專利名稱：抑制Stat3基因表達的siRNA及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種siRNA，特別涉及一種抑制Stat3(signal transducer andantivator of transcription信號轉導及轉錄活化因子)基因表達的siRNA和及其制備方法。
背景技術：
RNAi(RNA interference)技術是近幾年發(fā)展起來的一種抑制基因表達的新方法，該方法是將功能未知基因編碼區(qū)(外顯子)或啟動子區(qū)，以反向重復的方式由同一啟動子控制表達，這樣在轉基因個體內轉錄出的RNA可形成dsRNA，產生RNA干擾，使目的基因沉默。這一現象已在植物、真菌(fungi)、錐蟲(trypanosome)、渦蟲(planaria)、囊蟲(hydra)、果蠅(drosoph ila)、線蟲(canenorhabdit is elegans)、斑馬魚(zeb rafish)、老鼠早期胚胎等不同種屬的生物體中得以發(fā)現。
RNAi的外源性或內源性的dsRNA在細胞內與一種RNA酶III(RNAase III核酸內切酶)--Dicer結合，隨即被切割成21～23nt的帶有3′端單鏈尾巴及磷酸化的5′端的短鏈dsRNA(double-stranded RNA)，是RNAi的起始誘導物，即siRNA(small interference RNA)。siRNA與Dicer形成RNA誘導沉默復合物(RNAinduces silencing comple，RISC)。siRNA作為引導序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉錄出的mRNA，并引導RICS結合mRNA。隨后siRNA與mRNA在復合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21～23nt的片段，特異性地抑制靶基因的表達。新產生的dsRNA片段可再次形成RISC，繼續(xù)降解mRNA，從而產生級聯放大效應。因此，每個細胞只需要幾個siRNA分子就能夠引起強烈的RNAi效應。此外，siRNA還可以在RNA依賴性RNA聚合酶(RNA dependent RNApolymerase，RdRp)的作用下進行大量擴增，并轉運出細胞，使RNAi擴散到整個機體并可以傳代。
目前RNAi技術已經廣泛用于基因功能、信號轉導通路方法以及腫瘤基因治療的研究領域。
RNAi識別可以精確到一個核苷酸，對由野生型點突變形成的癌基因如ras、p53等，能夠產生準確有效的封閉效果，野生型基因則不受影響，可以用于阻斷某些突變基因的表達，或者由蛋白過量表達引起的惡變。RNAi在腫瘤基因治療上與基因替代、反義寡核苷酸治療、細胞因子基因治療等傳統(tǒng)的基因治療方法相比，具有特異、高效、毒性小的特點，因此可用來對一些腫瘤進行治療。RNAi技術用于抑制腫瘤生長因子的表達，可以抑制動物模型的腫瘤生長，并已經應用于快速鑒別新的腫瘤靶目標。由于腫瘤是多基因、多因素疾病，單個癌基因的抑制往往很難達到治療效果，RNAi技術能夠同時抑制多個不同基因，而且抑制效果互不干擾。
RNAi對人類宮頸癌細胞Hela、非小細胞肺H1299、頭頸部鱗狀細胞癌C33、骨肉瘤U22OS、乳腺癌MCF27等細胞系實驗中腫瘤相關基因的抑制作用也很明顯。
siRNA的序列專一性非常嚴謹，與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果。
Stat(signal transducer and antivators of transcription)信號轉導及轉錄活化因子)是存在于細胞質中的一類潛在的信號轉導和轉錄激活因子。其蛋白家族有7個成員，Stat1，2，3，4，5a，5b，和6。其中的Stat3在細胞的增殖、分化、存活以及胚胎發(fā)育中都有非常重要的作用。Stat3信號通道的過度激活破壞了正常細胞的增殖、生存活動，能夠誘導出某些轉化細胞的特性；過表達的Stat3調節(jié)了細胞周期的控制和凋亡活動，表明Stat3的激活可能與致癌作用有關，阻斷Stat3信號通路有望能夠預防和治療人類腫瘤。因此利用上述的RNAi技術來阻斷Stat3信號通路可以預防和治療人類腫瘤。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種抑制Stat3基因表達的siRNA。它利用DNA介導的RNA干擾技術構建Stat3基因特異性的RNAi，用于觀察細胞內Stat3被特異性抑制的情況下表達及信號通路的變化，為從細胞系研究Stat3的功能提供了有效的工具，在研究和治療與Stat3相關的腫瘤領域有廣闊的應用前景。
