專利名稱：以脲烷鍵連接的peg－w結(jié)合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用聚乙二醇(簡(jiǎn)稱PEG)對(duì)W(W是GCSF或GMCSF)進(jìn)行化學(xué)修飾得到的PEG-W結(jié)合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)或粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)是一種藥學(xué)上的活性蛋白，所述蛋白調(diào)節(jié)嗜中性粒細(xì)胞的增殖、分化和機(jī)能的激活(Metcalf，Blood 67257(1986)；Yan等，Blood84(3)795-799(1994))。GCSF可用于各種白細(xì)胞減少癥，它可以使干細(xì)胞和前體細(xì)胞從骨髓轉(zhuǎn)移(mobilization)，并且用于治療由于化學(xué)療法引起的粒細(xì)胞減少患者，或用作骨髓移植的前序。
蛋白治療藥物(如GCSF)的生物利用度通常受血漿半衰期的限制，并且對(duì)蛋白酶降解敏感，阻礙了最大的臨床潛能。市售GCSF(或GMCSF)有短期的藥理學(xué)作用，且在白細(xì)胞減少狀態(tài)的持續(xù)期間通常必須一天給藥一次以上，這給病人帶來很大痛苦。
對(duì)于增加蛋白循環(huán)半衰期的一個(gè)途徑就是降低蛋白的清除率，尤其是降低腎臟的清除率和受體介導(dǎo)的清除率。這可以通過將蛋白與能增加表觀分子量的化學(xué)組分結(jié)合，從而降低腎臟的清除作用，增加蛋白藥物分子在體內(nèi)半衰期來實(shí)現(xiàn)。此外，蛋白藥物結(jié)合一個(gè)化學(xué)組分可以有效地阻斷蛋白裂解性酶與蛋白的物理接觸，由此可以使蛋白免遭非特異性蛋白水解作用的降解。臨床研究表明，聚乙二醇是對(duì)人體安全的高分子聚合物，通過將PEG與蛋白藥物結(jié)合可以降低免疫原性并延長(zhǎng)半衰期(參見Enzon，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US990/02133)；Nitecki等，美國(guó)專利4,902,502；國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US85/02572)。
具有與本發(fā)明結(jié)合物結(jié)構(gòu)不同的PEG-GCSF結(jié)合物有國(guó)際申請(qǐng)專利PCT/US00/01264。
本發(fā)明的PEG-W結(jié)合物活性高，在體內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)，延長(zhǎng)了血漿半衰期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的PEG-W結(jié)合物是以脲烷鍵與PEG分子連接的W。由于PEG是以帶有鏈長(zhǎng)分布的混合物的形式制備的，因此，PEG的分子量一般是指其平均分子量。這種聚合物的制備方法在本研究領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的。
本發(fā)明技術(shù)方案如下以脲烷鍵連接的PEG-W結(jié)合物，其特征是它是分子量為5000-30000 daltons的聚乙二醇以脲烷鍵修飾的W，具有如下結(jié)構(gòu)式
式中，mPEG是聚乙二醇鏈，W是一種粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)或者是粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)。
上述的PEG-W結(jié)合物的制備方法由下列步驟組成步驟1，將W以50mM，pH4.0～6.0的醋酸鈉緩沖溶液溶解，配制成濃度為0.2～10mg/ml的溶液；步驟2，修飾反應(yīng)。按W∶PEG為1∶0.5～80物質(zhì)的量之比加入SC-mPEG，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到5.0～10.0之間，在0～37℃條件下反應(yīng)0.5～24小時(shí)，SC-mPEG有如下結(jié)構(gòu) 式中，mPEG是聚乙二醇鏈；步驟3，加入甘氨酸終止反應(yīng)；步驟4，將上述反應(yīng)液以10倍體積的50mM pH4.5～6.0的醋酸鈉緩沖液稀釋，然后將反應(yīng)混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52)柱；然后用0.2～1.0M的氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫，用波長(zhǎng)280nm和214nm同時(shí)檢測(cè)，收集PEG-W結(jié)合物的洗脫液。
步驟5，以Sephacryl S-200凝膠色譜對(duì)步驟4得到的PEG-W結(jié)合物進(jìn)一步純化，洗脫液為pH＝7.0的磷酸緩沖液(含0.15M NaCl)，用波長(zhǎng)280nm和214nm同時(shí)檢測(cè)，收集含PEG-W結(jié)合物的洗脫液。
