專利名稱：超微通心絡(luò)中藥組合物及其新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超微通心絡(luò)中藥組合物及其幾種新用途，屬于中醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
冠狀動脈硬化性心臟病是指冠狀動脈壁形成斑塊，導(dǎo)致血管腔狹窄或阻塞引起心肌缺血、缺氧，與冠脈痙攣歸為缺血性心臟病范疇。
通心絡(luò)膠囊是吳以嶺教授研制發(fā)明并已獲得專利(ZL01131203.3)的治療心腦血管系統(tǒng)疾病的三類中成藥。吳以嶺教授首創(chuàng)運(yùn)用中醫(yī)絡(luò)病理論，探討冠心病的發(fā)病機(jī)理，并將全蝎、蜈蚣、土元、水蛭和蟬蛻等五種蟲類藥運(yùn)用于冠心病心絞痛的治療中，對于冠心病、心絞痛、腦血栓等疾病具有獨(dú)特的療效。通心絡(luò)膠囊組方由全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲、蟬蛻、人參、乳香、赤芍、降香、檀香、冰片和酸棗仁組成，其獨(dú)特在于集中應(yīng)用五種活血通絡(luò)和搜風(fēng)解痙蟲類藥全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻，在對冠心病、心絞痛尤其是變異性心絞痛的治療中體現(xiàn)出很好的療效。但是由于蟲類藥在開發(fā)與應(yīng)用中存在許多難點(diǎn)，如多數(shù)活性成分不完全明確，提取精制方法尚不成熟，缺乏對照品，所以在生產(chǎn)工藝中它們都采用傳統(tǒng)的直接粉碎法制成藥粉入藥。但是傳統(tǒng)的粉碎工藝存在1)不能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響藥材中有效成分的釋放和溶出需要穿過細(xì)胞膜；2)粉碎過程由于機(jī)械熱能影響，溫度可達(dá)80℃以上，對蟲類藥蛋白質(zhì)類有效成分的穩(wěn)定性造成負(fù)面影響；3)蟲類藥材不同部位的粉碎難易程度不同，因顆粒差異而引起混合不均勻的現(xiàn)象，影響產(chǎn)品質(zhì)量的均一性等問題。這些問題也直接影響到藥品藥效成分的穩(wěn)定性和人體的吸收，從而使得藥品療效下降。為此，發(fā)明人通過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究，對這些蟲類藥的粉碎工藝采用微粉化技術(shù)加以改進(jìn)，獲得超微藥粉，大大提高了療效，從而完成了本發(fā)明所述的超微通心絡(luò)中藥組合物，并已經(jīng)在先申請了制備工藝等內(nèi)容的專利，專利申請?zhí)枮?00410048292.2。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上提供超微通心絡(luò)中藥組合物的幾種新的臨床用途。
本專利是對已經(jīng)申請?jiān)谙鹊膶＠?申請?zhí)枮?00410048292.2)的進(jìn)一步改進(jìn)和描述，是在原專利內(nèi)容的基礎(chǔ)上，提供幾種新的臨床應(yīng)用，所以申請?zhí)?00410048292.2的專利內(nèi)容被全文引用于本發(fā)明，此處也不再描述該超微通心絡(luò)中藥組合物組分的用量特征及制備工藝，該部分內(nèi)容請參見申請?zhí)?00410048292.2的專利文本。
下面對本發(fā)明所涉及的內(nèi)容逐一進(jìn)行詳細(xì)說明。
我們經(jīng)過在大量的動物試驗(yàn)或臨床研究，終于發(fā)現(xiàn)超微通心絡(luò)中藥組合物具有以下的臨床新用途，并最終經(jīng)過科學(xué)試驗(yàn)得到證明，從而完成了本發(fā)明，其具體的新用途包括以下幾種1、超微粉通心絡(luò)可通過降低家兔實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化血清膽固醇，抗氧化等途徑，減輕動脈粥樣硬化后血管內(nèi)皮損傷，且作用優(yōu)于普通通心絡(luò)。
2、通心絡(luò)超微粉能顯著縮小AMI再灌注后無再流面積和梗死范圍，且作用優(yōu)于普通通心絡(luò)。
3、超微粉通心絡(luò)對5-HT誘導(dǎo)的豬冠脈痙攣有明顯的解痙作用，同時對IL-1包裹部位血管管腔狹窄也有明顯的抑制作用，而且作用較普通通心絡(luò)更強(qiáng)。
4、超微通心絡(luò)可通過抑制血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等途徑抑制高脂血癥及動脈粥樣硬化的發(fā)生，同時對已形成的動脈粥樣硬化有明顯的穩(wěn)定作用，而且超微粉通心絡(luò)作用明顯強(qiáng)于普通通心絡(luò)。
5、超微粉通心絡(luò)對高脂飲食合并血管成形術(shù)后血脂和血管管腔狹窄有明顯的改善作用，且作用明顯由于普通通心絡(luò)。
6、超微粉通心絡(luò)可明顯升高垂體后葉素致小鼠心肌和血漿NO下降和eNOS表達(dá)下降，且作用由于普通通心絡(luò)7、中藥通心絡(luò)超微粉可不同程度地降低梗死區(qū)與非梗死區(qū)膠原含量，降低心肌局部的Ang II水平，改善超微結(jié)構(gòu)的病理變化，可通過抑制心肌膠原的合成達(dá)到干預(yù)重構(gòu)的目的。
8、通心絡(luò)超微粉能有效改善MCAO大鼠的缺血損傷。
9、通心絡(luò)超微粉可通過促VEGF表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而保護(hù)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)毛細(xì)血管新生。
10、超微通心絡(luò)膠囊對II期內(nèi)痔、混合痔兩種類型痔瘡的臨床療效治療組與對照組強(qiáng)力痔靈片比較，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；對便血、疼痛、墜脹等癥狀的改善，治療組明顯優(yōu)于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
11、超微粉通心絡(luò)對月桂酸引起血栓閉塞性脈管炎有良好的預(yù)防及治療作用12、超微粉通心絡(luò)膠囊對家兔髂股動脈粥樣硬化閉塞癥有良好的治療作用13、超微通心絡(luò)可通過抑制血小板聚集從而有抗心肌缺血作用；超微粉通心絡(luò)對正常大鼠纖溶活性有一定程度提高；超微粉通心絡(luò)可明顯降低血瘀癥大鼠血漿粘度，增高其紅細(xì)胞變形能力。
14、超微粉碎通心絡(luò)在促進(jìn)脂質(zhì)調(diào)控基因PPARγ表達(dá)，尤其是在缺失CD1d蛋白的細(xì)胞中該基因的表達(dá)表現(xiàn)出現(xiàn)比普通通心絡(luò)更強(qiáng)的生物學(xué)活性。
具體實(shí)施例方式
下面通過具體的藥理或臨床實(shí)施例實(shí)驗(yàn)對本發(fā)明所提供的新用途予以進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)1通心絡(luò)超微粉對動脈粥樣硬化內(nèi)皮功能損害作用研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 觀察通心絡(luò)超微粉治療對動脈粥樣硬化(AS)血管內(nèi)皮功能的改變的影響，以評價通心絡(luò)超微粉對AS的治療作用。
動物模型的制備和分組 56健康雄性新西蘭白兔(體重2.5-3.0Kg)隨機(jī)分為兩組正常飲食組(普通飼料飼養(yǎng)，6只)，和高脂飲食組(高膽固醇高脂飼料喂養(yǎng)，5只)，8周后高脂飲食組成動脈粥樣硬化模型，再將它們隨機(jī)分為6組繼續(xù)高脂飲食組(10只)，普通通心絡(luò)組0.5g/kg，超微粉通心絡(luò)組(1、0.5、0.2g/kg)，共喂養(yǎng)12周。
指標(biāo)檢測血清總膽固醇濃度測定 于實(shí)驗(yàn)開始前，第8周，第12周兔耳中央動脈取血行血清總膽固醇測定。
血管內(nèi)皮功能的檢測 通心絡(luò)超微粉治療4周后所有家兔均經(jīng)氣體栓塞法處死，迅速取其胸主動脈作離體實(shí)驗(yàn)，觀察它們對不同濃度乙酰膽堿(Ach)的舒張反應(yīng)，以判斷內(nèi)皮功能。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下離體胸主動脈置于通以95％O2+5％CO2混合氣體的克氏液(NaCl 118，KCl 4.8，MgSO41.2，NaCO324，葡萄糖11，及依地酸0.03mol/L)中。清除血管周圍組織，沖洗血管內(nèi)血液，剪成長4～5mm血管環(huán)，沖洗血管內(nèi)血液，用不銹鋼鉤固定于含克氏液的浴槽，并通過張力換能器將血管收縮與舒張反應(yīng)記錄于二道生理記錄儀。設(shè)定靜息張力為3g，平衡120分鐘后，用苯腎上腺素(Phe 10-7mol/L)預(yù)收縮血管環(huán)，達(dá)坪值后分別用10-9～10-5mol/L Ach累加劑量舒張血管環(huán)，觀察Ach引起的內(nèi)皮依賴性血管舒張(EDR)反應(yīng)。血管環(huán)沖洗后平衡15min，再用苯腎上腺素收縮血管環(huán)，達(dá)坪值后分別用累加劑量的硝普鈉(SNP，10-8～10-6mol/L)舒張血管，觀察SNP引起的非內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。
胸主動脈丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、總NOS活性的檢測MDA、GSH-PX活力、總NOS活性測定試劑購自南京建成生物工程研究所。MDA應(yīng)用硫代巴比妥酸比色法測定，GSH-PX活力用二硫代二硝基苯甲酸比色法測定，總NOS活性用催化L-Arg法測定。數(shù)據(jù)處理11.0軟件包，所有數(shù)據(jù)均以X±SD表示，組間比較用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果血脂8周時高脂飲食組動物血脂水平顯著升高，而通心絡(luò)超微粉治療后血脂水平下降，超微粉高劑量顯著下降(見表1)。
表1 超微粉通心絡(luò)對家兔血膽固醇水平的變化

注與正常對照組比較*P＜0.01；與高脂飲食組比較##P＜0.01內(nèi)皮依賴性血管舒張反應(yīng)(EDR)高脂飲食組動物主動脈對不同濃度Ach的舒張反應(yīng)明顯減弱，而通心絡(luò)超微粉和氟伐他汀治療可改善高脂飲食動物的EDR。各組動物對硝普鈉的非內(nèi)皮依賴舒張反應(yīng)無顯著性差異。GSH-PX，MDA和NOS水平測定與高脂飲食組比較，通心絡(luò)超微粉組和普通通心絡(luò)組GSH-PX活性增高，MDA水平下降，NOS活性水平升高，與普通通心絡(luò)組比較，超微粉高劑量可明顯降低MDA含量，升高NOS水平見表2。
表2 超微粉通心絡(luò)對家兔胸主動脈GSH-PX/MDA和NOS水平的影響

注與正常對照組比較*P＜0.05；與高脂飲食組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與普通通心絡(luò)組比※P＜0.05。
分析綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，超微粉通心絡(luò)可通過降低家兔實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化血清膽固醇，抗氧化等途徑，減輕動脈粥樣硬化后血管內(nèi)皮損傷，且作用優(yōu)于普通通心絡(luò)。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)2超微粉通心絡(luò)對急性心肌梗死再灌注后無再流的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋狙芯繎?yīng)用MCE技術(shù)和病理學(xué)檢查評價通心絡(luò)超微粉對AMI再灌注后無再流的影響。
分組與給藥采用超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為0.05g生藥/Kg、0.2g生藥/Kg和0.5g生藥/Kg；采用普通通心絡(luò)膠囊劑D1，其給藥量為0.2g生藥/Kg；另設(shè)模型組對照組。
實(shí)驗(yàn)動物選用中華小型豬40只(購于農(nóng)業(yè)大學(xué))，雌雄不拘，體重30kg左右。
造模方法于豬胸骨正中打開胸腔，縱行切開心包膜，暴露心臟，并將心包膜縫合于胸壁呈吊籃狀，于冠狀動脈左前降支(LAD)遠(yuǎn)端1/3-1/2處，將結(jié)扎線穿入一長約3-4cm的硅膠管腔內(nèi)結(jié)扎3小時，再松解1小時建立AMI及再灌注模型。假手術(shù)組冠脈下只穿線，不結(jié)扎，無AMI，也無再灌注。
指標(biāo)檢測MCE檢查和圖像分析使用HP5500型超聲儀，置探頭于心臟表面的水囊中，取左心室短軸乳頭肌水平切面，于AMI前、AMI后3小時、再灌注1小時三個不同時間點(diǎn)行MCE檢查，從右側(cè)股靜脈以彈丸注射方式推注0.05ml/kg聲學(xué)造影劑SONOVUE(Bracco Inc.，Geneva，Switzerland)，用錄像帶(VCR)持續(xù)記錄自造影劑注射前30秒至心肌顯影消失的MCE圖像。圖像分析時，在超聲儀上回放MCE錄像，用描跡方法分別測量AMI3小時的左心室室壁心肌面積(LVWA)和無心肌顯影的灌注缺損區(qū)面積即結(jié)扎區(qū)心肌面積(Ligation area，LA)，兩者之比為結(jié)扎區(qū)心肌范圍(％LA)。同樣，測量再灌注60min的無心肌顯影灌注缺損區(qū)面積，即無再流區(qū)面積(Area of no-reflow，ANR)，ANR與LA之比為無再流范圍(％ANR)。病理下無再流及心梗面積的測定再灌注60min后，從左心室注入1ml/kg 4％的硫磺素(thioflavin-S)，使再灌注區(qū)著色，無再流區(qū)不著色；再于原位重新結(jié)扎前降支，從左心室再注入Evan’s藍(lán)，使結(jié)扎區(qū)外著藍(lán)色，結(jié)扎區(qū)不著藍(lán)色。立即取出心臟，并沿心臟長軸分為5～6心肌短軸切片，結(jié)果非結(jié)扎區(qū)心肌呈藍(lán)色，結(jié)扎區(qū)在熒光下無再流區(qū)不顯色，有再流處顯色。計(jì)算出左心室室壁心肌面積(LVWA)、結(jié)扎區(qū)(無藍(lán)色)心肌面積(Ligation area，LA)及無再流區(qū)(熒光下不顯色)面積(ANR)；同樣依LA/LVWA計(jì)算出結(jié)扎區(qū)心肌范圍(％LA)，依ANR/LA計(jì)算出心肌無再流心肌范圍(％ANR)。最后，將整個心肌切片放入1％的四氮唑紅(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)溶液(PH7.4)中，37℃孵箱中孵化15分鐘，梗死心肌不著色，非梗死部位心肌呈磚紅色，立即對切片進(jìn)行拍照，計(jì)算出梗死心肌面積(necrosis area，NA)，以NR與LA之比作為壞死心肌范圍(％NA)。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本研究所有資料均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，組間比較用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果通心絡(luò)超微粉對豬AMI再灌注后心肌無再流和梗死范圍的影響結(jié)果如下表所示，與模型組相比，大、中和小劑量通心絡(luò)超微粉組％LA均無顯著差異，但兩方法所測％ANR在小、中和大劑量組均顯著降低(P＜0.01)，且超微粉通心絡(luò)中、大劑量比普通通心絡(luò)組也顯著降低(P＜0.05)；％NA在小、中和大劑量組也顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，且超微粉通心絡(luò)中、大劑量比普通通心絡(luò)組也顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，提示通心絡(luò)超微粉能顯著縮小AMI再灌注后無再流面積和梗死范圍，且作用優(yōu)于普通通心絡(luò)。
表1 通心絡(luò)超微粉各組對豬AMI再灌注后心肌無再流范圍和壞死范圍的影響