本發(fā)明的另一目的是提供一種抑制Stat3基因表達的siRNA的制備方法。
本發(fā)明的上述目的可以通過如下措施實現設計抑制Stat3基因表達的雙鏈siRNA片段。Stat3 RNAi設計序列及其靶向NCBI網站Genbank數據庫小鼠Stat3基因(序列號為AY299489)位置分別為第一條(作用部位157-174) CTTTTTT＜3’第二條(作用部位1226-1243) CTTTTTT＜3’第三條(作用部位1936-1953) TTTTTT＜3’第四條(作用部位2334-2351) CTTTTTT＜3’本發(fā)明所述siRNA可以通過體外化學合成并在體內表達。
其中U6啟動子用于啟動下游DNA的轉錄，其轉錄起始位點是一個G(鳥嘌呤)，轉錄中止子為連續(xù)5-6個T(胸腺嘧啶)。編碼區(qū)DNA可以轉錄出具有特異序列的mRNA，該mRNA并不編碼可以翻譯的氨基酸，而是在細胞內自動形成一個帶有環(huán)的發(fā)卡式RNA，該發(fā)卡式RNA可以介導與其具有相同序列的mRNA的降解。
本發(fā)明含III型RNA聚合酶真核啟動子的載體為pBS/U6載體，編碼特異性抑制Stat3基因表達的siRNA的DNA片段。
本發(fā)明所述siRNA表達質粒的分子類型為環(huán)狀DNA，大小為3303bp。
本發(fā)明人致力與于抗腫瘤和基因工程研究，用多年積累的知識和經驗開展RNAi抗病毒治療研究。通過大量的研究和實驗證明，利用DNA介導的RNA干擾技術構建Stat3基因特異性的RNAi，可以用于觀察細胞內Stat3被特異性抑制的情況下表達及信號通路的變化，為本發(fā)明為從細胞系研究Stat3的功能提供了有效的工具，因此本發(fā)明被列為國家自然基金項目和重慶市人口與計劃生育委員會2004年第三批科研基金項目。
本發(fā)明采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)阻抑Stat3基因的表達。通過外源導入與內源基因同源的dsRNA(double-stranded RNA-即雙鏈RNA)來介導目標mRNA的降解，從而導致生物體內特異基因的沉默。RNA干擾通過關閉特異基因的表達在基因表達調控、缺陷識別及疾病基因的治療等方面顯出極為重要的應用價值。
本發(fā)明針對胚胎時期Stat3對細胞生長、存活和分化神經發(fā)育情況，針對小鼠Stat3的RNA干擾質粒可用于小鼠胚胎，設計出抑制Stat3基因表達的重組質粒pBS/U6-Stat3-RNAi。用siRNA作為引導序列，按照堿基互補原則識別靶基因轉錄出的mRNA，并引導RICS結合mRNA。隨后siRNA與mRNA在復合體中換位，核酸酶Dicer將mRNA切割成21～23nt的片段，特異性地抑制靶基因的表達。新產生的dsRNA片段可再次形成RISC，繼續(xù)降解mRNA，從而產生級聯放大效應，使Stat3的RNA干擾的效果明顯，幾乎可以完全抑制掉外源性的Stat3。
本發(fā)明使用最新發(fā)展起來的RNA干擾技術，直接從轉錄水平上降低Stat3基因mRNA的積累，并直接導致Stat3蛋白量積累的減少進而抑制Stat3信號通路。本發(fā)明相對用Stat3反義寡核苷酸，Stat3顯性負性蛋白Stat3β，Stat3上游特異性受體的拮抗劑以及受體中和抗體，或者天然存在的諸如SOCS和PIAS等蛋白抑制Stat3信號傳導通路治療腫瘤的技術和方法，操作更加方便，效果更加突出。


圖1為Stat3基因干擾質粒酶切鑒定電泳圖(陽性結果與陰性對照)；圖2為小干擾RNA抑制Stat3蛋白在293T細胞中的表達；圖3為RT-PCR檢測4種Stat3干擾質粒抑制Stat3在293T細胞中mRNA的表達；
