專利名稱：溪黃草有效成分Nodosin的新用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及溪黃草有效成分Nodosin的用途，尤其涉及在制藥領域的用途。
背景技術：
近年來，器官移植手術正日益成為治療各種終末期病變的有效手段之一。據統計，截至2000年全球肝臟移植近9萬例，最長存活31年。這令人矚目的成績除了外科技術的日臻成熟外，半個多世紀來不斷推出的新型免疫抑制劑及臨床應用，對于解決移植物排斥反應、延長生存時間所起到的積極作用是不可磨滅的。由于抑制免疫耐受機制尚未能弄清，而器官克隆、干細胞移植到臨床實際應用尚需經歷漫長的道路，因此，器官移植后長期生存的獲得依然依賴免疫抑制藥物。但是，免疫抑制劑的長期乃至終生應用，引發(fā)了一系列的毒副作用，包括過敏反應、過度免疫抑制繼發(fā)感染及肝腎毒性、神經毒性等等，同時患者還需承擔高額的費用，這些都給移植受者帶來了十分不利的影響。因此，如何尋找高效低毒的免疫調節(jié)藥物是擺在器官移植臨床應用推廣面前的難題。
目前，有關中藥治療免疫性疾病取得良好療效的報道不斷出現。綜合研究結果發(fā)現中藥可以具備免疫調節(jié)效應，表現出整體調節(jié)、多環(huán)節(jié)多途徑的作用；并且毒副作用小，成本低，易于堅持長期服用。溪黃草系唇形科香茶菜屬植物溪黃草Isodon Serra的全草，早年見于1962年編印的《揭陽縣民間習用草藥簡編》，現作為中藥材廣泛使用，具有清熱利濕，涼血散瘀之功，用于治療癃閉，跌打閼腫等?，F代研究表明，從溪黃草能抑制二甲苯致小鼠耳部炎癥反應，曾用于治療急性肝炎。在中國專利申請?zhí)?004100410233，公開了一種消炎利膽新劑型及其制備方法。該藥物不能應用于器官移植綜合治療。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于(1)提供一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術后免疫調節(jié)藥物中的應用。
(2)提供一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術后抑制腫瘤生長藥物中的應用。
本發(fā)明的目的是通過以下技術方法來實現的細胞免疫是參與移植物排異反應的主要免疫應答方式，在異體抗原刺激下，T細胞致敏并增殖，發(fā)揮細胞毒作用，最終造成移植物失功。眾多的免疫抑制劑作用都體現在抑制T細胞增殖和/或增強T細胞凋亡方面。相反，一些能夠誘導T細胞增殖和/或抑制其凋亡的因素將導致移植物的急性排斥。本次研究的結果發(fā)現，Nodosin可以明顯抑制ConA抗原刺激下的T細胞增殖，且呈現濃度效應依賴性；進一步用流失細胞儀檢測發(fā)現，相比ConA刺激的狀態(tài)，Nodosin能夠誘導T細胞停滯于細胞周期的G1期，中高濃度下，DNA合成期(S期)和分裂期(G2/M期)的細胞比例數幾乎為零，絕大多數的細胞集中于G1期，無法進入分裂周期。提示Nodosin抑制T細胞增殖的機制在于誘導T細胞分裂周期的停滯；另外，值得注意的是我們選用了臨床常用的器官移植后免疫抑制劑FK506作為陽性對照，結果提示Nodosin對于細胞免疫的抑制作用類似于FK506，且呈現濃度效應依賴性，隨著濃度增加，中高濃度時作用等同于乃至強過后者。以上結果均說明，Nodosin具備類同于或強于現有免疫抑制劑的抑制細胞免疫的作用。
移植物浸潤淋巴細胞免疫調節(jié)作用的發(fā)揮還依賴于其分泌的多種細胞因子。不同細胞因子的輔助作用所誘發(fā)的機體免疫應答方向/類型是不同的，可分為誘導免疫激活(Th1方向)和誘導免疫耐受(Th2方向)兩種。其中，IL-2是最主要的Th1方向相關因子，它主要由致敏T細胞產生，與T細胞膜上特異性受體結合，反饋刺激T細胞增殖并分泌更多地IL-2，通過正性循環(huán)激活細胞免疫，導致排異反應發(fā)生。IL-10則相反，通過抑制巨噬細胞活化，抑制T細胞毒性，以致某些Th1方向反應等機制，減輕免疫排異反應，產生免疫耐受。有研究指出，Th2方向相關因子的過表達本身不能達到抑制后的免疫耐受，只有上調Th2與抑制Th1相結合才能達到在移植物位置的免疫耐受生存環(huán)境。而免疫耐受正是器官移植后首體免疫系統的理想狀態(tài)，既能不排異供體器官，又能對入侵機體的病毒、細菌乃至腫瘤細胞發(fā)揮防護作用。我們的結果提示，Nodosin既能夠降低IL-2的血清表達水平，同時不影響IL-10的表達，具備誘導機體免疫向Th2方向發(fā)展的可能性，進一步研究將從機制方面證實這一發(fā)明。