本發(fā)明的PEG-W結(jié)合物活性高，在體內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)，血漿半衰期達(dá)到30～80小時(shí)，可以用于制備治療白細(xì)胞減少癥的藥物中。
從反應(yīng)混合物中分離PEG-W結(jié)合物是本發(fā)明的重要內(nèi)容之一。由于反應(yīng)混合物中不同的產(chǎn)物具有不同的等電點(diǎn)及分子量，這些產(chǎn)物可用傳統(tǒng)的色譜方法進(jìn)行分離。在W上同一個(gè)自由氨基上連接單個(gè)PEG分子是本發(fā)明優(yōu)選方案。W有多個(gè)自由氨基可以與PEG反應(yīng)，但可以通過控制PEG與W的配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)液pH及其離子強(qiáng)度等反應(yīng)條件來主要獲得單修飾PEG-W結(jié)合物(即一個(gè)分子W與單個(gè)分子PEG連接的產(chǎn)物)。然后通過分離制備高純度單修飾PEG-W結(jié)合物。


圖1為實(shí)施例5的SDS-PAGE電泳檢測(cè)譜圖，其中第1條帶未修飾GCSF；第2條帶反應(yīng)混合物；第3條帶單修飾PEG-GCSF結(jié)合物(聚乙二醇Mw＝20000)；第4條帶標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.單修飾PEG-GCSF結(jié)合物的制備將GCSF以5mM pH4.5的醋酸鈉緩沖液溶解，配制成為2mg/ml的溶液；按GCSF∶PEG為1∶10的物質(zhì)的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝20000)，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.0，在25℃下反應(yīng)5小時(shí)，加入0.5M甘氨酸0.5ml終止反應(yīng)；5分鐘后，用6倍體積的20mM pH4.5的醋酸鈉緩沖液稀釋反應(yīng)液；將稀釋后的反應(yīng)液上羧甲基纖維素(Waters CM-52)柱，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩沖液沖洗柱子后，用含04M的氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含單修飾PEG-GCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。以Sephacryl S-200對(duì)PEG-GCSF結(jié)合物進(jìn)一步純化，洗脫液是pH6.8的磷酸鈉緩沖液(含0.15M NaCl)，收集含單修飾PEG-GCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果見圖1。
實(shí)施例2.單修飾PEG-GCSF結(jié)合物的制備將GCSF以5mM pH5.0的醋酸鈉緩沖液溶解，配制成為6mg/ml的溶液；按GCSF∶PEG為1∶20的物質(zhì)的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝10000)，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到7.5，在25℃下反應(yīng)1小時(shí)，加入0.5M甘氨酸0.5ml終止反應(yīng)；5分鐘后，用10倍體積的20mM pH5.0的醋酸鈉緩沖液稀釋反應(yīng)液；將稀釋后的反應(yīng)液上羧甲基纖維素柱(Waters CM-52)，以5倍體積pH5.0的醋酸鈉緩沖液沖洗柱子后，用含0.35M的氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含單修飾PEG-GCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。以Sephacryl S-200對(duì)PEG-GCSF結(jié)合物進(jìn)一步純化，洗脫液是pH6.8的磷酸鈉緩沖液(含0.15M NaCl)，收集含單修飾PEG-GCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
實(shí)施例3.單修飾PEG-GMCSF結(jié)合物的制備將GMCSF以5mM pH5.0的醋酸鈉緩沖液溶解，配制成為2mg/ml的溶液；按GMCSF∶PEG為1∶10的物質(zhì)的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝5000)，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在25℃下反應(yīng)2小時(shí)，加入0.5M甘氨酸0.6ml終止反應(yīng)；5分鐘后，用10倍體積的20mM pH5.0的醋酸鈉緩沖液稀釋反應(yīng)液；將稀釋后的反應(yīng)液上羧甲基纖維素柱(Waters CM-52)，以5倍體積pH5.0的醋酸鈉緩沖液沖洗柱子后，用含0.25M的氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含單修飾PEG-GMCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。以Sephacryl S-200對(duì)PEG-GMCSF結(jié)合物進(jìn)一步純化，洗脫液是pH6.8的磷酸鈉緩沖液(含0.15MNaCl)，收集含單修飾PEG-GMCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