注與對照組相比▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；與普通通心絡(luò)組相比#P＜0.05，##P＜0.01。LA％、ANR％和％NA分別代表結(jié)扎區(qū)心肌范圍(％)、無再流心肌范圍(％)和壞死心肌范圍(％)。分析通過以上實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超微粉通心絡(luò)對豬AMI再灌注后心肌無再流范圍和壞死范圍有明顯的減少，而且超微粉通心絡(luò)較普通通心絡(luò)作用明顯增強(qiáng)。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)3通心絡(luò)超微粉抑制IL-1β介導(dǎo)的小型家豬冠狀動脈痙攣的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑隗w觀察超微粉通心絡(luò)抑制豬冠狀動脈痙攣的作用。
分組與給藥將成功建立冠狀動脈痙攣模型的動物隨機(jī)分成模型對照組和處理組(分別包括采用超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為0.05g生藥/Kg、0.2g生藥/Kg和0.5g生藥/Kg；采用普通通心絡(luò)膠囊劑D1，其給藥量為0.2g生藥/Kg)共5組，連續(xù)喂養(yǎng)4周后停藥1周，進(jìn)行第二次造影。
冠狀動脈痙攣模型的建立動物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，均喂養(yǎng)專用顆粒飼料。
給予安定(1mg/kg)，鹽酸氯氨酮鎮(zhèn)靜(1.5mg/kg I.m.)，苯巴比妥鈉麻醉(30mg/kg i.v.)。耳緣靜脈建立靜脈通路，氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸。在無菌條件下，進(jìn)行左側(cè)開胸手術(shù)。選擇左前降支及回旋支近端管腔外徑近似相同的兩處節(jié)段進(jìn)行仔細(xì)分離，在血管外膜包裹吸附白細(xì)胞介素-1(IL-1β，2.5ug)的紙巾，然后關(guān)胸。術(shù)后，給予抗生素(青霉素80萬單位bid im)。
指標(biāo)檢測觀察局部冠狀動脈粥樣硬化情況及誘發(fā)痙攣情況手術(shù)后2周用上述同樣方法麻醉動物，選擇右頸動脈，在肝素化(10000U/頭)后，經(jīng)頸動脈插入6F鞘管，然后在X光下插入6F Judkin’s導(dǎo)管至冠脈開口處，取左前斜位(左前斜30°+頭位20°)，注入造影劑進(jìn)行冠狀動脈造影，觀察局部冠狀動脈粥樣硬化及狹窄情況，然后經(jīng)造影導(dǎo)管注入五羥色胺(10ug/kg)誘發(fā)冠狀動脈痙攣，并同時用電影血管造影系統(tǒng)連續(xù)記錄造影圖像。
觀察通心絡(luò)超微粉對冠狀動脈痙攣的作用模型對照組及通心絡(luò)超微粉組1動物進(jìn)行第二次造影，觀察通心絡(luò)超微粉對冠狀動脈粥樣硬化及痙攣的作用，記錄結(jié)果。
病理標(biāo)本采集造影結(jié)束后用致死劑量苯巴比妥(1500-2000mg)處死動物，放血摘除心臟。截取包裹紙巾的冠脈節(jié)段，分為三段，分別置于4％多聚甲醛中固定(用于光鏡檢測)。
病理檢查光鏡HE染色，觀察血管形態(tài)學(xué)變化，并采用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算管腔面積，內(nèi)彈力板包裹面積，外彈力板包裹面積。
數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS11.5軟件進(jìn)行分析處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)，組間比較計(jì)數(shù)資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用X2檢驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果冠狀動脈痙攣模型建立成功開胸手術(shù)后2周，冠狀動脈造影顯示，小型豬冠狀動脈局部血管發(fā)生動脈粥樣硬化性改變和不同程度的管腔狹窄(10-30％)，5-羥色胺能誘發(fā)其痙攣；各組誘發(fā)冠狀動脈痙攣情況模型對照組5(83％)血管段，5-羥色胺誘發(fā)痙攣陽性，1(17％)血管段，5-羥色胺誘發(fā)痙攣陰性；普通通心絡(luò)組3(50％)血管段，5-羥色胺誘發(fā)痙攣陽性；通心絡(luò)超微粉組高、中、低劑量組陽性率分別為1(17％)、2(33％)、3(50％)，結(jié)果表明通心絡(luò)各治療組陽性率顯著下降，表明通心絡(luò)有明顯解除5-羥色胺誘發(fā)冠脈痙攣的作用，而且超微粉通心絡(luò)活性顯著優(yōu)于普通通心絡(luò)。
病理學(xué)檢測模型對照組包裹吸附IL-1β紙巾處冠脈血管段管壁不光滑，內(nèi)膜增厚，管腔狹窄。通心絡(luò)超微粉組包裹吸附IL-1β紙巾處冠脈血管段內(nèi)膜增厚及管腔狹窄程度較對照組明顯減輕，超微粉大劑量與普通通心絡(luò)比較冠脈血管內(nèi)膜面積明顯減小。
表1 超微粉通心絡(luò)對豬冠脈管腔狹窄程度的影響(X±SD)


注與模型對照組比較*P＜0.05，**P＜0.05；與普通通心絡(luò)組比較#P＜0.05分析根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明超微粉通心絡(luò)對5-HT誘導(dǎo)的豬冠脈痙攣有明顯的解痙作用，同時對IL-1包裹部位血管管腔狹窄也有明顯的抑制作用，而且作用較普通通心絡(luò)更強(qiáng)。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)4超微粉通心絡(luò)膠囊穩(wěn)定易損斑塊的實(shí)驗(yàn)研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟捎弥鲃用}內(nèi)皮損傷聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)建立動脈粥樣硬化模型，觀察超微粉通心絡(luò)膠囊在穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)兔易損斑塊中的作用。
分組與給藥采用超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為1.2g生藥/Kg、0.6g生藥/Kg和0.3g生藥/Kg；采用普通通心絡(luò)膠囊劑D1，其給藥量為0.6g生藥/Kg；另設(shè)普通飲食喂養(yǎng)自然消退組，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)對照組。
實(shí)驗(yàn)動物雄性純種日本大耳白兔60只，體重2.0～2.5kg，購自北京科宇動物養(yǎng)殖中心，許可證號SCXK(京)2002-2005。
造模方法采用球囊損傷腹主動脈+高膽固醇飼料(1％膽固醇，每只喂養(yǎng)飼料120～140g.d-1)喂養(yǎng)8周的方法，建立穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊模型，12周后分別給予中國斑點(diǎn)蝰蛇毒(ChineseRussell’s viper venom，CRVV)以及組胺進(jìn)行藥物觸發(fā)(中國斑點(diǎn)蝰蛇毒(CRVV)0.15mg/kg腹膜下注射，30分鐘后耳緣靜脈注射組胺0.02mg/kg，處死動物前24h、48h兩次藥物觸發(fā))，以促使斑塊發(fā)生實(shí)驗(yàn)性破裂，觸發(fā)后處死。
指標(biāo)檢測血脂及纖維蛋白原(Fib)實(shí)驗(yàn)前兔禁食12h，耳緣靜脈取血，血清檢測血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)。
ELISA檢查藥物觸發(fā)前抽取兔耳緣靜脈血4ml，分離血清-80℃冰箱凍存，測定血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)的濃度。
血管內(nèi)超聲顯像檢查(IVUS)藥物觸發(fā)后進(jìn)行腹主動脈血管內(nèi)超聲檢查。實(shí)驗(yàn)兔仰臥位固定，3％戊巴比妥鈉麻醉后，穿刺左股動脈，插入鞘管，固定，立即靜脈給予肝素抗凝，插入血管內(nèi)超聲探頭導(dǎo)管，通過狹窄病變至血管遠(yuǎn)端，然后緩慢回撤探頭導(dǎo)管，標(biāo)記斑塊遠(yuǎn)端、近端圖像，測量斑塊破裂率。
病理檢查分別測量三組動物斑塊破裂的發(fā)生率、斑塊纖維帽厚度、內(nèi)-中膜厚度(IMT)。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，資料均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果血脂結(jié)果如表1所示，與高脂對照組比較，普通通心絡(luò)膠囊TC、TG和LDL明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，超微粉通心絡(luò)膠囊TC、TG和LDL亦均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，但作用明顯強(qiáng)于普通通心絡(luò)組，且高劑量對HDL有明顯升高作用(P＜0.05)。
表1 超微粉通心絡(luò)對兔血脂水平的影響(X±SD)

注與高脂對照組比較*P＜0.05，**P＜0.05；與普通通心絡(luò)組比較#P＜0.05血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)結(jié)果如表2所示，與高脂對照組比較，普通通心絡(luò)膠囊hs-CRP明顯降低(P＜0.01)，超微粉通心絡(luò)膠囊hs-CRP亦均明顯降低(P＜0.01)，但與普通通心絡(luò)組比較，超微粉通心絡(luò)高劑量組明顯降低，表明超微粉通心絡(luò)作用趨勢更強(qiáng)。
表2 超微粉通心絡(luò)對兔Hs-CRP的影響(X±SD)

注與高脂對照組比較*P＜0.05，**P＜0.05；與普通通心絡(luò)組比較#P＜0.05腹主動脈斑塊的破裂率藥物觸發(fā)后、高脂對照組死亡2只、斑塊破裂2只；普通通心絡(luò)破裂一只，余各組未見斑塊破裂。表明超微粉通心絡(luò)組對斑塊有明顯的穩(wěn)定作用。
病理檢查各項(xiàng)指標(biāo)的染色陽性信號均為細(xì)胞漿內(nèi)的棕褐色顆粒。與高脂對照組比較，油紅O染色陽性顯著降低顯著降低，各組無顯著性差異。與高脂對照組比較，通心絡(luò)各組腹主動脈斑塊纖維帽的厚度顯著增加(P＜0.05或P＜0.01)，且超微粉通心絡(luò)與普通通心絡(luò)比較腹主動脈斑決纖維帽顯著增厚，各組內(nèi)-中膜厚度(IMT)厚度顯著減低(P＜0.05)，組間無顯著性差異(表3)。
表3 超微粉通心絡(luò)對兔腹主動脈斑塊厚度的影響(X±SD)

分析綜合以上實(shí)驗(yàn)分析通心絡(luò)可通過抑制血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等途徑抑制高脂血癥及動脈粥樣硬化的發(fā)生，同時對已形成的動脈粥樣硬化有明顯的穩(wěn)定作用，而且超微粉通心絡(luò)作用明顯強(qiáng)于普通通心絡(luò)。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)5超微粉通心絡(luò)對血管成形術(shù)后MAPK表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)對血管成形術(shù)后內(nèi)膜增殖中MAPK表達(dá)的影響。
給藥與分組采用高膽固醇喂養(yǎng)加兩次動脈拉傷的方法。日本大耳白兔60只，體重2.5±0.5kg，月齡6-8個月，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供，單籠、恒溫、恒濕度飼養(yǎng)，在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組單純拉傷組，高脂拉傷組，普通通心絡(luò)0.2g/kg組，超微粉通心絡(luò)高、中、低劑量組(1、0.5、0.2g/kg)，每組各10只。單純拉傷組只喂普通飼料；高脂拉傷組喂普通飼料加膽固醇(1.5g/kg/d)8周，于血管成形術(shù)后停用膽固醇，只喂普通飼料；通心絡(luò)干預(yù)組喂普通飼料加膽固醇(1.5g/kg/d)8周，于血管成形術(shù)后停用膽固醇，加用通心絡(luò)4周。
造模方法所有動物于喂養(yǎng)4周時經(jīng)1側(cè)腹動脈用3.5-4.0mm的球囊進(jìn)行腹主動脈內(nèi)皮剝脫，至喂養(yǎng)8周時經(jīng)另1側(cè)腹主動脈在X光下行腹主動脈造影，對造影顯示狹窄超過30％的部位用3.5-4.0mm的帶導(dǎo)絲球囊進(jìn)行球囊擴(kuò)張，壓力為8-12kPa，擴(kuò)張3次，每次30秒間隔1分鐘。
標(biāo)本采集和檢測血生化標(biāo)本的采集與測定在高膽固醇喂養(yǎng)前(0周)，動脈拉傷術(shù)前(4周)，血管成形術(shù)前(8周)及處死前(12周)，分別從耳緣靜脈采血測定血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)及內(nèi)皮素(ET)和一氧化氮(NO)。血脂測定使用北京中山生物技術(shù)有限公司試劑盒，日立7060型全自動生化儀檢測；ET使用北京東亞免疫研究所試劑盒，由中國醫(yī)科大學(xué)同位素中心實(shí)驗(yàn)室測定；NO使用南京建成生物有限公司試劑盒，采用分光光度法，由中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室測定。
動物處死及標(biāo)本采集動物氣栓處死，4％多聚甲醛原位血管內(nèi)膜灌流固定，根據(jù)X光照片留取血管成形術(shù)部位血管做標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)檢測。
血管形態(tài)學(xué)檢測病變血管標(biāo)本固定后經(jīng)梯度酒精脫水，透明，石蠟包埋，制成蠟塊，切片5μm厚。HE染色后分組行計(jì)算機(jī)圖像分析，測定管腔面積(LA)、內(nèi)彈力極包繞面積(IEA)、外彈力極包繞面(EEA)，再計(jì)算出內(nèi)膜面積(NIA)＝IEA-LA，中膜面積(MA)＝EEA-IEA。MAPK(ERK1，ERK2)的免疫組化染色石蠟切片，采用標(biāo)準(zhǔn)SABC法，DAB顯色，抗體購自SantaCruz USA，試劑盒為北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，染色后利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測定陽性細(xì)胞面積的百分比。
數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，組間比較采用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果血脂水平的變化與單純拉傷相比，高脂拉傷組和通心絡(luò)超微粉組TC、LDL-C、TG明顯升高；8周時超微粉大劑量組比高脂拉傷組LDL-C明顯降低；12周時，通心絡(luò)各組TC、LDL-C較高脂拉傷組明顯下降(P＜0.05)，且超微粉高劑量較普通通心絡(luò)有顯著差異(P＜0.05)。見表1。
表1 各組血脂水平變化(X±SD，mmol/L)


注*與單純拉傷組相比P＜0.05；△與高脂拉傷組相比P＜0.05；#與普通通心絡(luò)組比P＜0.05ET和NO水平的變化與單純拉傷組相比，高脂拉傷組和通心絡(luò)組ET水平0周、4周、8周呈逐漸升高趨勢，兩組間無明顯差異；到12周時通心絡(luò)組ET水平下降與高脂拉傷組相比差異顯著(P＜0.05)；而NO水平，與單純拉傷組相比，高脂拉傷組和通心絡(luò)超微粉組NO水平均呈下降趨勢，8周時超微粉組與高脂拉傷組和普通通心絡(luò)比較均出現(xiàn)顯著性差異，至12周時通心絡(luò)組NO水平則明顯升高過高脂拉傷組差異顯著(P＜0.05)，超微粉組增加趨勢稍顯明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。
表2 各組ET和NO水平變化(X±SD)

