)觀察光鏡下見正常組肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，無病理改變。模型組全部小鼠肝組織均出現(xiàn)病變，大多數(shù)肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞質(zhì)疏松化，有的呈氣球樣變，可見廣泛的肝細(xì)胞脂肪變性、點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，并出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤。復(fù)方高、中劑量組和聯(lián)苯雙酯治療組肝細(xì)胞變性、壞死程度顯著減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，肝組織病變明顯改善(圖2)。
對二甲基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化形成的抑制作用1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar雄性大鼠，體重150～180g由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號2004A068。
1.2藥物 二甲基亞硝胺。復(fù)方用時(shí)以蒸餾水配成所需濃度。秋水仙堿規(guī)格1mg/片，用時(shí)以生理鹽水溶解。
1.3主要試劑 羥脯胺酸(Hyp)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒。透明質(zhì)酸(HA)檢測試劑盒。
1.4主要儀器 臺式冷凍離心機(jī)；放免測量儀；全自動(dòng)生化檢測儀；分光光度計(jì)；倒置顯微鏡。
1.5動(dòng)物分組及造模給藥72只Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分為6組，每組12只，分別為正常組，模型組，中藥復(fù)方高劑量組、中劑量組和低劑量組(分別相當(dāng)于10倍、5倍和2.5倍臨床用藥劑量)，秋水仙堿治療組(0.2mg/kg)。除正常組外，其余各組動(dòng)物均進(jìn)行肝纖維化模型制備以0.5％DMN溶液(1∶199生理鹽水稀釋)按體重10mg/kg劑量腹腔注射，每周連續(xù)3天，每天1次，第1周每次用2/3劑量，以后用全量，共4周，在制備模型的同時(shí)，復(fù)方高、中、低劑量組和秋水仙堿治療組均灌胃給藥，每天1次，共四周，正常組和模型組均予等量生理鹽水灌胃。第四周末處死動(dòng)物，摘眼球取血，分離血清，待檢；取肝左葉組織，一部分制成勻漿待檢，一部分用10％甲醛溶液固定，送檢。
1.6血清肝功能及HA檢測采用全自動(dòng)生化儀檢測血清肝功能，放免法檢測血清HA。
1.7肝組織Hyp及MDA測定采用堿水解法檢測肝組織Hyp，采用硫代巴比妥酸比色法檢測肝組織MDA，按試劑盒說明操作。
1.8病理組織學(xué)觀察10％甲醛溶液固定肝組織，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色和V.G特殊染色，光鏡下觀察拍照，肝組織纖維化病變按嚴(yán)重程度分為五期(S0-4)①S0無病變。②S1匯管區(qū)、匯管區(qū)周圍纖維化，局限竇周或小葉內(nèi)纖維化，不影響小葉結(jié)構(gòu)的完整性。③S2匯管區(qū)周圍纖維化，纖維間隔形成，但小葉結(jié)構(gòu)大部仍保留。④S3大量纖維間隔，分隔并破壞肝小葉，致小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但尚無肝硬化。⑤S4早期肝硬化，肝實(shí)質(zhì)廣泛破壞，彌漫性纖維增生，被分隔的肝細(xì)胞團(tuán)呈不同程度的再生及假小葉形成。
1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS10.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組計(jì)量資料分析采用One way ANOVA，多重比較采用LSD。等級分組資料采用Ridit檢驗(yàn)。
2.結(jié)果2.1大鼠死亡數(shù)全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，模型組和秋水仙堿組大鼠各死亡2只，復(fù)方低劑量組死亡3只，共死亡7只，死亡多在造模第2周后發(fā)生。正常組、復(fù)方高、中劑量組均無大鼠死亡。
2.2復(fù)方對肝纖維化大鼠肝功能的影響表3.對肝纖維化大鼠肝功能的影響(X±SD)

注#P＜0.05，與正常組比較；*P＜0.05，與模型組比較；△P＜0.05，與秋水仙堿組比較。
由表3可知，模型組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)和直接膽紅素(DBIL)水平較正常組明顯升高，差異均具有顯著性意義(P＜0.05)。
中藥復(fù)方高、中、低劑量組AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL水平均明顯低于模型組，差異均有顯著性意義(P＜0.05)。
秋水仙堿組AST、GGT、TBIL水平均明顯低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
該中藥復(fù)方中劑量組AST、ALP、TBIL、DBIL水平均明顯低于秋水仙堿組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
該中藥復(fù)方中劑量組AST、ALP水平均明顯低于低劑量組，差異有顯著性意義(P＜0.05)；與高劑量組比較，ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL水平的差異均無顯著性意義(P＞0.05)。
2.對肝纖維化大鼠肝組織Hyp、MDA和血清HA含量的影響表4.對肝纖維化大鼠肝組織Hyp、MDA和血清HA含量的影響(X±SD)