實(shí)施例4.單修飾PEG-GMCSF結(jié)合物的制備將GMCSF以5mM pH 4.0的醋酸鈉緩沖液溶解，配制成為9mg/ml的溶液；按GMCSF∶PEG為1∶40的物質(zhì)的量之比加入mPEG-NHS(Mw＝20000)，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到8.5，在25℃下反應(yīng)12小時(shí)，加入0.5M甘氨酸0.4ml終止反應(yīng)；5分鐘后，用10倍體積的20mM pH5.0的醋酸鈉緩沖液稀釋反應(yīng)液；將稀釋后的反應(yīng)液上羧甲基纖維素柱(Waters CM-52)，以5倍體積pH5.0的醋酸鈉緩沖液沖洗柱子后，用含0.4M的氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含單修飾PEG-GMCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。以Sephacryl S-200對(duì)PEG-GMCSF結(jié)合物進(jìn)一步純化，洗脫液是pH6.8的磷酸鈉緩沖液(含0.15MNaCl)，收集含單修飾PEG-GMCSF結(jié)合物的洗脫液，以SDS-PAGE電泳檢測(cè)。
實(shí)施例5SDS-PAGE電泳法對(duì)產(chǎn)物的檢測(cè)將收集的各洗脫峰濃縮，采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)，分離膠10％，濃縮膠5％。電泳結(jié)束后，將膠體浸入裝有固定液(30％甲醇、5％乙酸)的培養(yǎng)皿中，在搖動(dòng)下室溫浸泡5分鐘；取出膠體，浸入染色液中室溫?fù)u動(dòng)浸泡45分鐘(染色液是0.05％考馬斯亮藍(lán)G-250，30％甲醇，5％乙酸水溶液)；最后，將膠體移入脫色液中室溫?fù)u動(dòng)浸泡直至樣品條帶清晰為止(結(jié)果見圖1)。這里脫色液為1％戊二醛、30％甲醇、5％乙酸。
權(quán)利要求
1.以脲烷鍵連接的PEG-W結(jié)合物，其特征是它是分子量為5000-30000道爾頓的聚乙二醇以脲烷鍵修飾的W，具有如下結(jié)構(gòu)式 式中，mPEG是聚乙二醇鏈，W是一種粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)或者是一種粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)。
2.權(quán)利要求1所述PEG-W結(jié)合物的制備方法，其特征是它由下列步驟組成步驟1，將權(quán)利要求1所述的W以50mM，pH4.0～6.0的醋酸鈉緩沖溶液溶解，配制成濃度為0.2～10mg/ml的溶液步驟2，按W∶PEG為1∶0.5～80物質(zhì)的量之比加入NHS-mPEG，以氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到5.0～10.0之間，在0～37℃條件下反應(yīng)0.5～24小時(shí)，NHS-mPEG有如下結(jié)構(gòu) 式中，mPEG是聚乙二醇鏈；步驟3，加入甘氨酸終止反應(yīng)；步驟4，將上述反應(yīng)液以10倍體積的50mM pH4.0～6.0的醋酸鈉緩沖液稀釋，然后將反應(yīng)混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52)柱；然后用0.2～1.0M的氯化鈉的醋酸鈉緩沖液洗脫，收集含PEG-W結(jié)合物的洗脫液。步驟5，以Sephacryl S-200凝膠色譜對(duì)步驟4得到的PEG-W結(jié)合物進(jìn)一步純化，洗脫液為pH＝7.0的磷酸緩沖液(含0.15M NaCl)，收集含PEG-W結(jié)合物的洗脫液。
3.權(quán)利要求1所述的以脲烷鍵連接的PEG-W結(jié)合物在制備治療白細(xì)胞減少癥藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
以脲烷鍵連接的PEG－W結(jié)合物，其特征是它是分子量為5000－30000道爾頓的聚乙二醇(PEG)以脲烷鍵修飾的W，具有如右結(jié)構(gòu)式，式中，mPEG是聚乙二醇鏈，W是一種粒細(xì)胞集落刺激因子(GCSF)或者是一種粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GMCSF)。本發(fā)明的PEG－W結(jié)合物的抗病毒活性高，在體內(nèi)保留時(shí)間長(zhǎng)，血漿半衰期達(dá)到30～80小時(shí)。
文檔編號(hào)A61K47/48GK1966528SQ20051011493
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者蘇志國(guó), 馬光輝, 雷建都, 鄭春揚(yáng), 翟艷琴 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所