注*與單純拉傷組相比P＜0.05；△與高脂拉傷組相比P＜0.05；#與普通通心絡(luò)組比P＜0.05血管形態(tài)學(xué)測定結(jié)果與高脂拉傷組比較，通心絡(luò)各組管腔面積(LA)均增大，中膜面積減小，且超微粉高劑量組較普通通心絡(luò)組減小更明顯(P＜0.05)。
表3 血管形態(tài)學(xué)測量結(jié)果(X±SD，mm2)

注*與單純拉傷組相比P＜0.05；△與高脂拉傷組相比P＜0.05；#與普通通心絡(luò)組比P＜0.05MAPK(ERK1、ERK2)的免疫組化結(jié)果ERK1及ERK2主要為胞漿陽性，陽性細(xì)胞主要集中在內(nèi)膜和內(nèi)彈力板區(qū)域，單純拉傷組陽性細(xì)胞很少，散布于內(nèi)膜，陽性細(xì)胞面積為20.67±1.38mm2(ERK1)和19.55±1.19mm2(ERK2)而高脂拉傷組陽性細(xì)胞密度較高，密布于內(nèi)膜和內(nèi)彈力板周圍區(qū)域，陽性細(xì)胞面積為35.93±2.99mm2(ERK1)和38.553.57mm2(ERK2)；通心絡(luò)超微粉各組陽性細(xì)胞多于單純拉傷組但明顯少于高脂拉傷組，陽性細(xì)胞主要分布在內(nèi)彈力板區(qū)域，陽性細(xì)胞面積為明顯減小，與高脂拉傷組相比差異顯著(P＜0.05)。
分析從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，超微粉通心絡(luò)對高脂飲食合并血管成形術(shù)后血脂和血管管腔狹窄有明顯的改善作用，且作用明顯由于普通通心絡(luò)，其機(jī)制可能與保護(hù)血管內(nèi)皮，降低血清ET升高內(nèi)皮NO分泌，及抑制血管MAPK表達(dá)有關(guān)。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)6超微粉通心絡(luò)對缺血心肌NO的影響研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)對缺血心肌NO的水平和eNOS的表達(dá)，進(jìn)一步探討通心絡(luò)超微粉抗心肌缺血的機(jī)制。
分組與給藥正常對照組、單純心肌缺血組(模型組)、普通通心絡(luò)0.30g/kg組、超微粉通心絡(luò)高、中、低劑量組(0.15、0.30、0.60g/kg)。各劑量組每天灌胃1次，正常對照組及單純心肌缺血組每日給予相同體積蒸餾水，連續(xù)5天。
實(shí)驗(yàn)動物普通級昆明種小鼠，體重22±2g，雄性，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
檢測指標(biāo)及方法模型及各用藥組小鼠在第五天灌胃30分鐘后腹腔注射垂體后葉素(劑量0.6u/20g體重)，正常對照組第五日腹腔注射等體積生理鹽水，30min后五組動物處死取血漿及心肌組織檢測以下指標(biāo)用酶法檢測心肌組織及血漿NO含量(檢測試劑盒購于深圳晶美生物工程有限公司)，使用免疫組化的方法檢測心肌組織eNOS活性(博士德公司試劑盒)。
免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)終止時，取心肌放入4％多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，然后按SABC免疫組化試劑盒進(jìn)行操作，最后封片于光鏡下觀察，并隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行灰度測定。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。組間比較運(yùn)用單因素方差分析檢驗(yàn)，各統(tǒng)計(jì)資料均用SPSS8.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果超微粉通心絡(luò)對心肌缺血小鼠血漿、心肌組織NO(一氧化氮)水平的影響與正常組相比，心肌缺血模型組血漿、心肌組織NO水平顯著下降(P＜0.01)，普通通心絡(luò)組和超微粉通心絡(luò)高、中、低三個劑量組均可以顯著提高血漿及心肌組織中NO水平(P＜0.01或P＜0.05)，對心肌組織中NO的升高作用，超微粉高劑量明顯強(qiáng)于普通通心絡(luò)(P＜0.05)。
表1 各組小鼠血漿、心肌組織NO(一氧化氮)水平(X±S)

注與正常組相比*P＜0.05；與模型組相比△P＜0.05；與普通通心絡(luò)組比#P＜0.05超微粉通心絡(luò)對心肌組織eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)水平的影響表2結(jié)果顯示，模型組小鼠在腹腔注射Pit 30分鐘后，心肌細(xì)胞中eNOS的陽性單位有所下降，超微粉通心絡(luò)隨著劑量的升高，可明顯升高心肌細(xì)胞中eNOS的陽性單位。說明超微粉通心絡(luò)可以升高心肌細(xì)胞中的eNOS的活性。
表2小鼠心肌組織eNOS免疫組化染色結(jié)果灰度分析(X±S)

分析以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)超微粉通心絡(luò)可明顯升高垂體后葉素致小鼠心肌合血漿NO下降和eNOS表達(dá)下降，且作用由于普通通心絡(luò)，進(jìn)一步證實(shí)超微粉可能通過改善內(nèi)皮功能、減輕內(nèi)皮損傷，保護(hù)缺血后心肌損傷。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)7通心絡(luò)超微粉對心梗后心室重構(gòu)大鼠心肌間質(zhì)膠原重構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究目的探討心肌梗死后心室重構(gòu)過程中心肌間質(zhì)膠原的變化及其中藥通心絡(luò)超微粉對重構(gòu)的影響。
方法 制備大鼠心肌梗死后心室重構(gòu)模型，隨機(jī)分成心室重構(gòu)組、培多普利組、通心絡(luò)超微粉組和通心絡(luò)組，6周后分別檢測血清I型膠原羧基末端肽(P I CP)、血清III型膠原氨基末端肽(PIIINP)，梗死區(qū)與非梗死區(qū)膠原含量、血漿與心肌組織血管緊張素II(Ang II)含量；透射電鏡和掃描電鏡觀察超微組織結(jié)構(gòu)的變化。
結(jié)果 在心肌梗死的心室重構(gòu)過程中，血清PIIINP和P I CP明顯增高，經(jīng)中藥通心絡(luò)超微粉治療后，兩者均有所改善。中藥通心絡(luò)超微粉可不同程度地降低梗死區(qū)與非梗死區(qū)膠原含量，降低心肌局部的Ang II水平，改善超微結(jié)構(gòu)的病理變化。
結(jié)論 通心絡(luò)超微粉可在一定程度上抑制大鼠心肌梗死后的心室重構(gòu)。
心室重構(gòu)(ventricular remodel ing)是心肌受損后發(fā)生的一系列結(jié)構(gòu)變化，它包括了心室大小、形態(tài)、室壁厚度和構(gòu)成成份的改變(1)。心室重構(gòu)在細(xì)胞水平分成兩部分，即心肌細(xì)胞的重構(gòu)和心肌間質(zhì)的重構(gòu)。研究表明，心臟的功能不僅取決于心肌本身的舒縮功能，同時與心肌細(xì)胞外間質(zhì)成份(extracellular matrix ECM)密切相關(guān)。心肌ECM的主要成份為心肌膠原網(wǎng)絡(luò)，它不僅有支撐和連接作用，而且在協(xié)調(diào)力的傳遞，信息傳遞，營養(yǎng)傳遞等方面均能發(fā)揮十分重要的作用(2)。本研究觀察了大鼠心肌梗死后心肌膠原的重構(gòu)情況，并分別用培多普利(perindopril)、通心絡(luò)和通心絡(luò)超微粉作為干預(yù)藥物，探討中藥通心絡(luò)超微粉對膠原重構(gòu)的干預(yù)作用。
材料與方法一、模型制備選用10周齡雄性SD大鼠，體重250-300克，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。參照Pfeffer(3)和Fishcin(4)報導(dǎo)的方法略加改進(jìn)，制備心梗后心室重構(gòu)大鼠動物模型。即氯氨酮80mg/kg腹腔注射麻醉，于胸骨左緣3-4肋間開胸，切開心包，迅速彈出心臟，在左心耳與肺動脈圓椎之間找到左冠狀動脈，在動脈起始點(diǎn)下方2-3mm處，用6-O號絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支后，將心臟送回胸腔，逐層關(guān)閉胸腔。術(shù)中經(jīng)肉眼觀察，梗死區(qū)呈蒼白色；手術(shù)前后記錄體表心電圖，以術(shù)后II導(dǎo)聯(lián)ST段弓背向上抬高為結(jié)扎成功的標(biāo)志；假手術(shù)組不結(jié)扎前降支，余步驟與手術(shù)組相同。飼養(yǎng)6周后處死動物。
二、動物分組、飼養(yǎng)與給藥實(shí)驗(yàn)動物分成心室重構(gòu)(VR)組，培多普利(PDP)組，通心絡(luò)超微粉(TXLC)組，通心絡(luò)(TXL)組，假手術(shù)(Sham)組共五組。模型制備后隨機(jī)分入心室重構(gòu)組，培多普利組，通心絡(luò)超微粉組和通心絡(luò)組，心室重構(gòu)組與假手術(shù)組以生理鹽水灌胃，每日三次，每次3ml；通心絡(luò)組以通心絡(luò)1g/kg/d灌胃，每日三次。通心絡(luò)超微粉組以通心絡(luò)超微粉0.6g/kg/d灌胃，每日三次。培多普利組以培多普利2mg/kg灌胃，每日一次。
所有動物均單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件相同，藥物與生理鹽水均以編號表示，灌胃由動物中心專人按單盲法進(jìn)行。
通心絡(luò)超微粉由河北以嶺藥業(yè)有限公司提供，主要由人參、水蛭、全蝎等組成。衛(wèi)藥準(zhǔn)字(97)Z-001號。
三、方法1.血清I型膠原羧基末端肽(P I CP)、血清III型膠原氨基末端肽(PIIINP)含量測定采用放免法測定，P I CP和PIIINP放免試劑盒購自O(shè)rion Diagnost ica公司。血清標(biāo)本采自于大鼠腹主動脈，按放免試劑盒說明書進(jìn)行測定。P I CP批內(nèi)CV8.5％，批間CV3.1％；PIIINP批內(nèi)CV4.3.％，批間CV4.0％。
2.梗死區(qū)(IZ)和非梗死區(qū)(NIZ)膠原含量測定參考文獻(xiàn)(5)的方法，分別取左室IZ和NIZ心肌組織100mg，勻漿后將組織粉末置于3mol/L的HCL液，125℃酸解5小時，加氯胺T氧化變色，722型分光光度計(jì)于560nm處測得樣本光密度值，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得羥脯氨酸含量，按公式換算成心肌膠原含量。
3.血漿、心肌組織AngII含量測定參考文獻(xiàn)(6)的方法，用放免法分別測定血漿、心肌組織Ang II的含量。組織Ang II試劑盒購自中國北方生物技術(shù)研究所，血清標(biāo)本采自于大鼠腹主動脈，心肌取自大鼠左室非梗死區(qū)，操作按試劑說明書進(jìn)行。
4.電鏡標(biāo)本制備及觀察透射電鏡取梗死交界區(qū)、室間隔各1mm大小的心肌，4％PBS戊二醛灌注固定，灌注壓17.3-18.7Kpa，PH7.3。灌注30min后，由上海第二醫(yī)科大學(xué)電鏡室包埋切片，透射電鏡觀察。
掃描電鏡灌注過程同上，加2.5％戊二醛磷酸緩沖液，4℃固定1周，系列乙醇脫水，醋酸異戊酯過渡，HCP-2臨界干燥儀干燥，HUS-5GB真空噴鍍儀鍍金，Philips--XL30掃描電鏡觀察。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理。
結(jié)果通心絡(luò)超微粉對心梗大鼠血清I型膠原羧基末端肽(P I CP)、血清III型膠原氨基末端肽(PIIINP)的影響表1. 大鼠血清P I CP、PIIINP及心肌膠原含量測定

說明**P＜0.01vs假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01vs心肌梗死組。
2.通心絡(luò)超微粉對心梗大鼠梗死區(qū)和非梗死區(qū)膠原含量、血漿、心肌組織Ang II水平的影響表2 大鼠梗死區(qū)和非梗死區(qū)膠原含量、血漿、心肌組織Ang II水平