圖4為免疫染色實驗小干擾RNA抑制Stat3蛋白在293T細胞中表達的劑量效應；圖5為免疫印跡實驗檢測Stat3干擾質粒抑制Stat3在293T細胞中蛋白表達的劑量效應；圖6為RT-PCR檢測Stat3干擾質粒抑制Stat3在293T細胞中mRNA表達的劑量效應；圖7為siRNA莖環(huán)結構簡單示意圖；圖8為pBS/U6-Stat3-RNAi(2334)質粒圖譜；具體實施方式
首先合成siRNA干擾序列，再進行RNAi載體的處理，將處理好的載體與處理好的dsRNA連接，然后轉化，挑選陽性克隆，提質粒，最后鑒定Stat3基因干擾質粒。
在構建的干擾質粒的陽性克隆的篩選上我們采用方便可行的雙酶切的陰性鑒定法。而對此質粒有效性的鑒定我們分別采用蛋白檢測水平的免疫印記實驗、mRNA檢測水平的半定量RT-PCR、鏡下結果直觀的免疫染色方法，并且加入了劑量效應的比較。從而清楚地看出構建質粒對Stat3基因的抑制效果。
其具體方法如下一.合成siRNA干擾序列合成基本原則為1.從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AGN18TT”(其中N是任意堿基)結構的長度為22bp的序列；A)避免在起始密碼子或無義區(qū)域選擇目的序列；B)序列的GC含量為30％-60％；C)由于5’和3’端的非編碼區(qū)(UTRs)有豐富的調控蛋白結構區(qū)域，這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNA核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果，因此設計時不針對5’和3’端的非編碼區(qū)(UTRs)；D)將挑選的序列和相應的基因組數據庫如人，小鼠，大鼠等進行比較，排除與其它編碼序列/EST同源的序列，例如使用BLAST；
F)選出合適的目標序列進行合成以找到最有效的siRNA序列；G)在正義鏈和反義鏈序列上不能連續(xù)出現3個或以上的T或A，否則可能導致siRNA轉錄的提前終止。
H)干擾序列末端核苷酸最好是C或T。
I)干擾序列盡量避免在目的基因的首末端。
2.克隆到siRNA表達載體中的DNA包括兩個短的反向重復序列，中間由環(huán)序列分隔，組成發(fā)夾結構，由polIII啟動子控制。隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子。
3.兩個互補的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點(本實驗選的是ApaI和EcoRI)。
4.在啟動子下游的酶切位點下方緊連著一個C，使插入片斷和啟動子有一定空間間隔以確保轉錄的發(fā)生。siRNA目的序列的第一個堿基必須是G以確保RNA聚合酶轉錄。如果不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加上一個G。
5.siRNA插入片段中的環(huán)結構應當靠近寡核苷酸的中央。環(huán)的大小和核苷酸序列可以不同，但在其內包含一個獨特的限制性酶切位點則利于檢測帶有siRNA插入片段的克隆。在比較了眾多不同長度和序列的環(huán)后發(fā)現5’TTCAAGAGA3’序列最為有效，因此我們采用這一序列作為環(huán)結構序列。
干擾序列確定后將得到的連接干擾序列正序片段和反序片斷的連接子，并且為了及時中止干擾序列的轉錄，在干擾序列末端加上polyT作為中止子，利用pBS/U6多克隆位點中可以使用的內切酶，選擇了ApaI和EcoRI作為插入位點，在寡核苷酸序列末端分別加上適當的與這兩種內切酶匹配的堿基。
根據以上原則，按GenBank中小鼠的Stat3全長序列，選擇了四條干擾序列。
針對Stat3設計的四對體內表達siRNA(短發(fā)卡RNA)的寡核苷酸序列為157位點正義鏈 TTTTG＜3’；反義鏈
GGCATGTGA＜3’；1226位點正義鏈 TTTTG＜3’；反義鏈 GCTTGAACT＜3’；1936位點正義鏈 TTTG＜3’；反義鏈 TTCAGCTG＜3’；2334位點正義鏈 TTTTG＜3’；反義鏈 CTGCAGCTT＜3’；方框中序列為環(huán)結構序列。
