專利名稱：化合物ps－341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物PS-341在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用，尤其是涉及在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞性白血病是一類以具有t(9；22)染色體易位及其形成的BCR-ABL融合基因為特征的克隆性髓系造血干細(xì)胞疾病，粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板、B淋巴細(xì)胞均可受累，在部分病例T淋巴細(xì)胞也被累及。臨床癥狀包括乏力、發(fā)熱、消瘦、脾大等，自然病程可分為慢性期、加速期及急變期，隨著病程的演變對治療的耐藥性越來越嚴(yán)重。研究顯示，BCR-ABL融合蛋白的形成可導(dǎo)致ABL蛋白酪氨酸激酶活性的異常增高并引起細(xì)胞周期異常、凋亡抑制與白血病細(xì)胞的惡性增殖，因而是CML發(fā)病的基本原因。在動物實驗，BCR-ABL可引起小鼠發(fā)生CML。
治療上，羥基脲(hydroxyurea，Hu)、阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)等曾被廣泛應(yīng)用，而α干擾素(interferonα，IFNα)與Hu相比可使患者的生存期延長1-2年，并使帶有t(9；22)的細(xì)胞數(shù)減少；IFNα與Ara-C聯(lián)合應(yīng)用進一步改善了療效而一度被認(rèn)為是CML治療的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但是，以上療法均不能取得分子緩解，即BCR-ABL轉(zhuǎn)錄本的清除使之不能被聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測到。同種異體干細(xì)胞移植固然可使約26％的患者獲得長期的臨床緩解，但較高(約25％)的移植相關(guān)死亡率及高昂的費用又令不少病人望而卻步。近年來發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶活性抑制劑STI-571/Imatinib mesylate/Gleevec可占據(jù)BCR-ABL蛋白分子上的ATP結(jié)合位點，抑制ABL激酶活性，阻抑底物分子的磷酸化，從而抑制CML細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡與分化。Druker等用STI-571治療54例對IFNα無反應(yīng)或不能耐受IFNα治療的慢性期CML患者，結(jié)果53例(98％)獲得了血液學(xué)緩解，29例獲得了細(xì)胞遺傳學(xué)緩解。對出現(xiàn)原始細(xì)胞危象的CML病人，STI-571亦顯示出一定的療效。對初診慢性期病人，STI-571治療無論在誘導(dǎo)血液學(xué)/細(xì)胞遺傳學(xué)緩解、耐受性及控制病情進展等方面均較IFNα+Ara-C療法更有優(yōu)勢。但是，STI-571需長期服藥，而且價格昂貴；對加速期與急變期病人，STI-571雖可使病情獲得短暫緩解，但很快即可復(fù)發(fā)；即使對于慢性期病人，STI-571亦不能徹底清除異?？寺?。因而開發(fā)新的治療藥物進一步改善患者預(yù)后仍是一項迫切需要解決的研究課題。
化合物PS-341(化學(xué)名[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羰基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸)，分子式C19H25BN4O4，是美國千年制藥公司(MillenniumPharmaceuticals)開發(fā)的一種二肽硼酸衍生物，它作為一種蛋白酶體抑制劑使用，可強烈而可逆地抑制蛋白酶體的功能，目前主要制作為一種注射液用于多發(fā)性骨髓瘤的臨床治療。鑒于不同腫瘤其發(fā)病原因各不相同，蛋白酶體也有不同組分或亞單位，蛋白酶體抑制劑在不同腫瘤對不同亞單位的作用不一，PS-341對髓系白血病，特別是具有t(9；22)的CML有無治療作用，以何種原理治療以及有效治療的濃度，目前尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供化合物PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用。
PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用機制在于在分子水平上，PS-341活化凋亡效應(yīng)分子caspase-9、caspase-3，降解聚-ATP-核糖多聚酶(PARP)，而且降解/下調(diào)BCR-ABL融合蛋白，從而抑制具有t(9；22)染色體易位及其形成的BCR-ABL融合基因的克隆性髓系造血干細(xì)胞的增殖、生長、并誘導(dǎo)其凋亡。
本發(fā)明所述的化合物PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用，PS-341優(yōu)選的濃度為1×10-8～1×10-6M。
化合物PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用更優(yōu)選的濃度為1×10-8～1×10-7M。
化合物PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用最優(yōu)選的濃度為50nM。
化合物PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物時可與阿糖胞苷、羥基脲、干擾素、蛋白酪氨酸激酶抑制劑STI-571中的一種或多種聯(lián)合使用。
本發(fā)明是關(guān)于化合物PS-341新的醫(yī)學(xué)臨床用途。PS-341可活化凋亡效應(yīng)分子caspases，降解引起CML發(fā)病的BCR-ABL融合蛋白，應(yīng)用于制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中，作用機制不同于PS-341治療多發(fā)性骨髓瘤時對蛋白酶體的抑制作用，為CML病人提供在了新的治療藥物，具有劑量小，費用適中，用藥方便，療效顯著等優(yōu)點。與酪氨酸激酶活性抑制劑STI-571相比，PS-341對CML的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)更強，其IC50比STI-571對K562細(xì)胞的IC50值更小，因而臨床需要的用藥量較STI-571更?。辉谟盟幏绞缴?，PS-341可靜脈注射，更利于規(guī)則用藥與維持血藥濃度；在用藥時間上PS-341每周用二次，連用兩周，然后休息10天為一療程，共用8療程，而STI-571需要每天服藥，長期用藥，可使病人難于堅持，而且費用昂貴，故PS-341用于CML的治療更具優(yōu)勢。并且，由PS-341制備的藥物可用于CML慢性期、加速期和急變期的治療，為開發(fā)具有t(9；22)染色體易位的CML新療法奠定了基礎(chǔ)。