說明**P＜0.01vs假手術(shù)組；△P＜0.05，△△P＜0.01vs心肌梗死組。
3.通心絡(luò)超微粉對心梗大鼠心肌間質(zhì)膠原形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡顯示心室重構(gòu)組間質(zhì)纖維母細(xì)胞增生明顯，呈高合成狀態(tài)，間質(zhì)膠原蛋白沉著明顯，見典型的間質(zhì)膠原纖維的沉積。培多普利組、通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉組上述病理改變程度較輕。假手術(shù)組病理改變不明顯。
掃描電鏡顯示心室重構(gòu)組心肌間質(zhì)膠原增生明顯，部分過度增生而呈束狀或網(wǎng)狀分布。培多普利組、通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉組上述病理改變程度較輕。假手術(shù)組病理改變不明顯。
討論心室重構(gòu)是心肌梗死后導(dǎo)致心力衰竭的病理過程，重構(gòu)的過程包括了梗死區(qū)膨展(infarct expansion，IE)和心室整體擴(kuò)張(global ventricular dilatation GVD)兩部分。IE源于梗死區(qū)不成比例地變薄與拉長，其結(jié)果使得局部室壁變形和內(nèi)腔增大。GVD則為IE、非梗死區(qū)牽拉、室腔幾何構(gòu)形改變的共同結(jié)果。心肌梗死后6周內(nèi)，IE、GVD共同構(gòu)成了早期重構(gòu)。本研究觀察了通心絡(luò)超微粉干預(yù)早期重構(gòu)的情況。
心室重構(gòu)從細(xì)胞水平上包括了心肌細(xì)胞的重構(gòu)和心肌間質(zhì)的重構(gòu)。其中心肌間質(zhì)的主要成分是心肌膠原網(wǎng)絡(luò)，后者的重構(gòu)是導(dǎo)致心肌間質(zhì)重構(gòu)主要的決定因素(7)。本研究觀察了通心絡(luò)超微粉對心肌間質(zhì)膠原重構(gòu)的影響。
P I CP、PIIINP是I、III型膠原合成過程中的產(chǎn)物(8)。國外對終末期心力衰竭患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，血清PIIINP濃度與心肌III型膠原容積百分比的相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.784(9)。對自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)血清P I CP含量的檢測則發(fā)現(xiàn)，血清P I CP濃度與心肌膠原容積百分比呈正相關(guān)(10)。本研究發(fā)現(xiàn)在心肌梗死的心室重構(gòu)過程中，血清PIIINP濃度和血清P I CP濃度明顯增高，經(jīng)中藥通心絡(luò)超微粉治療后，兩者均有所改善。通心絡(luò)超微粉可通過抑制心肌膠原的合成達(dá)到干預(yù)重構(gòu)的目的。
心肌梗死后，心肌膠原基質(zhì)在IZ和NIZ的伸展對愈合、構(gòu)型改變、心電及傳導(dǎo)異常、功能改變等至關(guān)重要。羥脯氨酸是構(gòu)成膠原蛋白的主要成份，本研究表明，在心肌梗死后的早期重構(gòu)過程中，IZ和NIZ的膠原含量均有所增高，尤以IZ為明顯。中藥通心絡(luò)超微粉可不同程度地抑制心肌梗死后的膠原纖維的增生和/或減少膠原蛋白的沉積，從而改善心室順應(yīng)性，改善心臟的舒張功能。
在病理性的心肌肥厚中，心肌膠原的重構(gòu)起著主要的和決定性作用(7)。心肌膠原的重構(gòu)與RAAS密切相關(guān)(11)。國外研究表明，RAAS在膠原基質(zhì)的生化改建中發(fā)揮著重要的作用，ACEI可改善心肌梗死后膠原的代謝異常(12)。我們的相關(guān)研究表明，心梗后心梗組心肌組織中AngII的含量明顯高于對照組，通心絡(luò)超微粉均可不同程度地降低心肌局部的Ang II水平，提示通心絡(luò)超微粉均可通過抑制心肌自分泌和旁分泌的方式起到拮抗心肌重構(gòu)的作用(全文另發(fā))。本研究表明，通心絡(luò)超微粉可以通過抑制心肌膠原異常代謝，達(dá)到抑制心肌膠原重構(gòu)的目的。然而，通心絡(luò)超微粉作用的確切途經(jīng)和機(jī)制則有待進(jìn)一步研究與探討。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)8通心絡(luò)超微粉膠囊對大腦中動脈梗塞模型大鼠興奮性氨基酸及內(nèi)皮素基因表達(dá)的影響通心絡(luò)超微粉有較強(qiáng)的益氣活血通絡(luò)作用。我們在通心絡(luò)超微粉治療急性腦梗塞取得較好療效的基礎(chǔ)上觀察通心絡(luò)超微粉對大鼠大腦中動脈梗塞模型興奮性氨基酸、內(nèi)皮素及其基因表達(dá)的影響，旨在闡明通心絡(luò)超微粉治療急性腦血管病的確切療效及其可能作用機(jī)理。
1.材料與方法1.1大鼠大腦中動脈梗塞模型研制 大鼠大腦中動脈梗塞模型研制雄性9周Wistar大鼠40只，體重205±15g，購自上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部。隨機(jī)分為對照組、模型組、通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉組，每組各10只。大鼠可逆性大腦中動脈梗塞模型研制參照文獻(xiàn)[1]。大鼠以戊巴比妥鈉50mg/kg ip麻醉，右側(cè)股動脈插管監(jiān)測血壓，紅外線燈保持動物肛溫38℃。頸正中切口，依次暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端及翼腭突動脈。在頸外動脈遠(yuǎn)心端分支處插入4-0聚丙烯手術(shù)縫線(線端預(yù)先加熱成球形，直徑0.3-0.35mm)，緩慢向頸內(nèi)動脈推進(jìn)插線，當(dāng)進(jìn)線約17-20mm時可感到明顯的阻力，同時可見頸內(nèi)動脈顱外段明顯的屈曲、緊張，提示尼龍線已阻塞大腦中動脈，大鼠清醒后灌胃給通心絡(luò)膠囊超微粉(0.6g/kg)。模型組以等體積生理鹽水代替通心絡(luò)超微粉，余同通心絡(luò)超微粉組；對照組(假手術(shù)組)尼龍線只插到顱底沒有阻塞大腦中動脈。
1.2動物神經(jīng)功能評分MCAO后3小時觀察動物神經(jīng)功能缺損狀況。方法參照文獻(xiàn)[2]大鼠無任何不對稱活動為0分，提起尾巴時左前爪不能完全伸展為1分，在1分的基礎(chǔ)上左前肢活動障礙為2分，左前肢緊貼胸壁為3分，大鼠自由活動時向左側(cè)轉(zhuǎn)彎為4分，4分伴有明顯的左前爪后推動作為5分，只能圍繞原點(diǎn)向左旋轉(zhuǎn)為6分，左側(cè)肢體完全不能支撐身體重量，只能躺向左側(cè)為7分。
1.3興奮性氨基酸檢測 用高效液相色譜法(HPLC)測定興奮性氨基酸含量。谷氨酸(Glu)麥門冬氨酸(MNDA)標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。實(shí)驗(yàn)動物斷頭取海馬秤重，加入10％磺基水楊酸鈉冰浴，組織勻漿器4000轉(zhuǎn)/分勻漿20秒，1000離心10min，取上清定溶量為2ml，移入Eppendorf管，-70℃保存待測。用磷苯二甲醛等柱前衍生。色譜條件流動相A為甲醇∶PBS等于3∶7；流動相B為0.05mol/L的NaAc-HAC緩沖液，流速為2ml/min，柱溫30℃檢測波長為UV-360nm，色譜柱為Altex(4.6mm ID×25cmL)。
1.4內(nèi)皮素含量測定及其基因表達(dá) 內(nèi)皮素RIA檢測藥盒購自中國人民解放軍總醫(yī)院放射免疫研究所。實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取海馬秤重，加入1mol/L預(yù)冷醋酸(W/V＝1.5)，組織勻漿器4000轉(zhuǎn)/分勻漿20秒，4000rpm離心10min(4℃)，取上清-70℃保存待測。ET-1mRNA表達(dá)采有半定量逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(sqRT-PCR)方法。根據(jù)ET-1的核酸序列，自行設(shè)計(jì)與合成PCR引物，上下游引物序列為5’-CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG G-3’；5’-AAG ATG CCA GCC ATG GAG AGC G-3’。經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增的ET-1cDNA序列，長度為546bp。取各組總mRNA1.0ug，按常規(guī)程序逆轉(zhuǎn)錄，42℃反應(yīng)30min，95℃加熱5min。再分別取5.0ul逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、變性、退火及延伸，溫度分別為94℃、50℃、72℃，時間40s、30s、1min，循環(huán)30個周期。對DNA擴(kuò)增帶進(jìn)行圖象分析，測出IOD值進(jìn)行比較。
1.4醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法 spss11.5軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。
2.結(jié)果2.1通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損的影響大鼠MCAO 3小時幾乎所有動物都有程度不同的神經(jīng)功能缺損。通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于模型組，P＜0.01。提示通心絡(luò)超微粉能有效改善大鼠MCAO 3小時的神經(jīng)功能缺損。
表1 通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損的影響(X±SD)

與模型組比較**P＜0.012.2通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠模型中樞興奮性氨基酸的影響 如表2所示，大鼠MCAO 3小時海馬谷氨酸、麥門冬氨酸等興奮性氨基酸含量明顯升高，與模型組比較，通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉組谷氨酸與麥門冬氨酸含量明顯低于模型組(P＜0.01)。
表2 通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠海馬興奮性氨基酸的影響(mg/g.wt X±SD)

注與對照組比較**P＜0.05；與模型組比較##P＜0.01.
2.3通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠內(nèi)皮素含量的影響 如表3所示，大鼠MCAO 3小時海馬內(nèi)皮素含量明顯升高，與對照組比較P＜0.01；通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉組內(nèi)皮素含量明顯低于模型組(P＜0.05)。
表3 通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠海馬內(nèi)皮素含量的影響

注與對照組比較**P＜0.01；#與模型組比較P＜0.05.
2.4通心絡(luò)超微粉對MCAO大鼠內(nèi)皮素基因表達(dá)的影響ET-1mRNA研究發(fā)現(xiàn)，各組均可見一條546bp特異帶，經(jīng)圖象分析檢測表明，大鼠MCAO3小時，中樞ET-1mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)；通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉能降低MCAO大鼠的中樞ET-1mRNA表達(dá)。提示通心絡(luò)超微粉能有效改善MCAO大鼠的缺血損傷。
3.討論中樞興奮性氨基酸對急性缺血性中風(fēng)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的重視。谷氨酸與麥門冬氨酸是中樞主要的興奮性氨基酸，谷氨酸在中樞含量最高、分布最廣、作用最強(qiáng)。在發(fā)生腦缺血的數(shù)分鐘至數(shù)小時內(nèi)，中樞興奮性氨基酸即大量增高[3]。本研究表明大鼠MCAO3小時，伴隨著神經(jīng)功能缺損，海馬谷氨酸與麥門冬氨酸含量上升，與對照組比較P＜0.01。通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉可降低MCAO大鼠海馬谷氨酸與麥門冬氨酸含量，降低神經(jīng)功能缺損積分。
內(nèi)皮素(endothelin ET)是1988年日本學(xué)者Yanagisawa從培養(yǎng)的豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞分離純化的一種多肽，是目前已知的最強(qiáng)血管收縮物質(zhì)。ET由21個氨基酸組成其分子量約為2.4kD，分子內(nèi)有兩對由半胱氨酸殘基構(gòu)成的二硫鍵。人ET-1基因全長12464BP，基因結(jié)構(gòu)有5個外顯子與4個內(nèi)含子組成。大量研究表明，急性腦缺血時，循環(huán)及腦組織內(nèi)ET的合成與釋放增加，進(jìn)而促進(jìn)Ca++內(nèi)流，使缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca++超載，加重腦細(xì)胞的損害。本研究資料表明，本研究表明大鼠MCAO3小時海馬ET-1含量及ET-1mRNA表達(dá)顯著增加，與文獻(xiàn)報道一致[4]。通心絡(luò)、通心絡(luò)超微粉可降低MCAO大鼠海馬ET-1含量，抑制ET-1mRNA表達(dá)。
通心絡(luò)超微粉膠囊為石家莊以嶺藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，由蜈蚣、全蝎、水蛭、土蹩蟲、蟬蛻、人參、赤芍、冰片等組成，是國家新藥基金資助項(xiàng)目，功能益氣活血通絡(luò)解痙。本研究結(jié)果表明通心絡(luò)超微粉膠囊對大腦中動脈梗塞大鼠模型神經(jīng)功能缺損有改善作用，這可能與降低中樞興奮性氨基酸、抑制內(nèi)皮素含量及內(nèi)皮素基因表達(dá)有關(guān)。為活血通絡(luò)藥治療缺血性中風(fēng)提供了現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)9通心絡(luò)超微粉促腦缺血后血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的探討通心絡(luò)超微粉對大腦中動脈梗塞后血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響。方法以線栓法制成大鼠右側(cè)大腦中動脈梗塞模型(MCAO)，大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組、MCAO組、通心絡(luò)超微粉干預(yù)組。以免疫組織化學(xué)法及HE染色法分別檢測腦組織病理學(xué)變化、VEGF陽性表達(dá)。結(jié)果大腦中動脈梗塞后，缺血區(qū)神經(jīng)元變性、壞死、VEGF在半暗帶有少量表達(dá)，經(jīng)通心絡(luò)超微粉干預(yù)后，VEGF大量表達(dá)。結(jié)論通心絡(luò)超微粉可通過促VEGF表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而保護(hù)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)毛細(xì)血管新生。
正文目前，缺血性腦血管病的治療以溶栓和神經(jīng)保護(hù)治療為主，無論是溶栓，還是神經(jīng)保護(hù)治療，目的為恢復(fù)缺血區(qū)腦組織的血液供應(yīng)，保護(hù)微血管、神經(jīng)元，促進(jìn)毛細(xì)血管新生，側(cè)枝循環(huán)重建，神經(jīng)結(jié)構(gòu)重塑，使神經(jīng)功能盡快盡可能恢復(fù)[1]?，F(xiàn)已證實(shí)VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的促有絲分裂源，在病理情況下能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，使毛細(xì)血管新生[2]。因此，如何促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)上調(diào)、促腦毛細(xì)血管新生，是當(dāng)前腦缺血研究的熱點(diǎn)[3]。迄今，在眾多中藥制劑中，尚無一種藥物進(jìn)行過這一方面的研究，通心絡(luò)超微粉[4]是根據(jù)中醫(yī)理論研制而成的含多種蟲類中藥的復(fù)方制劑，具有益氣活血的功效，在腦血管病治療中具有良好的效果，因此本文選擇通心絡(luò)超微粉進(jìn)行研究，觀察通心絡(luò)超微粉對腦梗塞后VEGF表達(dá)的作用。
1、材料與方法1.1主要儀器和試劑-70℃冰箱(Sharp，日本)微量移液器(Gilson，法國)BH-2型Olympus顯微鏡(日本)彩色病理圖像分析儀(日本)VEGF兔多克隆抗體(Santa，美國)SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)1.2實(shí)驗(yàn)動物模型雄性健康的Wistar大鼠(250±20g)，采用右側(cè)大腦中動脈線栓法梗塞模型(MCAO)。3.5％的水合氯醛腹腔麻醉(10ml/kg)，大鼠仰臥位固定，經(jīng)頸部切開暴露左側(cè)頸總動脈(CA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈顱外段(ICA)，在頸外動脈近頸總動脈分叉處剪一切口，將栓子(尼龍繩線，直徑0.24mm，長20mm)向頸內(nèi)動脈顱內(nèi)方向插入17.5-18mm遇阻力而停止，栓子頭端即達(dá)大腦中動脈(MCA)起始部.將MCA起始部和ICA末端同時堵塞，同時用Zin氏夾，夾閉頸外動脈切口近端，縫合皮膚，栓塞即告完成。術(shù)后1小時，大鼠清醒，置單籠飼養(yǎng)觀察，根據(jù)Berderson氏檢查評級方法觀察記錄，大鼠術(shù)后爬行，不能走直線，而呈彎向栓塞血管對側(cè)的環(huán)狀爬行評為III級。
1.2實(shí)驗(yàn)分組，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分成3組，每組6只，假手術(shù)對照組，即手術(shù)過程及時間同其它組但不阻斷血供，MCAO組每日0.05ml/kg生理鹽水連續(xù)灌胃7天后行右側(cè)大腦中動脈梗塞術(shù)，術(shù)后III級大鼠入選，術(shù)后連續(xù)生理鹽水灌胃7天，TXLC干預(yù)組每日2.5g/kgTXLC連續(xù)灌胃7天后行MCAO手術(shù)，術(shù)后連續(xù)灌胃7天。
1.3組織學(xué)觀察大鼠處死后取腦置10％福爾馬林液固定，常規(guī)切片，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)觀察。
1.4VEGF蛋白表達(dá)的免疫組化染色大鼠術(shù)后7天麻醉，左心室灌注固定后取腦，4％PFA(多聚甲醛)外固定，10％蔗糖浸泡后，液氮連凍1分鐘，恒冷切片機(jī)上在大腦中部作冠狀切片，切片冷風(fēng)吹干，純丙酮室溫固定20-30分鐘。SABC法檢測VEGF蛋白表達(dá)。蒸鎦水洗，純甲醇加H2O2至0.5％，室溫浸泡30分鐘，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗3次，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘.甩去多余液體，不洗。滴加適當(dāng)稀釋的-抗，4℃過液。0.1MPBS冼2分鐘×3次，滴加生物素化山羊抗免IgG，37℃，20分鐘，0.1MPBS洗2分鐘×3次，滴加試劑SABC，20-37℃，20分鐘，0.1MPBS洗5分鐘×4次，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)時間，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有資料以X±SD表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.01認(rèn)為具有顯著性差異。
2、結(jié)果2.1腦組織病理學(xué)改變假手術(shù)對照組大鼠皮層組織，細(xì)胞排列有序，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞內(nèi)可見NiSS小體，核清楚，組織間隙無異常。MCAO組神經(jīng)細(xì)胞呈缺血性改變，核消失，胞體增大，染色變淡，邊緣不規(guī)則，核固縮，細(xì)胞周圍水腫明顯，組織結(jié)構(gòu)疏松，水腫明顯，呈海棉狀。TXLC干預(yù)組缺血神經(jīng)元數(shù)目減少，組織結(jié)構(gòu)水腫減輕。
2.2VEGF免疫組化及圖像分析假手術(shù)對照組無VEGF陽性神經(jīng)元表達(dá)，MCAO組在缺血中心及周邊區(qū)神經(jīng)元、缺血側(cè)軟腦膜細(xì)胞、海馬神經(jīng)元均有VEGF弱表達(dá)；TXLC干預(yù)組較MCAO組，上述部位有VEGF強(qiáng)陽性表達(dá)。
3討論3.1腦缺血后VEGF的表達(dá)與新血管生成血管新生，即原有的血管又產(chǎn)生新的血管。在成年器官，生理性的血管新生是很少見的。在月經(jīng)期和懷孕期，女性生殖器官可以有血管新生。血管新生還可以發(fā)生在病理的情況下，例如缺血、炎癥、傷口愈合等。血管新生是一個復(fù)雜的過程，包括一系列銜接非常準(zhǔn)確的過程。腦血管閉塞以后，24小時內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞開始大量增殖，72小時缺血區(qū)有新生的毛細(xì)血管。毛細(xì)血管新生的范圍與程度直接關(guān)系到缺血邊緣區(qū)血流的改善，影響神經(jīng)元生理功能的恢復(fù)，從而決定了患者的預(yù)后。新血管的形成來源于先前存在的血管的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，而內(nèi)皮細(xì)胞增殖，有賴于VEGF的刺激[7]。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞的特異性有絲分裂源，在體外可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的生長，在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管生成[1]。這種作用主要是由于VEGF對血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長刺激作用和趨化作用，VEGF對內(nèi)皮細(xì)胞的直接作用可能是通過激活細(xì)胞上的磷脂酶短暫地誘導(dǎo)Ca2+釋放而發(fā)生的。VEGF為分泌性蛋白，作用于特異性受體，從而保護(hù)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，防止毛細(xì)血管消失，同時刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管新生，神經(jīng)功能迅速恢復(fù)。
3.2通心絡(luò)超微粉對缺血后VEGF表達(dá)及新血管生成的作用既往的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后血流增加可誘導(dǎo)VEGF的大量表達(dá)[12]，通心絡(luò)超微粉既往的試驗(yàn)表明它具有降低腦缺血后液粘度，降低腦血管阻力，增加腦缺血后腦血流量的作用[4]，因此從理論上講，具有誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的可行性，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了上述觀點(diǎn)。在對MCAO大鼠進(jìn)行通心絡(luò)超微粉預(yù)防性和治療性給藥后，大鼠腦組織缺血半暗帶神經(jīng)元、海馬神經(jīng)元及軟腦膜、室管膜等有大量的VEGF表達(dá)，結(jié)果表明通心絡(luò)超微粉能夠通過促進(jìn)VEGF大量表達(dá)而保護(hù)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，防止毛細(xì)血管消失，促毛細(xì)血管新生，從而具有腦保護(hù)功能。
實(shí)施例臨床試驗(yàn)10超微通心絡(luò)膠囊治療痔瘡臨床試驗(yàn)摘要目的觀察超微通心絡(luò)膠囊依據(jù)絡(luò)病理論治療痔瘡的臨床療效。方法用通心絡(luò)超微粉膠囊內(nèi)服，并與強(qiáng)力脈痔靈片對照。結(jié)果對II期內(nèi)痔、混合痔兩種類型痔瘡的臨床療效治療組與對照組比較，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；對便血、疼痛、墜脹等癥狀的改善，治療組明顯優(yōu)于對照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論通心絡(luò)膠囊具有益氣活血，通絡(luò)止痛等功效，是一種安全、有效的中藥制劑。
超微通心絡(luò)膠囊系石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的絡(luò)病治療藥物，臨床用于各個系統(tǒng)的疾病屬于中醫(yī)脈絡(luò)瘀阻的治療多年。為了評價該藥治療痔瘡的臨床療效，我們于2003年7月起對超微通心絡(luò)膠囊內(nèi)服治療痔瘡進(jìn)行臨床療效觀察，并與內(nèi)服強(qiáng)力脈痔靈片治療作比較，共收治病人300例，其中超微通心絡(luò)膠囊治療組200例，強(qiáng)力脈痔靈片對照組100例，現(xiàn)總結(jié)如下。
1臨床資料1.1病例選擇 觀察病例共300例，均是2003年7月-2004年12月在河北醫(yī)科大學(xué)附屬以嶺醫(yī)院肛腸科門診就診的患者。診斷符合2000年4月中華醫(yī)學(xué)會外科學(xué)會肛腸外科學(xué)組成都會議達(dá)成的“暫行標(biāo)準(zhǔn)”及2002年試行版《中藥新藥治療痔瘡的臨床研究指導(dǎo)原則》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，辨證分型屬氣虛血瘀絡(luò)阻者。入選病例按隨機(jī)雙盲方法分成兩組，其中超微通心絡(luò)膠囊治療組(以下簡稱治療組)200例，男88例，女112例；年齡25-70歲，平均32歲；強(qiáng)力脈痔靈片對照組(以下簡稱對照組)100例，男38例，女62例；年齡21-69歲，平均31歲。兩組病例在性別、年齡及病種方面差異無顯著性意義(p＞0.05)。
1.2排除標(biāo)準(zhǔn) 炎性外痔及結(jié)締組織外痔(前哨痔)；痔合并肛瘺、肛周膿腫、直腸息肉、肛乳頭瘤及結(jié)締組織外痔和靜脈曲張性外痔；合并有嚴(yán)重心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾??；妊娠及哺乳期婦女；過敏體質(zhì)及對多種藥物過敏者；不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)，不按規(guī)定用藥或無法判定療效者。
2治療方法2.1治療組 內(nèi)服超微通心絡(luò)膠囊(石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))，每次4粒，每日3次。
2.2對照組 內(nèi)服強(qiáng)力脈痔靈片(德國禮達(dá)大藥廠生產(chǎn))，每日2次，每次2片。
2.3療程內(nèi)痔、外痔、混合痔治療均以20天為1療程。觀察期間停用其他中西藥物。治療3個療程統(tǒng)計(jì)療效。
3療效標(biāo)準(zhǔn)與治療結(jié)果3.1療效標(biāo)準(zhǔn) 參照2002年試行版《中藥新藥治療痔瘡的臨床研究指導(dǎo)原則》及1975年全國肛腸學(xué)術(shù)會議制訂的標(biāo)準(zhǔn)。痊愈癥狀、體征消失或基本消失，積分值減少≥95％，相關(guān)理化指標(biāo)正?；蚧菊?。顯效癥狀、體征明顯改善，積分值減少≥70％，相關(guān)理化指標(biāo)明顯改善。有效癥狀、體征消失或基本消失，積分值減少≥30％，相關(guān)理化指標(biāo)有相應(yīng)好轉(zhuǎn)。無效癥狀、體征未見好轉(zhuǎn)，積分值減少＜30％，相關(guān)理化指標(biāo)無改善。主要癥狀的療效則分為痊愈、顯效、有效、無效4級。癥狀完全消失為痊愈，明顯減輕為顯效，有所改善為有效，無變化或加重為無效。
3.2治療結(jié)果3.2.1不同病種的治療比較 見表1。