干擾序列的處理4條干擾序列由上海生工合成，均為2OD量(2管，1OD/管，1OD＝33μg)，將合成好的每條寡核苷酸sense和antisense均配成終濃度為250umol/L的溶液，然后將正義鏈和反義鏈各取100μl按1∶1比例兩兩混合均勻，置于盛有水的燒杯中煮沸10分鐘，然后于室溫自然冷卻，使寡核苷酸鏈退火，便可形成相應的雙鏈DNA。即得到pBS/U6載體中的插入片斷siRNA。
操作時可直接將siRNA片段加入酶聯反應體系中。這種結構可以在細胞中產生siRNA，其體內表達的siRNA如圖7所示。
二.RNAi載體的處理因為U6啟動子驅動的目的基因必須以鳥嘌呤開頭，而ApaI內切酶消化后產物3’末端恰好剩余一個鳥嘌呤，只需將互補鏈的5’粘末端切除，然后通過平端連接插入目標基因的干擾序列即可構建目標基因的干擾質粒，因此所用的pBS/U6載體是以pBlueScript為基礎插入U6啟動子和適當的多克隆位點構建而成的。所使用的pBS/U6載體為Sui G et al. A DNA vector-based RNAi technology tosuppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA 2002；995515-5520.中記載的載體。
RNAi載體的處理過程如下1、取pBS/U6載體2μg，用ApaI內切酶室溫消化過夜，確定酶切完全后，再切Klenow酶。酶切體系如下pBS/U62ugApaI1μlApaI buffer(10×)2μlddH2O15μl]]>合20μl2、經DNA回收后，取適量ApaI酶切處理后pBS/U6，組建下面Klenow酶切體系Digested pBS/U617μlKlenow(Large fragment)0.5μlKlenow buffer(10×)2μldNTP(10mmol)0.066μl]]>合20μl室溫消化30分鐘，確定酶切完全即可，將反應體系置于75攝氏度水浴中終止反應，然后將熱激后的反應體系放在冰上退火。
3、直接進行溶液體系DNA回收或膠回收溶液回收用的是NucleoTrap Gel Extraction Kit(從BD Biosciences購買)，按照廠家提供的實驗方法回收DNA。
4、將回收后DNA片段直接進行下游選取的內切酶進行酶切，本實驗選擇EcoRI酶，確定酶切完全即可，酶切體系為 37攝氏度水浴，2小時以上5、酶切產物再經過DNA電泳回收純化酶切完后，先取少量(如2μl)稀釋后跑DNA電泳，以判斷酶切是否完全。如還不完全則可延長酶切時間或增加酶量，如完全即可行下步。將酶切體系全部跑1％DNA膠，110V，20-30分鐘即可。紫外燈下看條帶。凝膠成像儀中觀察條帶大小是否正確，酶切完全與否。然后用刀切下DNA集中那塊。預先稱量一干凈EP管，再稱量加入切下的凝膠后重量，得到DNA膠的重量。
接著按照通常的實驗方法回收凝膠中的DNA。
至此pBS/U6載體處理完畢。
三.將處理好的pBS/U6載體與處理好的dsDNA連接處理后的pBS/U6載體與dsDNA連接的原則∶載體與dsDNA質量比為1∶20到1∶40。
使用Takara Biotech DNA Ligation Kit Ver.2試劑盒(從Takara公司購買).進行快速連接30分鐘以上，使連接充分。
可16攝氏度過夜放置。
四.轉化，挑選陽性克隆，提質粒將放置過夜連接的反應液10μl用通常的方法進行全部轉化。完成后將涂好的平板置于37攝氏度孵箱內16-20小時。平板應先正置，待菌液干后再倒置平板。16-20小時后觀察平板，見有菌落生長，由于是連接產物轉化，所以菌落不如質粒轉化生產的多。
挑單克隆，搖菌，37攝氏度，振搖，9-12小時，取出LB管，抽提質粒使用北京博大泰克生物基因技術公司的質粒小樣快速提取試劑盒，按照廠家提供的實驗方法提取質粒，其質粒的質粒圖譜見圖8。(以第四個序列構建而成的質粒為例)五.Stat3基因干擾質粒的鑒定在構建的干擾質粒的陽性克隆的篩選上我們采用的是雙酶切的陰性鑒定法。在干擾序列插入時選取的內切酶是ApaI和EcoRI，序列插入后將取代多克隆位點中ApaI和EcoRI之間的內切酶識別位點，分別是XhoI，SalI，HindIII和EcoRV。根據pBS/U6質粒圖譜可知，在U6啟動子前面有三個內切酶識別位點，分別是KpnI，XbaI和BamHI。所以任意選取一個U6啟動子前面的內切酶和其后可以被插入序列取代的內切酶進行雙酶切，干擾載體都將被單酶切，得到線性化干擾載體，而如果選用干擾序列不能取代的內切酶和啟動子前面的內切酶進行雙酶切，則應能切出連同U6啟動子和干擾序列一起的一個片斷，大小應比U6啟動子略大。若沒有干擾序列插入，則酶切結果應分別出現約300bp的U6啟動子和約3kb左右的pBlueScript骨架。