另外，雖然肝癌是肝移植的適應癥，但按照Milan標準，我國大部分肝癌患者都不能進入這個適應征。最主要是因為術后常規(guī)應用免疫抑制劑將造成腫瘤的復發(fā)，綜合治療中增強機體免疫防治腫瘤復發(fā)又將引發(fā)移植肝的排異反應，這些都將嚴重影響患者的長期生存。有報道術后復發(fā)導致3年生存率僅為20-30％，但與此相對應的卻是患者的需求很大，多家臨床肝移植中心的數據顯示臨床病例中仍有相當比例是肝癌肝移植。我們的研究結果發(fā)現Nodosin可以明顯抑制體外人腫瘤細胞的增殖和細胞集落形成。初步提示Nodosin在調節(jié)免疫的同時可以抑制腫瘤生長，說明在肝癌肝移植術后的綜合治療中存在潛在價值。
1、材料Nodosin的獲得來自溪黃草有效成分的萃取、分離和純化，通過篩選實驗證實其作用，并獲得其分子結構。Nodosin分子結構為 人體實體腫瘤細胞選擇胰腺癌細胞株，購自中科院上海分院細胞所細胞庫。Balb/c小鼠購自中科院上海實驗動物中心。IL-2、IL-10檢測ELISA試劑盒購自Sigma公司。MTT和二甲亞砜(DMSO)購自中科院實生公司。
2、調節(jié)機體免疫作用觀察體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞的刀豆蛋白A(ConA)增殖模型實驗小鼠脾淋巴細胞溶液，加入96孔細胞培養(yǎng)板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后取出細胞培養(yǎng)板。加入ConA100μl；對照組加培養(yǎng)基100μl；實驗組加梯度濃度的Nodosin(3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/m和25μg/ml)。于5％的CO2，37℃培養(yǎng)48h。MTT法繪制淋巴細胞的生長曲線，0.25％胰蛋白酶消化貼壁細胞；加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)基制備單細胞懸液(1×105)，接種96孔板培養(yǎng)過夜；各組取3瓶制成單細胞懸液，先后加MTT和DMSO后，振蕩10分鐘；酶標儀(Bio-Rad Model550，Microplate Reader)490nm波長下觀察光吸收值(OD值)。
體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞ConA刺激增殖實驗的細胞周期觀察ConA增殖模型實驗按照上述方法，實驗組Nodosin濃度為5.5μg/ml(低)，11μg/ml(中)，22μg/ml(高)三組，設不加ConA刺激的空白組。收集細胞，PBS洗滌，70％乙醇固定后PI染液染色，4℃避光30min上機。運用流式細胞儀(FACS Calibur，B.D公司)分析細胞周期，并應用B.D公司CELLQUEST軟件處理數據。
體內抑制小鼠二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏免疫反應實驗實驗動物小鼠隨機分為對照組、Nodosin低劑量組(6.52mg/kg)、Nodosin中劑量組(9.78mg/kg)、Nodosin高劑量組(13.04mg/kg)和FK506組(1mg/kg)。以棉花蘸取二甲苯，涂上在小鼠一側耳廓的正反兩側制備遲發(fā)型超敏反應模型，對側耳廓作對照。30分鐘后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，然后用打孔器于同一部位各取一個耳片稱重。腫脹度＝(致炎側耳片質量-對照耳片質量)/體重。
體內影響免疫反應模型動物IL-2、IL-10分泌實驗動物分組及造模按上述操作。斷頭取血，ELISA法測定IL-2、IL-10血清水平嚴格按照試劑盒說明書操作。