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組療效比較采用Wilcox on秩和檢驗(yàn)。
由表1可知，兩組對II期內(nèi)痔、混合痔兩種痔瘡療效的比較，經(jīng)Wilcox on秩和檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。對I期內(nèi)痔、外痔兩種痔瘡療效，經(jīng)Wilcox on秩和檢驗(yàn)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，說明超微通心絡(luò)膠囊對各種類型痔瘡均有較好療效，尤對治療II期內(nèi)痔、混合痔兩種痔瘡有良好療效，優(yōu)于對照組強(qiáng)力脈痔靈片。
3.2.2各組不同癥狀的療效比較見表2。

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組療效比較采用Wilcox on秩和檢驗(yàn)。
由表2可知，兩組對便血、疼痛、墜脹的療效比較，經(jīng)Wilcox on秩和檢驗(yàn)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。說明超微通心絡(luò)膠囊對上述癥狀的改善優(yōu)于對照組強(qiáng)力脈痔靈片。
4討論中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痔瘡的發(fā)病原因復(fù)雜。“夫痔者，乃素積濕熱，過食炙烻，或因久坐而血脈不行，又因七情而過傷生冷，以及擔(dān)輕負(fù)重，竭力遠(yuǎn)行，氣血縱橫，經(jīng)絡(luò)交錯；又或酒色過度，腸胃受傷，以致濁氣瘀血，流注肛門，俱能發(fā)痔?！?《外科大成》)臨床上常見疼痛、便血、墜脹、水腫、瘙癢等癥狀。絡(luò)病學(xué)認(rèn)為痔瘡發(fā)病主要由于局部脈絡(luò)瘀阻日久，阻礙脈絡(luò)正常的功能，從而形成痔；治療上應(yīng)以活血通絡(luò)為主，兼以補(bǔ)氣以行血，從而達(dá)到血行絡(luò)通，痔瘀消失的目的。石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的超微通心絡(luò)膠囊以活血通絡(luò)見長，臨床研究表明其對I期內(nèi)痔、II期內(nèi)痔、混合痔、外痔的總有效率分別為93.2％、89.7％、84.0％、87.5％，在II期內(nèi)痔、混合痔的療效優(yōu)于對照組強(qiáng)力脈痔靈片(p＜0.05)。對便血、疼痛、水腫、墜脹、瘙癢等主要癥狀的療效，亦均有良好療效；尤其長于緩解便血、疼痛、墜脹癥狀，與強(qiáng)力脈痔靈片療效有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明超微通心絡(luò)膠囊具有迅速止血、止痛、止癢、消腫的作用，且療效確切，是治療各種痔瘡的有效藥物。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)11超微粉通心絡(luò)對月桂酸引起血栓閉塞性脈管炎的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)對月桂酸引起血栓閉塞性脈管炎的預(yù)防及治療作用。
分組與給藥采用實(shí)施例所制備的超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為1.2g生藥/Kg、0.6g生藥/Kg和0.3g生藥/Kg；采用對比例 所制備的普通粉膠囊劑D1，其給藥量為0.6g生藥/Kg，樣品給藥3天后手術(shù)，術(shù)后再給藥5天；模型組給予1％西黃蓍膠，另假手術(shù)組正常飲水飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠，雄性，體重230～250g，60只(每組10只)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
造模方法大鼠連續(xù)給藥3天，于第3次給藥后1小時腹腔注射3％的戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉，仰臥固定，右下肢股內(nèi)側(cè)剪毛，75％的酒精消毒皮膚，縱行切開約1.5cm長的切口，游離股動脈，用動脈夾阻斷血液，在動脈夾的下方向股動脈遠(yuǎn)心端注入0.2ml月桂酸溶液，ZT快速醫(yī)用膠封閉針孔，1min后打開動脈夾，縫合皮膚。假手術(shù)組由股動脈注入0.2ml生理鹽水。術(shù)后按上述方法連續(xù)給藥5天。
觀察指標(biāo)觀察患肢皮膚溫度、顏色、動脈搏動，患肢腫脹、壞疽和木乃伊化的病變程度和范圍，并進(jìn)行分級(0級正常；I級病變局限于趾甲部；II級病變局限于趾部；III級病變局限于足爪部；IV級病變限于膝關(guān)節(jié)以下；V級病變發(fā)展到膝關(guān)節(jié)以上)。
病理學(xué)檢查截取大鼠整個右下肢，用10％的福爾馬林固定，3天后用10％的硝酸脫鈣，在足趾、踝關(guān)節(jié)上、下及股部4個部位橫斷切片，HE染色，每個標(biāo)本分別取4張四部位切片放在一個蓋玻片上，對動脈血栓進(jìn)行分級(0級無血栓形成；I級一個血栓；II級2-3個血栓；III級4個以上血栓)，同時分別對動脈壁炎性細(xì)胞浸潤、纖維增生及血栓機(jī)化與再通等情況進(jìn)行觀察。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)資料均用秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果大體觀察大鼠股動脈注入月桂酸后約5min，患側(cè)足爪部變蒼白繼而青紫，皮膚溫度降低，動脈搏動減弱或消失，次日受累的患肢出現(xiàn)水腫、糜爛等炎癥反應(yīng)，且足趾變黑，所有大鼠均有患肢疼痛、跛行和曳行現(xiàn)象，隨著時間的推移逐漸向上發(fā)展，形成壞疽和木乃伊化。模型組的病變最為嚴(yán)重，少數(shù)動物術(shù)后表現(xiàn)為患肢水腫，糜爛及炎癥反應(yīng)，超微粉通心絡(luò)高劑量組病變最輕，而假手術(shù)組均不出現(xiàn)病變，見表1。
病理學(xué)檢查病理結(jié)果表明，模型組大鼠患肢動脈內(nèi)均有不同程度的血栓形成，陰性對照組的血栓形成分級全部為II和III級，超微粉通心絡(luò)3個劑量組和復(fù)方丹參片組大鼠的血栓數(shù)明顯減少，且隨劑量增加其血栓分級降低，超微粉通心絡(luò)高劑量組與模型組比較，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著性差異(P＜0.05)。超微粉通心絡(luò)中高劑量組及普通通心絡(luò)血栓再通數(shù)增多，但除超微粉通心絡(luò)高劑量組有一例發(fā)生血栓機(jī)化現(xiàn)象外，其余各組均未發(fā)現(xiàn)血栓機(jī)化(見表1)。
分析本實(shí)驗(yàn)通過對血栓閉塞性脈管炎模型大鼠大體病變觀察和病理學(xué)檢查，顯示超微粉通心絡(luò)口服可通過抗血栓形成及溶栓等途徑實(shí)現(xiàn)對TAO的預(yù)防及治療作用，而且超微粉高劑量作用最為明顯。
超微粉通心絡(luò)對TAO大鼠肢體病變及動脈血栓的影響