用了KpnI和EcoRV及KpnI和XhoI。鑒定結果如圖1所示。經過重復篩選，我們得到了4個陽性的干擾質粒。圖1中1-marker；2，3-pBS/U6空載體經雙酶切結果(作為陰性對照)；4，5-質粒pBS/U6-Stat3-RNAi經雙酶切的結果(陽性結果)。其中第2，4兩道為KpnI和EcoRV雙酶切，第3，5道為KpnI和XhoI雙酶切。在干擾序列插入時選取的內切酶是ApaI和EcoRI，序列插入后將取代多克隆位點中ApaI和EcoRI之間的內切酶識別位點，分別是XhoI，SalI，HindIII和EcoRV。根據pBS/U6質粒圖譜可知，在U6啟動子前面有三個內切酶識別位點，分別是KpnI，XbaI和BamHI。所以任意選取一個U6啟動子前面的內切酶和其后可以被插入序列取代的內切酶進行雙酶切，干擾載體都將被單酶切，得到線性化干擾載體，而如果選用干擾序列不能取代的內切酶和啟動子前面的內切酶進行雙酶切，則應能切出連同U6啟動子和干擾序列一起的一個片斷，大小應比U6啟動子略大。若沒有干擾序列插入，則酶切結果應分別出現約300bp的U6啟動子和約3kb左右的pBlueScript骨架。由此我們選用KpnI和EcoRV及KpnI和XhoI來鑒定干擾質粒的陽性克隆。
pBS/U6與insert成功連接后使EcoRV酶切位點消失，故KpnI和EcoRV雙酶切不能得到大小2條片段，而pBS/U6有EcoRV位點故雙酶切后可得到大小2條帶。XhoI酶切位點仍然存在，用KpnI和XhoI雙酶切pBS/U6可得約3kb大片段與350kbU6啟動子小片段。insert成功連接后使EcoRV酶切位點消失，故KpnI和EcoRV雙酶切不能得到大小2條片段，而pBS/U6有EcoRV位點故雙酶切后可得到大小2條帶。因此insert成功地克隆進pBS/U6載體得到了pBS/U6-STAT3-siRNA。
將構建好的質粒轉化DH5α菌株，用質粒小量提取試劑盒(購自QIAGEN公司)提取，可不用再純化。此質?？芍苯佑糜谵D染等實驗。
六.pBS/U6-Stat3-RNAi質粒的有效性的鑒定將構建的質粒轉染了人胚腎上皮細胞及小鼠黑色素瘤細胞，進行實驗。實驗部分，包括免疫印記實驗，免疫染色實驗，RT-PCR實驗等。
1、pBS/U6-Stat3-RNAi特異性地抑制細胞內小鼠Stat3基因蛋白的表達將mStat3-Flag表達質粒和4種pBS/U6-Stat3-RNAi質粒共同轉染293T細胞，通過免疫印跡分析Sat3在293T細胞中的表達情況，以研究構建的干擾質粒對小鼠Stat3表達的影響。參見圖2。圖2中1-Wild Type 293T；2-pBS/U6；3，4，5，6-依次為pBS/U6-Stat3-RNAi-I、II、III、IV。共轉染了干擾質粒pBS/U6-Stat3-RNAi后的細胞內Stat3蛋白表達量有不同程度地降低，將上排lane3、4、5、6與2比較，說明pBS/U6-Stat3-RNAi能不同程度地抑制細胞內Stat3基因的表達進而使蛋白合成量下降；其中靶向2334-2351位點的干擾質粒效果最好，幾乎把小鼠Stat3的表達降到了最低水平(上排lane6與lane1比較)，因為293T細胞中含有內源性的人源Stat3，而pBS/U6-Stat3-RNAi干擾質粒是小鼠Stat3序列特異的，不能干擾人源Stat3的表達，因此靶向2334-2351位點的干擾質粒幾乎把小鼠Stat3的表達全部抑制住了。同時GFP質粒共同轉染后，可以看到pBS/U6-Stat3-RNAi只抑制Stat3的表達，對EGFP蛋白的表達沒有任何影響(下排lane2、3、4、5、6相互比較)，這顯示了Stat3干擾質粒只特異性的抑制Stat3蛋白的表達而對其它基因的表達沒有任何影響，說明DNA介導的RNAi具有高度的專一性。中排β-actin的表達量顯示了我們每道的上樣量基本是一致的。