注☆P＜0.01，與正常組比較；*P＜0.05，與模型組比較；△P＜0.01，與秋水仙堿組比較；●P＜0.05，與中劑量組比較；P＜0.01，與中劑量組比較。
由表4可知，模型組大鼠肝組織的Hyp、MDA和血清HA含量較正常組明顯升高，差異均具有顯著性意義(P＜0.01)。
該復(fù)方高、中、低劑量組和秋水仙堿組的Hyp含量均明顯低于模型組，差異有顯著性意義(P＜0.05)。
該復(fù)方中劑量組大鼠肝組織Hyp、MDA和血清HA含量均明顯低于模型組和低劑量組，差異均有顯著性意義(P＜0.05)；與秋水仙堿組比較，差異均有顯著性意義(P＜0.01)。
該復(fù)方中劑量組肝組織Hyp和MDA含量均明顯低于高劑量組，差異有顯著性意義(P＜0.01)。
2.4病理組織學(xué)觀察肝組織HE和V.G染色顯示，正常組大鼠肝細(xì)胞束排列整齊，呈單行放射狀排列在中央靜脈周圍，無肝細(xì)胞變性、壞死和纖維增生改變，肝竇無擴(kuò)張出血。模型組大鼠肝索排列紊亂，肝細(xì)胞空泡變性，可見大片肝細(xì)胞出血性壞死，在門脈區(qū)有大量的結(jié)締組織增生，膠原纖維增生明顯，有寬大的纖維間隔，向小葉內(nèi)伸展，形成假小葉，大部分大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，有少量的炎性細(xì)胞浸潤；中藥復(fù)方高、中、低劑量組肝細(xì)胞變性壞死較模型組明顯減輕，肝組織內(nèi)結(jié)締組織增生程度明顯減輕，膠原分布顯著減少，纖維間隔變細(xì)，尤以中劑量肝組織病變改善效果更為良好，肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，極少假小葉形成，膠原沉積明顯減少。
統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，該復(fù)方高、中、低劑量組肝組織纖維化病變明顯減輕，與模型組比較，差異均有顯著性意義(P＜0.01)。結(jié)果見表5，圖3(ABCDEF)。
表5.復(fù)方對實(shí)驗(yàn)大鼠肝組織纖維化病變的影響

ALT與AST均為肝細(xì)胞中非特異性細(xì)胞功能酶，ALT主要存在于肝細(xì)胞的非線粒體中，而80％的AST存在于線粒體中；在中等肝細(xì)胞損傷時(shí)，ALT漏出率遠(yuǎn)大于AST，因此ALT反映肝細(xì)胞損傷的靈敏度較AST高；但在嚴(yán)重慢性肝損傷時(shí)，線粒體破壞增加，可導(dǎo)致AST釋放增加，血清中AST活性升高，ALT/AST比值降低；而當(dāng)肝硬化形成時(shí)，ALT可正?；蜉p度升高[10]。本實(shí)驗(yàn)研究模型組大鼠處死后解剖見大鼠肝臟明顯縮小，質(zhì)地變硬，肝臟病變較各給藥組嚴(yán)重，且可見大量血性腹水，病理形態(tài)學(xué)檢查顯示肝組織纖維化病變程度大部分呈S3、S4，期，基本上已形成早期當(dāng)肝硬化，或肝硬化病變，表明模型組肝硬化病變的發(fā)展速度要較各給藥組快，肝實(shí)質(zhì)病理改變較各給藥組嚴(yán)重，但其血清ALT水平反而低于各給藥組，提示嚴(yán)重的肝組織纖維化病變應(yīng)以病理形態(tài)學(xué)診斷為主，并在早期進(jìn)行藥物干預(yù)治療，阻斷疾病發(fā)展進(jìn)程。
權(quán)利要求
1.一種治療慢性肝病的復(fù)方中藥及制劑，其特征在于復(fù)方中藥及制劑所用的加工原料包括葉下珠、馬鞭草、苦參、白花蛇舌草、三七、丹參、桃仁、柴胡、熟地、人參、茯苓、甘草等12味中藥(藥材、炮制品、提取物)；所述12味中藥配比在1％-99％范圍按一定比例搭配，各味中藥所占比例為總量的2％-15％之間。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的復(fù)方中藥及制劑，其特征在于復(fù)方中藥及制劑加工過程先將述12味荮材切段后，置于熱回流提取濃縮器中，提取至回流液無色，得濃縮液，過濾至澄清，超濾，噴霧干燥，干法制粒成每顆含生藥量10g的顆粒，包裝即得。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療肝病的中藥領(lǐng)域，具體為一種治療慢性肝病的復(fù)方中藥及制劑。其配料包含葉下珠、馬鞭草、苦參、白花蛇舌草、三七、丹參、桃仁、柴胡、熟地、人參、茯苓、甘草等12味中藥(藥材、炮制品、提取物)；其中12味中藥配比在1％－99％范圍按一定比例搭配，各味中藥所占比例在總量的2％－15％之間。其具有清熱解毒、舒肝解郁與活血補(bǔ)益的功效，對治療肝纖維化、慢性肝損傷有很好療效。
文檔編號A61K9/16GK1814049SQ200510101058
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者李長青, 宋力飛, 劉鄉(xiāng)鄉(xiāng) 申請人:廣州澤力醫(yī)藥科技有限公司