實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)12超微粉通心絡(luò)膠囊對家兔髂股動脈粥樣硬化閉塞癥的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)膠囊對家兔髂股動脈粥樣硬化閉塞癥的影響，研究該藥的藥理作用，為增加該藥防治動脈硬化閉塞癥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)動物日本大耳白家兔，雄性，體重2.0-2.5kg，由北京通利實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場提供。
儀器和試劑超微粉通心絡(luò)膠囊試驗(yàn)用該藥提取干粉，1.4g生藥/g粉；膽固醇北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)。復(fù)方泛影葡胺注射液(76％，X-線造影劑)上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；。RM-6100型四導(dǎo)生理記錄儀，日本光電。TC2000型彩色超聲多普勒，德國EM公司產(chǎn)品。
試驗(yàn)方法一.動物分組和造模型試驗(yàn)前稱體重，測定右側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度，同時禁食過夜，然后將家兔隨機(jī)分為①假手術(shù)組(12只)，②造模組(68只)。造模組家兔采用機(jī)械損傷、免疫損傷、高脂飼料喂養(yǎng)等方法造模[1-3]。造模組家兔每只每天給予50g高脂顆粒飼料(在普通飼料中加2％膽固醇和2％花生油)，再添加普通基礎(chǔ)飼料100g，直至試驗(yàn)結(jié)束，假手術(shù)組家兔僅飼予普通基礎(chǔ)飼料。高脂喂養(yǎng)3天后，用戊巴比妥鈉麻醉(30mg/kg)，于右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)下方逐層鈍性分離股淺動脈，用20G穿刺針穿刺動脈，經(jīng)穿刺針逆行插入導(dǎo)引鋼絲(直徑0.014)，撤出穿刺針，沿導(dǎo)引鋼絲插入球囊導(dǎo)管(Cordis公司產(chǎn)品，球囊直徑2.5mm，長20mm)至髂總動脈上端，連接手推式壓力推注泵，向球囊內(nèi)注入生理鹽水使球囊內(nèi)壓力維持在8個大氣壓，緩慢回拉至入口處，回抽球囊內(nèi)液體，減壓至零，再將球囊送入，重復(fù)上述過程3次，撤出導(dǎo)管和導(dǎo)引鋼絲，壓迫止血，縫合傷口。假手術(shù)組家兔僅麻醉，于右側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)下方逐層鈍性分離股淺動脈，但不穿刺動脈不進(jìn)行內(nèi)皮剝脫術(shù)。手術(shù)過程均為無菌操作，術(shù)后肌注青霉素80萬單位/只，每日一次，連續(xù)5日。術(shù)后第7天，造模組家兔經(jīng)耳緣靜脈注射牛血清白蛋白250mg/kg，假手術(shù)組注射等體積生理鹽水。術(shù)后2周，測定術(shù)側(cè)(右側(cè)，下同)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度，并進(jìn)行行為學(xué)觀察。行為學(xué)觀察每二周一次，直至試驗(yàn)結(jié)束。術(shù)后8周，稱體重，測定術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度，同時禁食過夜，耳中動脈取血，測定血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)；然后隨機(jī)取假手術(shù)組家兔1只，造模組家兔3只進(jìn)行造影，并取其髂股動脈進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。根據(jù)所測指標(biāo)水平，挑選符合要求的家兔隨機(jī)分組(每組8只)假手術(shù)組、模型組、超微粉通心絡(luò)膠囊0.8、0.4、0.2g生藥g/kg劑量組，普通通心絡(luò)0.4g/kg劑量組。并按所述劑量開始給各組家兔灌胃給藥，假手術(shù)組和模型組家兔分別灌胃等體積蒸餾水，直至試驗(yàn)結(jié)束(術(shù)后20周)。給藥期間，除假手術(shù)組外，其余各組家兔均繼續(xù)喂飼高脂飼料。給藥4周(即術(shù)后12周)、給藥8周(即術(shù)后16周)、給藥12周(即術(shù)后20周)均測定血液中血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)，并稱體重，測定術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度，試驗(yàn)結(jié)束時即給藥12周(術(shù)后20周)每組隨機(jī)取2只家兔進(jìn)行造影，并取髂股動脈進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；其余家兔均采用氣栓法處死，解剖取髂股動脈進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
二.檢測指標(biāo)和方法1.行為學(xué)觀察[4]放行20米，觀察其行為變化，跛行程度分級如下0級靜止時，重心居中，術(shù)側(cè)后足靜止屈度與健側(cè)后足比較無異常；跑動時，術(shù)側(cè)后足和健側(cè)后足同時向后蹬，蹬幅和蹬力大小一樣，無異常。1級靜止時，重心偏向健側(cè)后足，術(shù)側(cè)后足靜止屈度欠佳，正向支撐；跑動時，健側(cè)后足用力向后蹬，術(shù)側(cè)后足側(cè)向后蹬，蹬力尚可，但蹬幅小。2級靜止時，重心偏向健側(cè)后足，術(shù)側(cè)后足靜止屈度欠佳，側(cè)向支撐；跑動時，健側(cè)后足用力向后蹬，術(shù)側(cè)后足側(cè)向后蹬，蹬幅和蹬力小。3級靜止時，重心偏向健側(cè)后足，術(shù)側(cè)后足靜止屈度欠佳，側(cè)向支撐；跑動時，健側(cè)后足用力向后蹬，術(shù)側(cè)后足側(cè)向著地，偶見后蹬，且蹬幅和蹬力小，或術(shù)側(cè)后足拖行。
2.術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度測定術(shù)側(cè)后肢脛骨髁上方1cm處為測點(diǎn)，剃毛，將溫度測定探頭置其上，測試時環(huán)境保持安靜，避免外界應(yīng)激干擾，室溫22-24℃，每次測定應(yīng)待生理記錄儀的計(jì)數(shù)恒定后準(zhǔn)確記錄其讀數(shù)。
3.髂股動脈粥樣硬化閉塞程度檢查(1)影像學(xué)觀察麻醉動物，分離腹主動脈，用動脈夾夾住近遠(yuǎn)端，用眼科小剪剪一小口，順向插入5F鞘管，連接注射器，松開動脈夾，直接快速推注造影劑，造影機(jī)攝像。
(2)組織病理學(xué)觀察分離術(shù)側(cè)后肢髂股動脈段(從術(shù)側(cè)大腿內(nèi)側(cè)下1/4處向上至髂總動脈上端)，自髂總動脈上端向下，每1cm為一段，共取其5段髂股動脈，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE染色，用顯微圖像分析系統(tǒng)測量內(nèi)膜厚度(從內(nèi)皮細(xì)胞膜的腔面至內(nèi)彈力膜波峰)、中膜厚度(從內(nèi)彈力膜波峰至最外層彈力膜波峰)、內(nèi)膜橫截面積及管腔面積，計(jì)算內(nèi)膜橫截面積比率[5](內(nèi)膜橫截面積比率＝內(nèi)膜橫截面積/(內(nèi)膜橫截面積+管腔面積)×100％)。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，資料均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。
試驗(yàn)結(jié)果一.行為學(xué)觀察(結(jié)果見表1)表1.超微粉通心絡(luò)膠囊對家兔行為學(xué)的影響(n＝8)


注與模型組比較(采用參比差值法)[7]術(shù)后2周開始進(jìn)行行為學(xué)觀察，每2周觀察一次，術(shù)后13周前未見各組家兔行為有明顯異常。假手術(shù)組家兔直至試驗(yàn)結(jié)束時(術(shù)后20周)均未見術(shù)側(cè)后肢行為異常，其它各組家兔從14周起術(shù)側(cè)后肢開始有異常行為出現(xiàn)。術(shù)后18周、20周模型組家兔術(shù)側(cè)后肢行為異常加重，術(shù)后18周(給藥10周)超微粉通心絡(luò)膠囊0.8g生藥/kg劑量組及普通通心絡(luò)家兔術(shù)側(cè)后肢行為異常明顯輕于模型組(p＜0.05)，超微粉通心絡(luò)膠囊0.4g生藥/kg劑量組及普通通心絡(luò)組家兔術(shù)側(cè)后肢行為異常程度與模型組比較有減輕趨勢；術(shù)后20周(給藥12周)超微粉通心絡(luò)膠囊0.8g生藥/kg、0.4g生藥/kg劑量組、普通通心絡(luò)組家兔術(shù)側(cè)后肢行為異常明顯輕于模型組(p＜0.05)。
二.對家兔術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度的影響(結(jié)果見表2)表3.超微粉通心絡(luò)膠囊對家兔術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度的影響(℃，X±SD)

注與假手術(shù)組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01由表2可見，試驗(yàn)前(0周)、術(shù)后2周、給藥前(術(shù)后8周)、給藥4周(術(shù)后12周)模型組術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度與假手術(shù)組比較均無明顯差異，各給藥組與模型組比較亦均無明顯差異；給藥8周(術(shù)后16周)模型組術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度明顯低于假手術(shù)組(p＜0.05)，來適可組術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度明顯高于模型組(p＜0.05)，超微粉通心絡(luò)膠囊0.8、0.4g生藥/kg劑量組及普通通心絡(luò)組術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度與模型組比較有升高趨勢；給藥12周(術(shù)后20周)，模型組術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度明顯低于假手術(shù)組(p＜0.05)，超微粉通心絡(luò)0.8g、0.4g生藥/kg劑量組、普通通心絡(luò)組術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮膚溫度均明顯高于模型組(p＜0.05或p＜0.01)三.對家兔髂股動脈粥樣硬化閉塞程度的影響1.影像學(xué)觀察術(shù)后8周血管造影可見，術(shù)側(cè)后肢髂股動脈通暢，管壁光滑，無狹窄，遠(yuǎn)端血管顯影良好，側(cè)枝循環(huán)顯影良好且通暢，假手術(shù)組與造模組比較無明顯差異。術(shù)后20周血管造影可見，假手術(shù)組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈通暢，管壁光滑，無狹窄，遠(yuǎn)端血管顯影良好，側(cè)枝循環(huán)顯影良好且通暢，模型組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈明顯狹窄，欠通暢，遠(yuǎn)端血管顯影欠佳，側(cè)枝循環(huán)少。超微粉通心絡(luò)膠囊0.8g、0.4g生藥/kg劑量組、普通通心絡(luò)組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈狹窄程度均明顯輕于模型組，遠(yuǎn)端血管顯影明顯較模型組清楚，側(cè)枝循環(huán)較模型組多；超微粉通心絡(luò)膠囊0.2g生藥/kg劑量組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈病變造影結(jié)果與模型組基本相似。
2.組織病理學(xué)觀察鏡下可見，術(shù)后8周及術(shù)后20周，假手術(shù)組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈內(nèi)膜僅覆蓋一層內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)膜彈力板完整，中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊，管壁厚薄均勻，細(xì)胞層次清楚，無形態(tài)結(jié)構(gòu)的異常；術(shù)后8周造模組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈內(nèi)膜有輕度增厚，內(nèi)含泡沫細(xì)胞，管腔無明顯狹窄；術(shù)后20周，模型組家兔術(shù)側(cè)后肢髂股動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)含大量泡沫細(xì)胞，中膜處可見平滑肌細(xì)胞增生入內(nèi)膜，管腔明顯狹窄，其內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜橫截面積比率均顯著大于假手術(shù)組(P＜0.001)，中膜厚度與假手術(shù)組比較無明顯差異；超微粉通心絡(luò)膠囊0.8、0.4g生藥/kg劑量組、通塞脈片組及來適可組術(shù)側(cè)后肢髂股動脈內(nèi)膜增厚及管腔狹窄程度明顯減輕，其內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜橫截面積比率均明顯小于模型組(P＜0.05或P＜0.01)，中膜厚度與模型組比較均無明顯差異；超微粉通心絡(luò)膠囊0.2g生藥/kg劑量組術(shù)側(cè)后肢髂股動脈內(nèi)膜增厚及管腔狹窄程度略有減輕趨勢，其內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜橫截面積比率、中膜厚度與模型組比較均無明顯差異(見表3)。
表3.超微粉通心絡(luò)膠囊對家兔髂股動脈病變的影響(X±SD，n＝8)

注與假手術(shù)組比較*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較△P＜0.05，△△P＜0.01；分析超微粉通心絡(luò)膠囊明顯改善術(shù)側(cè)后肢跛行程度，增加術(shù)側(cè)后肢遠(yuǎn)端皮溫；減少術(shù)側(cè)后肢髂股動脈內(nèi)膜厚度和內(nèi)膜橫截面積比率，減輕術(shù)側(cè)后肢髂股動脈管腔狹窄程度。提示超微粉通心絡(luò)膠囊具有調(diào)節(jié)血脂、防治ASO的作用。
實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)13超微通心絡(luò)對血液大鼠血液系統(tǒng)及纖溶活性的影響一 超微粉通心絡(luò)對正常大鼠凝血時間的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)對正常大鼠凝血時間的影響，進(jìn)一步分析通心絡(luò)的抗心肌和腦缺血的機(jī)制。
分組與給藥采用制備的超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為1.2g生藥/Kg、0.6g生藥/Kg和0.3g生藥/Kg；采用通心絡(luò)制備的普通粉膠囊劑D1，其給藥量為0.6g生藥/Kg，連續(xù)給藥7天；另正常對照組，正常飲水飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠，雄性，體重230～250g，60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
試劑PT、TT、APTT為Diagnostica Stago的產(chǎn)品。
3.凝血因子測定于末次給藥后1h頸總動脈放血，以3.8％枸櫞酸鈉(V/V為1∶9)抗凝，以1500g離心10min，上清為貧血小板血漿(PPP)，取PPP血漿100μl放于比濁管中，按試劑說明分別加入TT、PT和APTT試劑，在血小板聚集/凝集儀上分別測定凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)和部分凝血活酶時間(APTT)值。。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果對正常大鼠凝血因子作用由表1可知，同空白組相比較，通心絡(luò)各組TT、PT、APTT雖有一定延長趨勢，但無顯著性差異，表明通心絡(luò)對大鼠正常凝血功能無明顯影響。
表1.超微粉通心絡(luò)對MCAT大鼠凝血因子的影響(X±SD)

二 超微粉通心絡(luò)對正常大鼠血小板聚集性的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)對正常大鼠血小板聚集的影響，進(jìn)一步分析通心絡(luò)的抗心肌和腦缺血的機(jī)制。
分組與給藥采用制備的超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為1.2g生藥/Kg、0.6g生藥/Kg和0.3g生藥/Kg；采用通心絡(luò)所制備的普通粉膠囊劑D1，其給藥量為0.6g生藥/Kg，連續(xù)給藥7天；另正常對照組，正常飲水飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠，雄性，體重230～250g，60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
試劑和儀器ADP，德國sigma公司產(chǎn)品；LG-PABER-1型血小板聚集/凝集儀，北京市世帝科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。
膠原制備取大鼠尾一條，剝下外皮，刮除鱗片及內(nèi)部脂肪，并剪碎。稱重，按1∶9加入生理鹽水后在4℃下研磨，至乳白色，4℃1500g離心10min，取上清即10％膠原。
及ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的測定(Born比濁法)末次給藥后，頸總動脈放血，以3.8％枸櫞酸鈉(V/V為1∶9)抗凝，150g離心10min，上清為富血小板血漿(PRP)，剩余血漿繼續(xù)以1500g離心10min，上清為貧血小板血漿(PPP)，以PPP調(diào)零，取PRP 300μl加入比濁管，37℃溫育5min，分別加入誘導(dǎo)劑20μmol/L的ADP5μl和10％的膠原6μl，分別聚集5min、10min，記錄最大聚集率。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，資料均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果對正常大鼠血小板聚集率的影響連續(xù)給予通心絡(luò)7天后，膠原、ADP誘導(dǎo)的大鼠血小板聚集均有不同程度的降低，表明通心絡(luò)抗心肌缺血等作用可能與抑制血小板聚集有關(guān)。
表1 超微粉通心絡(luò)對ADP和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集的影響(X±SD)