3、Nodosin對人胰腺癌細胞生長、細胞集落形成的影響細胞培養(yǎng)人胰腺癌細胞株常規(guī)用含體積分數15％小牛血清及1％青、鏈霉素的1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)，維持在37℃，5％CO2的濕培養(yǎng)箱內，細胞貼壁后，用胰蛋白酶消化后分瓶，按上述方法培養(yǎng)。噻唑藍比色法(MTT法)繪制胰腺癌細胞的生長曲線方法如上述。Nodosin梯度濃度為15μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml。
4、統計學分析采用t檢驗。p＜0.05為差異有顯著性。
本發(fā)明所公開溪黃草有效成分Nodosin的新用途，其優(yōu)點表現在(1)本發(fā)明對溪黃草有效成分Nodosin發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個新的應用領域。
(2)本發(fā)明的溪黃草有效成分Nodosin安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。
(3)Nodosin具備類同于或強于現有免疫抑制劑的抑制細胞免疫的作用。
(4)Nodosin在調節(jié)免疫的同時可以抑制腫瘤生長，說明在肝癌肝移植術后的綜合治療中存在潛在價值。
圖1顯示Nodosin影響ConA刺激增殖實驗中T細胞周期變化(G1期細胞比例比較)。
圖2顯示Nodosin影響ConA刺激增殖實驗中T細胞周期變化(S期細胞比例比較)。
圖3顯示Nodosin影響ConA刺激增殖實驗中T細胞周期變化(G2/M期細胞比例比較)。
圖4顯示Nodosin、FK506抑制二甲苯作用下小鼠的耳廓腫脹度*p＜0.05vs空白組；**p＜0.01vs空白組。
圖5顯示Nodosin、FK506調節(jié)模型動物的體液免疫*p＜0.05vs空白組。
圖6顯示Nodosin抑制癌細胞的體外生長。
圖7顯示Nodosin抑制癌細胞的體外集落形成。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例1Nodosin調節(jié)機體免疫作用觀察體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞的刀豆蛋白A(ConA)增殖模型實驗小鼠脾淋巴細胞溶液，加入96孔細胞培養(yǎng)板，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4h后取出細胞培養(yǎng)板。加入ConA100μl；對照組加培養(yǎng)基100μl；實驗組加梯度濃度的Nodosin(3.125μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/m和25μg/ml)。于5％的CO2，37℃培養(yǎng)48h。MTT法繪制淋巴細胞的生長曲線，0.25％胰蛋白酶消化貼壁細胞；加含15％小牛血清的1640培養(yǎng)基制備單細胞懸液(1×105)，接種96孔板培養(yǎng)過夜；各組取3瓶制成單細胞懸液，先后加MTT和DMSO后，振蕩10分鐘；酶標儀(Bio-Rad Model550，Microplate Reader)490nm波長下觀察光吸收值(OD值)。
體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞ConA刺激增殖實驗的細胞周期觀察ConA增殖模型實驗按照上述方法，實驗組Nodosin濃度為5.5μg/ml(低)，11μg/ml(中)，22μg/ml(高)三組，設不加ConA刺激的空白組。收集細胞，PBS洗滌，70％乙醇固定后PI染液染色，4℃避光30min上機。運用流式細胞儀(FACS Calibur，B.D公司)分析細胞周期，并應用B.D公司CELLQUEST軟件處理數據。