2、采用RT-PCR的技術半定量地檢測了小鼠Stat3基因在293T細胞中mRNA的水平，以進一步明確共轉染干擾質粒后小鼠Stat3在293T細胞中蛋白表達減少的原因。在轉染質粒36小時后，收取各組的293T細胞，提取細胞總RNA，以此為模板，采用小鼠Stat3基因特異性引物進行了PCR擴增，同時作為細胞總RNA取樣量的對照，平行的進行了β-actin基因的擴增。參見圖3。圖3中M-marker；Stat3組1-Wild Type 293T；2-pBS/U6；3，4，5，6-依次為pBS/U6-Stat3-RNAi-I，II，III，IV；β-actin組-每道上樣量一致。共轉染了干擾質粒的小鼠Stat3基因在293T細胞中mRNA的表達量明顯比共轉染了空載體質粒的實驗組降低了(lane3、4、5、6與2比較)，尤其靶向2334-2351位點的干擾質粒效果最好，這與免疫印記實驗的結果是一致的；另外，盡管第一道所用的野生型293T細胞總RNA模板中有人源Stat3基因的存在，但由于所設計的引物是小鼠Stat3基因特異性的，所以也不能擴增出任何條帶來。同樣的，下排β-actin條帶顯示RT-PCR擴增時的總RNA的取樣量是基本一致的。
3、pBS/U6-Stat3-RNAi抑制細胞內Stat3基因表達的劑量效應(1)免疫染色(Immunostainning)可以更直觀的觀察pBS/U6-Stat3-RNAi對Stat3基因表達的抑制作用。選擇效果最好的靶向2334-2351位點的干擾質粒進一步檢測對小鼠Stat3基因在293T細胞中的抑制作用。同時轉染了不同量的干擾質粒觀察這種抑制作用是否具有劑量效應。參見圖4。圖4中左邊一列(a，d，g，j，m，p)顯示了共轉染的GFP的表達；中間一列(b，e，h，k，n，q)顯示了免疫染色Stat3基因表達的結果；右邊一列(c，f，i，l，o，r)是左邊列和中間列Merge的結果。黃光表示了GFP和Stat3共同表達的情況。轉染Stat3干擾質粒與轉染空載體pBS/U6以及GFP特異性干擾質粒的細胞相比，Stat3蛋白的表達顯著的降低(圖4中h與b，e相比)，而且隨著干擾質粒轉染量的增加，Stat3的表達越來越低(從圖4-h到q)，而GFP的表達幾乎與對照組是相等的(圖4-g、j、m、p與a相比)。同時，GFP干擾質粒也能高效特異的抑制GFP基因的表達(圖4-d與a相比)，而對Stat3蛋白沒有沒有任何影響(圖4-e與b相比)。說明靶向小鼠Stat3的干擾質?？梢蕴禺愋缘囊种菩∈骃tat3的表達，而且呈現明顯的劑量效應。免疫染色結果直觀顯示了所構建的pBS/U6-Stat3-RNAi能夠在細胞水平高效且特異性地抑制Stat3蛋白的表達。
(2)免疫印跡實驗檢測不同劑量的干擾質粒對小鼠Stat3表達的影響。參見圖5。圖5中1-GFPi；2-pBS/U6；3，4，5，6-pBS/U6-Stat3-RNAi-IV的dose效應同免疫染色的結果相一致，隨著共轉染干擾質粒的量的增加，Stat3的表達量相比對照組降低了，并且呈現明顯的劑量效應(圖5上排中第3道到第6道)，同時pBS/U6-Stat3-RNAi對EGFP蛋白的表達無任何抑制作用(圖5下排中第3道到第6道與第2道比)。共轉染了GFP干擾質粒的細胞GFP的表達受到抑制(圖5下排中第1道與第2道比)，而Stat3蛋白沒有受到任何影響(圖5上排中第1道與第2道相比)。同樣的，中排β-actin的表達量顯示了我們每道的上樣量基本是一致的。
(3)采用半定量RT-PCR的實驗技術，進一步檢測不同劑量的干擾質粒對小鼠Stat3在293T細胞中mRNA表達的影響。把同一實驗組總RNA模板RT-PCR擴增出的Stat3與β-actin基因產物各自等量混到一起跑瓊脂糖凝膠電泳，參見圖6。圖6中1-pBS/U6；2-U6-GFPi；3-U6-Stat3-RNAi-IV(0.5ug)；4-U6-Stat3-RNAi-IV(1.0ug)；5-U6-Stat3-RNAi-IV(2.0ug)；6-U6-Stat3-RNAi-IV(3.0ug)。同免疫染色以及免疫印跡實驗的結果相一致，隨著共轉染干擾質粒的量的增加，Stat3的mRNA表達量相比對照組降低了，并且呈現明顯的劑量效應(圖6上排中第3道到第6道)，下排β-actin的條帶顯示RT-PCR擴增時的總RNA的取樣量是基本一致的。