注各組與模型組相比，*P＜0.05；**P＜0.01三 超微粉通心絡(luò)體內(nèi)溶栓作用及機(jī)制實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)的體內(nèi)溶栓及機(jī)制，進(jìn)一步分析通心絡(luò)的抗心肌和腦缺血的機(jī)制。
分組與給藥采用制備的超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為1.2g生藥/Kg、0.6g生藥/Kg和0.3g生藥/Kg；采用通心絡(luò)制備的普通粉膠囊劑D1，其給藥量為0.6g生藥/Kg，連續(xù)給藥7天；另設(shè)模型組，正常飲水飼養(yǎng)。
實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠，雄性，體重230～250g，60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
試劑和儀器組織型纖溶酶原激活劑(t-Pa)、纖溶酶原激活劑抑制劑(PAI)，由福建太陽生物技術(shù)公司提供；BT87-2型實(shí)驗(yàn)性血栓形成測定儀，包頭醫(yī)學(xué)院制造。
造模方法實(shí)驗(yàn)大鼠以1.5％戊巴比妥鈉35mg/kg體重腹腔注射麻醉，分離左側(cè)頸總動脈，將血栓形成測定儀刺激電極放于頸總動脈近心端，熱敏溫度計(jì)放于遠(yuǎn)心端，以1.5mA電流刺激7min。取下刺激電極和測溫器，然后消毒縫合，按上述方法灌胃給藥。末次給藥后1h，將大鼠麻醉，手術(shù)，完整剪下含血栓的頸總動脈段，并放入50％甲醛溶液中固定，測量其長度及濕重，60℃烘干后測血栓干重，實(shí)驗(yàn)以血栓長度、血栓干重為指標(biāo)。血栓重量＝血栓與血管總重-血管重量血漿t-pA、PAI活性測定除模型組為正常組外其它分組給藥同上，正常大鼠連續(xù)給藥7天后頸總動脈采血1.8mL，置入含0.2ml 3.28％枸椽酸鈉的塑料管內(nèi)，在低溫(4℃)下離心10分鐘(3000r/min)。分離20μl血漿加等量酸化液混勻，酸化液血漿樣本分別置于-20℃冰箱保存。t-pA、PAI活性測定采用發(fā)色底物法，均按藥盒說明書上的要求操作。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，資料均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果超微粉通心絡(luò)體內(nèi)血栓溶解作用結(jié)果顯示如表1所示，大鼠頸總動脈經(jīng)電刺激后局部形成血栓，5mm血栓干重約為2.4mg。通心絡(luò)各劑量組血栓重量與模型組相比明顯減輕(P＜0.05或p＜0.01)。而超微粉通心絡(luò)高劑量作用明顯優(yōu)于普通通心絡(luò)組(P＜0.05)。
表1 超微粉通心絡(luò)體內(nèi)血栓溶解作用(X±SD)

注與模型組相比，**P＜0.01，*P＜0.05；與普通通心絡(luò)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01超微粉通心絡(luò)對t-PA和PAI的作用正常大鼠連續(xù)灌胃給藥7天，通心絡(luò)各組均可升高t-PA活性、降低PAI活性，表明超微粉通心絡(luò)和普通通心絡(luò)對正常大鼠纖溶活性均有一定程度提高。
表2 超微粉通心絡(luò)體內(nèi)血栓溶解作用(X±SD)

注與正常對照組相比，**P＜0.01，*P＜0.05四 超微粉通心絡(luò)對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察超微粉通心絡(luò)對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響，進(jìn)一步分析通心絡(luò)的抗心肌和腦缺血的機(jī)制。
分組與給藥采用制備的超微粉通心絡(luò)膠囊劑S1，其給藥量分別為1.2g生藥/Kg、0.6g生藥/Kg和0.3g生藥/Kg；采用對比例 所制備通心絡(luò)的普通粉膠囊劑D1，其給藥量為0.6g生藥/Kg，連續(xù)給藥7天；另設(shè)模型組和假手術(shù)組，正常飲水飼養(yǎng)，。
實(shí)驗(yàn)動物Wistar大鼠，雄性，體重230～250g，60只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK 11-00-0008。
試劑和器材紅細(xì)胞變形試劑，北京市世帝科學(xué)儀器公司提供；RBC變形/聚集測試儀，型號LG-B-190，北京市世帝科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；血粘度儀，型號R-80，北京市世帝科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；造模方法大鼠于首次給藥后1h，皮下注射腎上腺素0.1ml/100g體重(0.1mg/kg)2次，間隔4h，中間將大鼠浸入冰水(4℃)內(nèi)5min，當(dāng)天繼續(xù)給藥。次日晨末次給藥后1h，將大鼠以烏拉坦1.5g/kg腹腔注射麻醉，頸總動脈插管采血，肝素(20u/ml血)抗凝。
紅細(xì)胞變形性和聚集性的測定取抗凝血40μl加紅細(xì)胞變形液1ml，混勻，取樣0.8ml用紅細(xì)胞變形/聚集測試儀測試，以紅細(xì)胞最大變形指數(shù)(MAXDI)和曲線下面積(SSS)表示紅細(xì)胞變形性；另取抗凝血0.8ml用紅細(xì)胞變形/聚集測試儀進(jìn)行測試，以紅細(xì)胞最大聚集指數(shù)(MAXD)和曲線下面積(SS)表示紅細(xì)胞聚集性。
血液粘度的測定取抗凝血0.8ml用血液粘度儀進(jìn)行檢測，以200、100、30S-1、1S-1時血液粘度表示全血粘度；另取抗凝血以2000轉(zhuǎn)離心8min，其上清液即為血漿，取0.8ml血漿用血液粘度儀測試100S-1時的血漿粘度。
數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示，資料均用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用方差分析。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示模型組與對照組比較，各切變率下的全血粘度與血漿粘度均明顯增高，紅細(xì)胞聚集性增高，變形性下降(P＜0.05或p＜0.01)。通心絡(luò)各組均可明顯降低血瘀癥大鼠血漿粘度，增高其紅細(xì)胞變形能力(P＜0.05或P＜0.01)；其中超微粉高劑量組對紅細(xì)胞變形性等指標(biāo)作用更明顯(P＜0.05)。
表1 超微粉通心絡(luò)對急性血瘀大鼠全血粘度的影響(X±SD)

注與正常組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與普通通心絡(luò)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01表2 超微粉通心絡(luò)對急性血瘀大鼠紅細(xì)胞變形性和聚集性的影響(X±SD)

注與正常組相比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01；與普通通心絡(luò)組比較，#P＜0.05，##P＜0.01實(shí)施例藥理實(shí)驗(yàn)14兩種工藝處理的通心絡(luò)在誘導(dǎo)CD1敲除和野生型血管平滑肌細(xì)胞動脈粥樣硬化調(diào)控基因應(yīng)答的比較研究動脈粥樣硬化是一個伴有脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥的慢性動脈疾病。動脈粥樣硬化促進(jìn)或抑制基因表達(dá)在動脈粥樣硬發(fā)展過程中扮演站中心角色，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，許多參與脂質(zhì)代謝和炎癥的基因產(chǎn)物在動脈壁處于較高或較低的表達(dá)。通心絡(luò)膠囊是由多種中藥成份組成的傳統(tǒng)中藥，已證實(shí)在動脈粥樣硬化和心衰中發(fā)揮著心血管保護(hù)作用。進(jìn)行了兩種不同工藝處理的通心絡(luò)膠囊對鼠平滑肌細(xì)胞和CD-1d蛋白缺失的巨噬細(xì)胞動脈粥樣硬化調(diào)控基因表達(dá)的作用比較。我們的數(shù)據(jù)表明超微粉碎通心絡(luò)在促進(jìn)脂質(zhì)調(diào)控基因PPAR表達(dá)，尤其是在缺失CD1d蛋白的細(xì)胞中該基因的表達(dá)表現(xiàn)出比普通通心絡(luò)更強(qiáng)的生物學(xué)活性。
引言通心絡(luò)是傳統(tǒng)中藥，已經(jīng)被證實(shí)在冠心病和缺血性心臟衰竭病人中發(fā)揮著抗動脈粥樣硬化作用。在動物研究中，通心絡(luò)已經(jīng)表現(xiàn)出促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶活力和改善介入治療后心肌灌流的作用。通心絡(luò)膠囊治療后還可以降低膽固醇沉積，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊。
動脈粥樣硬化是一個伴有脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥的慢性動脈疾病，動脈粥樣硬化促進(jìn)或抑制基因表達(dá)在動脈粥樣硬發(fā)展過程中扮演站中心角色，在動脈粥樣硬化發(fā)展過程中，許多參與脂質(zhì)代謝和炎癥的基因產(chǎn)物在動脈壁處于較高或較低的表達(dá)。
在這項(xiàng)研究中，兩種工藝通心絡(luò)被用于實(shí)驗(yàn)，對比它們在調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞和腹膜巨噬細(xì)胞動脈繼樣硬化調(diào)控基因表達(dá)的能力。兩種通心絡(luò)治療后可誘導(dǎo)PPAR的表達(dá)。
材料與方法試劑和抗體細(xì)胞培養(yǎng)液和試劑，包括DMEM(Cat.No.D5796)，臺牛血清(FBS Cat.No.D5796)和磷酸鹽溶液(PBS Cat.No.79378)購自美國Sigma公司.小鼠單克隆抗體抗PPAR和小鼠單克隆抗體抗beta-actin分別購自Santa Cruz公司(Cat.No.SC-7273)和美國Sigma公司，(Cat.No.A5316).通心絡(luò)(TXL)粗制粉和超微粉有中國石家莊以嶺制藥有限公司提供。
原代平滑肌細(xì)胞分離原代平滑肌細(xì)胞分離自野生型小鼠(BALB/C)和CD1d基因敲除小鼠主動脈分離獲取并培養(yǎng)(參照方法見Jenna Lynn Ray，Rebecca Leach，Jean-Marc Herbert and Mark Benson，Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta.Methods CellSci.2001；23(4)185-8)。簡要介紹如下小鼠經(jīng)麻醉處死，用70％酒精溶液漂洗小鼠胸部和腹部，用手術(shù)外科剪打開胸腔充分暴露心臟和胸，腹主動脈。自左心室至腹主動脈分叉分離動脈并用消毒PBS溶液漂洗，將游離的主動脈放到消毒培養(yǎng)皿中并用1到2滴Fungizone溶液覆蓋固定.在顯微鏡下分離動脈壁外層組織，將動脈從Fungizone溶液中取出并放入一個新的培養(yǎng)皿中，并用一到兩滴DMEM培養(yǎng)液加10％FBS和1％抗菌素(Sigma)覆蓋。將動脈切割成細(xì)小的碎片，在組織培養(yǎng)箱內(nèi)把動脈碎片放入含有7.5毫克膠原酶的組織培養(yǎng)試管中，靜置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。6個小時后取出培養(yǎng)試管并輕輕搖動使館使細(xì)胞懸浮于3毫升細(xì)胞培養(yǎng)液中，再轉(zhuǎn)入一個15毫升試管中室溫下300g離心5分鐘。取出上清夜后，用5毫升新鮮培養(yǎng)液重懸并轉(zhuǎn)入25cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中靜置5天。5天后細(xì)胞可以傳代，用特異性抗體如α-smooth muscle actin(Sigma)證實(shí)平滑肌細(xì)胞。CD1基因敲除的平滑肌細(xì)胞由RT-PCR技術(shù)證實(shí)。
小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞分離. 野生型小鼠和CD1d基因敲除小鼠在CO2麻醉下腹腔內(nèi)注射礦物油3毫升。3到4天后小鼠經(jīng)海拉坦吸入麻醉處死。腹腔內(nèi)注射10毫升消毒用PBS液，收集腹腔灌洗液，離心后用RPMI 1640培養(yǎng)液加10％FBS and 1％抗菌素接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中。
CD1d基因轉(zhuǎn)染平滑肌細(xì)胞系的建立mCD1d cDNA克隆及平滑肌細(xì)胞SM22促進(jìn)子的構(gòu)建小鼠mCD1d自小鼠肝臟提取。小鼠肝臟總RNA用美國Qiagen公司的RNA提取試劑和提取，用以構(gòu)建初始鏈cDNA。mCD1d引物有意義鏈，5’-3’AACCCCAGAGCCTTTGTGTA，反意義鏈，5’-3’GAGGCCCTTGGAGTTATCATTA.LATaq多聚酶用以產(chǎn)生鈍端PCR產(chǎn)物。平滑肌細(xì)胞特異性促進(jìn)子SM22從含有SM22的pECFP-1vector中用Taq polymerase提取，引物序列前向引物序列Forward，5’-3’CACCGGATCCCATGTCCCAATCAGA，反向引物序列5’-3’GGGGCGCTGGCTGGGTGAGG1.表達(dá)質(zhì)粒的建立小鼠mCD1d基因構(gòu)建子連接到TOPO-4-Blunt-end克隆vector(Invitrogen)，EcoRI消化后克隆入pCMV/pIRES/dsRed表達(dá)vector中(Invitrogen)，pIRES/SM22表達(dá)質(zhì)粒的建立應(yīng)用PCR技術(shù)將SM22克隆出pECFP vector，引物序列正向引物序列，5’-3’CACCGGATCCCATGTCCCAATCAGA，反向引物序列，5’-3’GGGGCGCTGGCTGGGTGAGG1.然后將SM22PCR產(chǎn)物接入含有pIRES的vector中。新的目的基因產(chǎn)物SM22/mCD1d/pIRES用以轉(zhuǎn)染小鼠平滑肌細(xì)胞。
Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染SM22/mCD1d/pIRES轉(zhuǎn)染細(xì)胞系由Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染建立.將10微升lipofectamine稀釋到250微升無血清OptiMEM-1中線擱置一邊。然后，將4微克DNA質(zhì)粒稀釋到總量為250ul的無血清OptiMEM-1中室溫下孵育5分鐘。然后將250微升的lipofectamine和250微升的DNA質(zhì)粒稀釋液混合在一起。將此混合液常溫下孵育20分鐘后加入事先預(yù)備好的6孔培養(yǎng)皿中(7-8.0×105cells/孔).正常條件下孵育4到6個小時后，換新鮮的含有10％FBS和1％抗菌素的培養(yǎng)液中擔(dān)不除去lipofectamine混合液。24到48小時后可用熒光顯微鏡觀察，48小時后換用含有G418抗菌素的新鮮培養(yǎng)液以移除非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。直到只有陽性細(xì)胞存活并且開始增殖。目的基因的表達(dá)可用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)和定量PCR技術(shù)證實(shí)。
Western蛋白免疫標(biāo)記分析細(xì)胞經(jīng)過24小時通心絡(luò)劑量依賴處理(50，100，250，500and1000ug/ml)。細(xì)胞總蛋白由RIPA細(xì)胞裂解液加蛋白酶抑制劑裂解細(xì)胞獲得。蛋白電泳在12％SDS-PAGE(BioRad)上分離蛋白后轉(zhuǎn)到PVDF膜上(Millipore)，小鼠單克隆抗體PPARγ孵育并顯色。
Electrophoretic Mobility Gel Shift分析核蛋白自處理和非處理的野生型，CD1基因敲除以及CD1d轉(zhuǎn)染的血管平滑肌細(xì)胞中提取。細(xì)胞收集并用Ultra-Turrax T25-tissuehomogenizer(Janke and Kunkel)裂解細(xì)胞在低鹽溶液中(0.6％Nonidet P-40，150mM氯化鈉，10mM HEPES，pH7.9，1mM EDTA，0.5mM phenylmethyl sulfonyl fluoride)，2000rpm離心30秒。取上清夜放置冰上，5000rpm離心5分鐘。將沉淀物用高鹽溶液(25％glycerol；20mM HEPES，pH7.9；420mM NaCl；1.2mM MgCl2；0.2mM EDTA；0.5mM dithiothreitol；0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride；2mM benzamidine；5g/ml each aprotinin，leupeptin，and pepstatin)重懸。蛋白濃度測定采用Bio-Rad公司蛋白濃度測定盒測定。人工合成的雙聯(lián)多肽鏈PPARγmotif(5’-GATCTGTGACCTTTGTCCTAGTAAG-3’and 5’-CTTACTAGGACAAAGGTCACAGATC-3’.)用[gamma-32P]ATP標(biāo)記，蛋白電泳根據(jù)Promega公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。
結(jié)果