體內抑制小鼠二甲苯誘發(fā)遲發(fā)型超敏免疫反應實驗實驗動物小鼠隨機分為對照組、Nodosin低劑量組(6.52mg/kg)、Nodosin中劑量組(9.78mg/kg)、Nodosin高劑量組(13.04mg/kg)和FK506組(1mg/kg)。以棉花蘸取二甲苯，涂上在小鼠一側耳廓的正反兩側制備遲發(fā)型超敏反應模型，對側耳廓作對照。30分鐘后將小鼠脫頸處死，沿耳廓基線剪下兩耳，然后用打孔器于同一部位各取一個耳片稱重。腫脹度＝(致炎側耳片質量-對照耳片質量)/體重。
體內影響免疫反應模型動物IL-2、IL-10分泌實驗動物分組及造模按上述操作。斷頭取血，ELISA法測定IL-2、IL-10血清水平嚴格按照試劑盒說明書操作。
Nodosin能夠明顯抑制ConA刺激下的T淋巴細胞增殖，作用呈現濃度-效應依賴性。(見表1)
表1、Nodosin體外抑制原代培養(yǎng)小鼠脾臟淋巴細胞增殖(x±s)
**P＜0.01，vs ConA單純刺激組Nodosin抑制ConA刺激下T細胞的增殖，從細胞周期角度分析，Nodosin可以誘導T細胞G1期細胞比例上升，S期和G2/M期細胞比例下降，此效應成濃度依賴性(見圖1、2、3)。
二甲苯誘導的小鼠遲發(fā)型超敏免疫反應表現為受藥側耳廓的明顯腫脹。臨床常用免疫抑制藥物FK506可以明顯抑制這一效應，Nodosin也表現出同樣的效果，使小鼠耳廓腫脹度受到明顯抑制，且隨著低中高劑量的遞增，此效應逐步增強(見圖4)。同時，動物模型體內IL-2血清水平同樣受到FK506和Nodosin的抑制，IL-10血清水平沒有受到明顯的影響(見圖5)。比較兩種藥物，Nodosian的抑制作用與濃度有很強的相關性，隨著濃度增加，中高濃度時作用等同于乃至強過FK506。
實施例2
Nodosin對人胰腺癌細胞生長、細胞集落形成的影響細胞培養(yǎng)人胰腺癌細胞株常規(guī)用含體積分數15％小牛血清及1％青、鏈霉素的1640培養(yǎng)基(Gibco)培養(yǎng)，維持在37℃，5％CO2的濕培養(yǎng)箱內，細胞貼壁后，用胰蛋白酶消化后分瓶，按上述方法培養(yǎng)。噻唑藍比色法(MTT法)繪制胰腺癌細胞的生長曲線方法如上述。Nodosin梯度濃度為15μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml。
Nodosin能夠明顯抑制細胞株在體外的生長，在不到一天的時間內抑制體外癌細胞的集落形成。該作用呈現濃度效應依賴性。(見圖6、7)
權利要求
1.溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術后免疫調節(jié)藥物中的應用。
2.根據權利要求1的應用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療肝、胰腺移植術后免疫調節(jié)藥物中的應用。
3.根據權利要求2的應用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療胰腺移植術后免疫調節(jié)藥物中的應用。
4.溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術后抑制腫瘤生長藥物中的應用。
5.根據權利要求4的應用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療肝、胰腺移植術后抑制腫瘤生長藥物中的應用。
6.根據權利要求5的應用，溪黃草有效成分Nodosin在制備治療胰腺移植術后抑制腫瘤生長藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及溪黃草有效成分Nodosin的用途，尤其涉及在制藥領域的用途。本發(fā)明提供一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術后免疫調節(jié)藥物中的應用。又提供了一種溪黃草有效成分Nodosin在制備治療器官移植術后抑制腫瘤生長藥物中的應用。本發(fā)明的溪黃草有效成分Nodosin安全無毒，藥理作用強，預示著很好的藥用前景。
文檔編號A61P35/00GK1785178SQ20051011027
公開日2006年6月14日 申請日期2005年11月11日 優(yōu)先權日2005年11月11日
發(fā)明者李濟宇, 全志偉, 劉建文, 張艷 申請人:上海第二醫(yī)科大學附屬新華醫(yī)院