圖1是PS-341活化Caspase-9、降解PARP及BCR-ABL融合蛋白的作用示意圖。
圖2是PS-341對K562細(xì)胞的抑制率圖。
圖3是K562細(xì)胞在PS-341處理下的生長曲線圖。
圖4是K562細(xì)胞在PS-341處理后Annexin V的表達情況圖。其中，4a為對照，4b為K562細(xì)胞在50nM的PS-341處理48小時后的變化。
具體實施例方式
由化合物PS-341制備的藥物可活化凋亡效應(yīng)分子Caspases，降解/下調(diào)BCR-ABL融合蛋白，抑制具有t(9；22)染色體易位及其形成的BCR-ABL融合基因的克隆性髓系造血干細(xì)胞的增殖、生長、并誘導(dǎo)其凋亡。采用濃度為1×10-9～1×10-5M的PS-341(購自美國千年制藥公司)處理含有t(9；22)染色體易位的CML細(xì)胞株K562細(xì)胞，12～48小時后可引起K562細(xì)胞增殖抑制，生長抑制，并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。由PS-341制備的藥物可靜脈注射，每周給藥二次，連用兩周，然后休息10天為一療程，共用8療程。不需每天用藥，利于病人規(guī)則用藥，利于檢測病人血藥濃度，并可用于CML慢性期、加速期和急變期的治療。
實施例1用5～50nM濃度的PS-341處理K562細(xì)胞，作用12～24小時后收集細(xì)胞并用1×細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，然后用抗PARP抗體、抗caspase-9抗體、抗Abl抗體(均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品)進行Western blot免疫印跡實驗，發(fā)現(xiàn)PS-341處理可引起凋亡效應(yīng)分子Caspase-9活化、PARP裂解(說明caspase-3也被活化)，并且使BCR-ABL融合蛋白發(fā)生降解。如圖1所示，其中Actin蛋白作為對照。
實施例2用不同濃度的化合物PS-341(1×10-9～1×10-5M)處理K562細(xì)胞，44小時后加入含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)的CCK-8檢測試劑，再孵育4小時，然后用酶標(biāo)儀測定其在450nm的吸光值(OD450)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PS-341處理可明顯降低K562對WST-8的吸收，說明PS-341可明顯抑制K562細(xì)胞的增殖，抑制率與藥物濃度成正相關(guān)，見圖2。根據(jù)PS-341對K562細(xì)胞的生長抑制作用，我們計算出PS-341對K562細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(5±0.3)×10-8M。
實施例3用不同濃度(5nM～100nM)的PS-341處理K562細(xì)胞，分別在處理后12、24、36、48小時通過胎盼藍拒染法計數(shù)活細(xì)胞數(shù)并繪制K562細(xì)胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)PS-341可明顯抑制K562細(xì)胞生長，這種作用呈時間-劑量依賴性。其中，當(dāng)PS-341的濃度為50nM時，活細(xì)胞數(shù)隨著PS-341處理時間的延長而明顯降低，見圖3。
實施例4用不同濃度的PS-341(1×10-9～1×10-6M)處理K562細(xì)胞，分別在處理后12、24、36、48小時取細(xì)胞用瑞氏染液進行染色，并在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)PS-341處理可使K562細(xì)胞出現(xiàn)胞體變小、胞核濃縮/碎裂、出現(xiàn)凋亡小體、但胞膜完整的細(xì)胞凋亡特征。發(fā)生凋亡的細(xì)胞隨PS-341濃度的增大、處理時間的延長而增多。
實施例5用不同濃度的PS-341(1×10-9～1×10-6M)處理K562細(xì)胞，分別在處理后12、24、36、48小時取細(xì)胞用Annexin V(膜聯(lián)蛋白V)/碘化丙啶(PI)處理，然后用流式細(xì)胞儀檢測Annexin V陽性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PS-341處理可使K562細(xì)胞的Annexin V陽性率明顯增高，說明PS-341可誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。發(fā)生凋亡的細(xì)胞隨PS-341濃度的增大、處理時間的延長而增多。當(dāng)PS-341的濃度為50nM的時，Annexin V陽性率增高很明顯，如圖4所示，其中，4a為對照，4b為K562細(xì)胞在50nM的PS-341處理48小時后的變化。
化合物PS-341能強烈地抑制具有t(9；22)染色體易位及其形成的BCR-ABL融合基因的克隆性髓系造血干細(xì)胞的增殖、生長、并誘導(dǎo)其凋亡，且其濃度為50nM時效果最佳。
權(quán)利要求
1.化合物PS-341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物PS-341的應(yīng)用，其特征是PS-341的濃度為1×10-8～1×10-6M。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物PS-341的應(yīng)用，其特征是PS-341的濃度為1×10-8～1×10-7M。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物PS-341的應(yīng)用，其特征是PS-341的濃度為5×10-8M。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物PS-341的應(yīng)用，其特征是PS-341可與阿糖胞苷、羥基脲、干擾素、蛋白酪氨酸激酶抑制劑STI-571中的一種或多種聯(lián)合使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及化合物PS－341在制備治療慢性粒細(xì)胞性白血病的藥物中的應(yīng)用，其有效濃度為1×10
文檔編號A61K31/7068GK1820781SQ200510102190
公開日2006年8月23日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者周光飚, 胡政, 陳賽娟, 張鳳香 申請人:周光飚