本發(fā)明制備的pBS/U6-Stat3-RNAi質?？捎糜谝种颇[瘤生長因子的表達，抑制動物模型的腫瘤生長，并為應用于快速鑒別新的腫瘤靶目標提供了理論基礎，可以應用在治療腫瘤的臨床實驗和制備抗腫瘤藥物中。
序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學<120>抑制Stat3基因表達的siRNA及其制備方法<130>
<160>3303<170>BioEdit version 7.0.0<210>1<211>3303<212>DNA<213>人工序列<400>1ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctc60attttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccga120gatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactc180caacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacc240ctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggag300cccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaa360agcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccac420cacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcg480caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600taaaacgacggccagtgagcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtacccg660ctctagaactagtggatccgacgccgccatctctaggcccgcgccggccccctcgcacag720acttgtgggagaagctcggctactcccctgccccggttaatttgcatataatatttccta780gtaactatagaggcttaatgtgcgataaaagacagataatctgttctttttaatactagc840tacattttacatgataggcttggatttctataagagatacaaatactaaattattatttt900aaaaaacagcacaaaaggaaactcaccctaactgtaaagtaattgtgtgttttgagacta960taaatatcccttggagaaaagccttgtttgtcacatgccacgttggtgttcaagagacac1020caacgtggcatgtgacttttttgaattcctgcagcccgggggatccactagttctagagc1080ggccgccaccgcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgct1140tggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccac1200acaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaac1260tcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagc1320tgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccg1380cttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctc1440actcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgt1500gagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttcc1560ataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa1620acccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctc1680ctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtgg1740
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1.一種抑制Stat3基因表達的siRNA，其特征是包含下列四種siRNA的其中任一一種，它們的堿基序列如下第一條(作用部位157-174)5’＞TCACATGCCACGTTGGTG CACCAACGTGGCATGTGACTTTTTT＜3’第二條(作用部位1226-1243)5’＞AGTTCAAGCACCTGACCC GGGTCAGGTGCTTGAACTCTTTTTT＜3’第三條(作用部位1936-1953)5’＞CAGCTGAACAACATGTCA TGACATGTTGTTCAGCTGCTTTTTT＜3’第四條(作用部位2334-2351)5’＞AAGCTGCAGAGACGTGAC GTCACGTCTCTGCAGCTTCTTTTTT＜3’。
2.一種如權利要求1所述的抑制Stat3基因表達的siRNA的制備方法，其特征是所述siRNA可以通過體外化學合成并在體內表達。
3.根據權利要求2所述的siRNA的制備方法，其特征是體外化學合成包括以下步驟(1)從mRNA的AUG起始密碼開始，尋找“AGN18TT”，其中N是任意堿基，結構的長度為22bp的序列；(2)在正義鏈和反義鏈序列上不能連續(xù)出現3個或以上的T或A；(3)干擾序列避免在目的基因的首末端；(4)排除在起始密碼子或無義區(qū)域選擇目的序列；(5)選擇GC含量為30％-60％的序列；(6)挑選的序列在公共數據庫中進行同源性比較；(7)克隆到siRNA表達載體中的DNA包括兩個短的反向重復序列，中間由環(huán)序列分隔，環(huán)結構應當靠近寡核苷酸的中央，隨后再連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子；(8)干擾序列末端核苷酸是C或T；(9)兩個互補的寡核苷酸兩端須帶有限制性酶切位點；(10)siRNA目的序列的第一個堿基是G，若不以G開頭，必須在緊連正義鏈的上游加上一個G；(11)在啟動子下游的酶切位點下方緊連著一個C，使插入片斷和啟動子有一定空間間隔以確保轉錄的發(fā)生。
4.根據權利要求2所述的siRNA的制備方法，其特征是所述siRNA表達質粒包括含III型RNA聚合酶真核啟動子的載體；編碼特異性抑制Stat3基因表達的siRNA的DNA片段。
5.根據權利要求4所述的siRNA的制備方法，其特征是含III型RNA聚合酶真核啟動子的載體為pBS/U6。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制Stat3基因表達的siRNA及其制備方法。抑制Stat3基因表達的siRNA，該siRNA表達質粒包括pBS/U6載體；編碼特異性抑制Stat3基因表達的siRNA的DNA片段。本發(fā)明利用DNA介導的RNA干擾技術構建Stat3基因特異性的RNAi，用于觀察細胞內Stat3被特異性抑制的情況下信號通路的變化，從而為在細胞系中研究Stat3的功能提供了有效的工具，在治療與研究與Stat3相關的腫瘤領域中有廣闊的應用前景。
文檔編號A61P35/00GK1778918SQ20051011425
公開日2006年5月31日 申請日期2005年10月25日 優(yōu)先權日2005年7月1日
發(fā)明者星懿展, 李澤桂, 常智杰, 丁震宇, 李鐵石, 張原江 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學