圖1.粗制粉和超微粉TXL處理野生型小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞24小時后PPAR gamma蛋白表達(dá)。小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞收集及培養(yǎng)見方法上述。接種于6孔培養(yǎng)板，70-80％融合后換用無血清PRMI1640培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)，分別用通心絡(luò)粗制粉和超微粉劑量依賴式處理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小時后收集細(xì)胞并用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Western蛋白電泳常規(guī)，蛋白轉(zhuǎn)膜后用小鼠單克隆抗體抗PPARγ抗體隔夜孵育，ECL免疫標(biāo)記曝光沖洗照片。結(jié)果顯示超微粉通心絡(luò)均可劑量依賴式促進(jìn)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞PPARγ表達(dá)，但是粗制粉通心絡(luò)沒有明顯的劑量依賴式促進(jìn)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞PPARγ表達(dá)。用β-actin作為內(nèi)參照證實(shí)各樣本總蛋白一致。經(jīng)過計(jì)算機(jī)條帶密度掃描并用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后證實(shí)超微粉通心絡(luò)比粗制粉通心絡(luò)可以明顯的劑量依賴式促進(jìn)小鼠小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞PPARγ表達(dá)。
圖2.粗制粉和超微粉TXL處理CD1d基因敲除小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞24小時后PPAR gamma蛋白表達(dá)。CD1d基因敲除小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞收集及培養(yǎng)見方法上述。接種于6孔培養(yǎng)板，70-80％融合后換用無血清PRMI 1640培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)，分別用通心絡(luò)粗制粉和超微粉劑量依賴式處理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小時后收集細(xì)胞并用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Western蛋白電泳常規(guī)，蛋白轉(zhuǎn)膜后用小鼠單克隆抗體抗PPARγ抗體隔夜孵育，ECL免疫標(biāo)記曝光沖洗照片。結(jié)果顯示超微粉通心絡(luò)均可劑量依賴式促進(jìn)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞PPARγ表達(dá)，但是粗制粉通心絡(luò)沒有明顯的劑量依賴式促進(jìn)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞PPARγ表達(dá)。用β-actin作為內(nèi)參照證實(shí)各樣本總蛋白一致。經(jīng)過計(jì)算機(jī)條帶密度掃描并用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后證實(shí)超微粉通心絡(luò)比粗制粉通心絡(luò)可以明顯地劑量依賴式促進(jìn)小鼠腹腔巨嗜細(xì)胞PPARγ表達(dá)。
圖3.粗制粉TXL處理CD1d基因轉(zhuǎn)染的平滑肌細(xì)胞24小時后PPAR gamma蛋白表達(dá)。CD1d轉(zhuǎn)染的小鼠動脈平滑肌細(xì)胞分離后傳代至6-9代，接種于6孔培養(yǎng)板，70-80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)，分別用通心絡(luò)粗制粉劑量依賴式處理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小時后收集細(xì)胞并用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Western蛋白電泳常規(guī)，蛋白轉(zhuǎn)膜后用小鼠單克隆抗體抗PPARγ抗體隔夜孵育，ECL免疫標(biāo)記曝光沖洗照片。結(jié)果顯示粗制粉通心絡(luò)在野生型動脈平滑肌細(xì)胞和CD1d基因轉(zhuǎn)染的小鼠動脈平滑肌細(xì)胞中均沒有明顯的劑量依賴式促進(jìn)平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)。用β-actin作為內(nèi)參照證實(shí)各樣本總蛋白一致。經(jīng)過計(jì)算機(jī)條帶密度掃描并用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后證實(shí)粗制粉通心絡(luò)沒有明顯的劑量依賴式促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)。
圖4.超微粉TXL處理CD1d基因轉(zhuǎn)染的平滑肌細(xì)胞24小時后PPAR gamma蛋白表達(dá)。CD1d轉(zhuǎn)染的小鼠動脈平滑肌細(xì)胞分離后傳代至6-9代，接種于6孔培養(yǎng)板，70-80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)，分別用通心絡(luò)超微粉劑量依賴式處理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小時后收集細(xì)胞并用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Western蛋白電泳常規(guī)，蛋白轉(zhuǎn)膜后用小鼠單克隆抗體抗PPARγ抗體隔夜孵育，ECL免疫標(biāo)記曝光沖洗照片。結(jié)果顯示超微粉通心絡(luò)均可劑量依賴式促進(jìn)小鼠野生型和CD1d基因轉(zhuǎn)染的動脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)，用β-actin作為內(nèi)參照證實(shí)各樣本總蛋白一致。經(jīng)過計(jì)算機(jī)條帶密度掃描并用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后證實(shí)超微粉通心絡(luò)比粗制粉通心絡(luò)可以明顯的劑量依賴式促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)，而粗制粉通心絡(luò)則沒有明顯的劑量依賴式促進(jìn)平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)。
圖5.粗制粉和超微粉TXL處理野生型小鼠動脈平滑肌細(xì)胞24小時后PPAR gamma蛋白表達(dá)。野生型小鼠動脈平滑肌細(xì)胞分離后傳代至6-9代，接種于6孔培養(yǎng)板，70-80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)，分別用通心絡(luò)粗制粉和超微粉劑量依賴式處理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小時后收集細(xì)胞并用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Western蛋白電泳常規(guī)，蛋白轉(zhuǎn)膜后用小鼠單克隆抗體抗PPARγ抗體隔夜孵育，ECL免疫標(biāo)記曝光沖洗照片。結(jié)果顯示超微粉通心絡(luò)可劑量依賴式促進(jìn)小鼠動脈平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)。β-actin作為內(nèi)參照表明通心絡(luò)對骨架蛋白表達(dá)無影響，且各樣本總蛋白一致。經(jīng)過計(jì)算機(jī)條帶密度掃描并用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后證實(shí)粗制粉通心絡(luò)可以促進(jìn)小鼠動脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)，但其劑量依賴性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義；而超微粉通心絡(luò)比粗制粉通心絡(luò)明顯(＞2folds)有更強(qiáng)促進(jìn)小鼠血管平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)的作用。
圖6.粗制粉和超微粉TXL處理CD1d基因敲除小鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞24小時后PPARγ蛋白表達(dá)。CD1d基因敲除小鼠動脈平滑肌細(xì)胞分離后傳代至6-9代，接種于6孔培養(yǎng)板，70-80％融合后換用無血清DMEM培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)，分別用通心絡(luò)粗制粉和超微粉劑量依賴式處理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小時后收集細(xì)胞并用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。Western蛋白電泳常規(guī)，蛋白轉(zhuǎn)膜后用小鼠單克隆抗體抗PPARγ抗體隔夜孵育，ECL免疫標(biāo)記曝光沖洗照片。結(jié)果顯示超微粉通心絡(luò)可劑量依賴式促進(jìn)CD1d基因小鼠動脈平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá).β-actin作為內(nèi)參照表明通心絡(luò)對骨架蛋白表達(dá)無影響，且各樣本總蛋白一致。經(jīng)過計(jì)算機(jī)條帶密度掃描并用β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后證實(shí)粗制粉通心絡(luò)可以促進(jìn)CD1d基因小鼠動脈平滑肌細(xì)胞PPARγ蛋白表達(dá)，但其劑量依賴性沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義；而超微粉通心絡(luò)比粗制粉通心絡(luò)明顯(＞3folds)有更強(qiáng)促進(jìn)CD1d基因小鼠血管平滑肌細(xì)胞PPARγ表達(dá)的作用。
圖7.CD1d基因敲除小鼠動脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)過通心絡(luò)(1000ug/ml)處理后提取核蛋白電泳試驗(yàn)。野生型小鼠動脈平滑肌細(xì)胞和CD1d基因敲除小鼠動脈平滑肌細(xì)胞分離后傳代至6-9代，接種與250mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，等到80％-90％融合后用無血清培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)。超微粉通心絡(luò)(1000ug/ml)處理細(xì)胞24小時后用Panomics公司提供的細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。并用美國Promega公司提供的Gel shift assay試劑盒用32P-ATP標(biāo)記工合成的雙鏈PPARγ多肽鏈。32P-ATP標(biāo)記的雙鏈PPARγ多肽鏈與核蛋白的結(jié)合反應(yīng)也根據(jù)Promega公司提供的Gel shift assay試劑盒進(jìn)行。蛋白與多肽鏈的電泳實(shí)驗(yàn)在4℃條件下在TBE膠中進(jìn)行。結(jié)果顯示CD1d基因敲除小鼠動脈平滑肌細(xì)胞核蛋白中有較明顯的PPARγ蛋白表達(dá)，尤其是經(jīng)過超微粉通心絡(luò)處理后的血管平滑肌細(xì)胞。結(jié)果提示經(jīng)過超微粉通心絡(luò)處理后的CD1d基因敲除小鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞核內(nèi)比野生型小鼠動脈平滑肌細(xì)胞有更多的PPARγ蛋白自核外轉(zhuǎn)移至核內(nèi)并結(jié)合與DNA上PPRE從而激活更多的下游基因，從而發(fā)揮其藥理特性。
圖8.CD1d基因轉(zhuǎn)染的小鼠動脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)過通心絡(luò)(1000ug/ml)處理后提取核蛋白電泳試驗(yàn)。野生型小鼠動脈平滑肌細(xì)胞和CD1d基因轉(zhuǎn)染的小鼠動脈平滑肌細(xì)胞分離后傳代至6-9代，接種與250mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，等到80％-90％融合后用無血清培養(yǎng)液隔夜培養(yǎng)。超微粉通心絡(luò)(1000ug/ml)處理細(xì)胞24小時后用Panomics公司提供的細(xì)胞核蛋白提取試劑盒提取核蛋白。并用美國Promega公司提供的Gel shift assay試劑盒用32P-ATP標(biāo)記工合成的雙鏈PPARγ多肽鏈。32P-ATP標(biāo)記的雙鏈PPARγ多肽鏈與核蛋白的結(jié)合反應(yīng)也根據(jù)Promega公司提供的Gel shift assay試劑盒進(jìn)行。蛋白與多肽鏈的電泳實(shí)驗(yàn)在4℃條件下在TBE膠中進(jìn)行。結(jié)果顯示CD1d基因轉(zhuǎn)染的小鼠動脈平滑肌細(xì)胞核蛋白中有較明顯的PPARγ蛋白表達(dá)，尤其是經(jīng)過超微粉通心絡(luò)處理后的血管平滑肌細(xì)胞。結(jié)果提示經(jīng)過超微粉通心絡(luò)處理后的CD1d基因轉(zhuǎn)染的小鼠動脈血管平滑肌細(xì)胞核內(nèi)比野生型小鼠動脈平滑肌細(xì)胞有更多的PPARγ蛋白自核外轉(zhuǎn)移至核內(nèi)并結(jié)合與DNA上PPRE從而激活更多的下游基因，從而發(fā)揮其藥理特性。
權(quán)利要求
1.一種超微通心絡(luò)中藥組合物，其特征在于它一種超微通心絡(luò)中藥組合物，它是由5-30um藥粉細(xì)度的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鱉蟲和蟬蛻五味蟲類藥粉，冰片和乳香藥粉，降香和檀香提取揮發(fā)油的藥材的揮發(fā)油；將降香和檀香的藥渣再用水提??；赤芍和酸棗仁用水提取的藥材加水煎煮，水提液過濾后，待濃縮成浸膏；人參用乙醇先提后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，濃縮成醇提浸膏；水提液過濾與所有的水提液混勻后濃縮成水提浸膏組成。
2.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，可通過降低家兔實(shí)驗(yàn)性動脈粥樣硬化血清膽固醇，抗氧化等途徑，減輕動脈粥樣硬化后血管內(nèi)皮損傷。
3.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，能顯著縮小AMI再灌注后無再流面積和梗死范圍。
4.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，對5-HT誘導(dǎo)的豬冠脈痙攣有明顯的解痙作用，同時對IL-1包裹部位血管管腔狹窄也有明顯的抑制作用。
5.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，可通過抑制血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)等途徑抑制高脂血癥及動脈粥樣硬化的發(fā)生，同時對已形成的動脈粥樣硬化有明顯的穩(wěn)定作用。
6.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，對高脂飲食合并血管成形術(shù)后血脂和血管管腔狹窄有明顯的改善作用。
7.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，可明顯升高垂體后葉素致小鼠心肌合血漿NO下降和eNOS表達(dá)下降。
8.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，可不同程度地降低梗死區(qū)與非梗死區(qū)膠原含量，降低心肌局部的Ang II水平，改善超微結(jié)構(gòu)的病理變化。通心絡(luò)超微粉可通過抑制心肌膠原的合成達(dá)到干預(yù)重構(gòu)的目的。
9.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，能有效改善MCAO大鼠的缺血損傷。
10.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，可通過促VEGF表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而保護(hù)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)毛細(xì)血管新生。
11.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，對II期內(nèi)痔、混合痔兩種類型痔瘡有很好的臨床療效。
12.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，對月桂酸引起血栓閉塞性脈管炎有良好的預(yù)防及治療作用。
13.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，對家兔髂股動脈粥樣硬化閉塞癥有良好的治療作用。
14.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，可抑制血小板聚集；超微粉通心絡(luò)對正常大鼠纖溶活性有一定程度提高；超微粉通心絡(luò)可明顯降低血瘀癥大鼠血漿粘度，增高其紅細(xì)胞變形能力。
15.按權(quán)利要求1所述的中藥組合物，在促進(jìn)脂質(zhì)調(diào)控基因PPARγ表達(dá)，尤其是在缺失CD1d蛋白的細(xì)胞中該基因的表達(dá)表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物學(xué)活性。
全文摘要
一種超微通心絡(luò)中藥組合物，其新的臨床用途包括減輕動脈粥樣硬化后血管內(nèi)皮損傷；能縮小AMI再灌注后無再流面積和梗死范圍；對豬冠脈痙攣有明顯的解痙作用，同時對管腔狹窄也有明顯的抑制作用；抑制高脂血癥及動脈粥樣硬化的發(fā)生；對血管管腔狹窄有明顯的改善作用；可使小鼠心肌合血漿NO下降和eNOS表達(dá)下降；可通過抑制心肌膠原的合成達(dá)到抑制心梗后心室重構(gòu)的目的；有效改善MCAO大鼠的缺血損傷；可促VEGF表達(dá)上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖；對痔瘡具有良好治療效果；對血栓閉塞性脈管炎動脈粥樣硬化閉塞癥有良好療效。可抑制血小板聚集；提高大鼠纖溶活性；降低血瘀癥大鼠血漿粘度；在促進(jìn)脂質(zhì)調(diào)控基因PPARγ表達(dá)表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物學(xué)活性。
文檔編號A61P7/00GK1954825SQ200510114728
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月26日
發(fā)明者吳以嶺, 耿永健 申請人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司