專利名稱：一種可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)模型技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及腫瘤血管形成模型的制備方法，特別是鼻咽癌血管形成模型的制備方法。
背景技術(shù)：
新生血管的生成是腫瘤得以生長(zhǎng)、發(fā)展的必備條件之一。當(dāng)前，定量分析腫瘤血管生成的方法多采用腫瘤微血管密度(microvascular density，MVD)計(jì)數(shù)等，主要是針對(duì)血管內(nèi)皮標(biāo)記的抗體，采用免疫組織化學(xué)方法來評(píng)價(jià)腫瘤的血管生成情況?？梢姡@是一項(xiàng)有創(chuàng)性的檢查，檢查的正確性依賴于組織取材是否準(zhǔn)確，且無法對(duì)同一腫瘤血管生成情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察。鑒于此，研究者們嘗試用影像學(xué)的方法如CT、MRI等來推斷活體內(nèi)腫瘤的血管生成，并取得了些有價(jià)值的結(jié)果，但是，總的說來，影像學(xué)技術(shù)要么有射線的損傷作用如CT，要么有外加對(duì)比劑的干擾作用如MRI，而且，這些儀器都比較昂貴，且必須專門人員操作，所以對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的普及是不現(xiàn)實(shí)的。
隨著當(dāng)前分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的巨大發(fā)展，無創(chuàng)傷成像技術(shù)(如小動(dòng)物的光成像)的不斷發(fā)展和完善及其他們的有機(jī)結(jié)合，20世紀(jì)90年代，“分子成像”應(yīng)運(yùn)而生。分子成像對(duì)于人們對(duì)腫瘤的認(rèn)識(shí)和研究意義重大，因此，美國(guó)國(guó)立癌癥研究所NCI(National CancerInstitute，NCI)將“腫瘤成像”列為1997-1998年度六個(gè)“重大科學(xué)機(jī)遇”之一。
鼻咽癌是居住在臺(tái)灣、香港、新加坡和我國(guó)南方的中國(guó)人群中最常見的一種腫瘤。我國(guó)南方幾省是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，發(fā)病率居世界首位，嚴(yán)重威脅著我國(guó)人們的健康。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種的可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，包括以下步驟第一步用熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；第二步用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞并離心富集，取105～106個(gè)活細(xì)胞懸液接種在裸鼠前腋皮下或爪墊。
本發(fā)明所述的熒光蛋白受激發(fā)光激發(fā)后，在熒光顯微鏡下可見明亮的熒光。常用的熒光蛋白有增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)、紅色熒光蛋白(RFP)等。本發(fā)明最好用增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白(EGFP)。
本發(fā)明所述的編碼綠色熒光蛋白(EGFP)的基因序列由Clontech公司的質(zhì)粒pEGFP-N1得到，結(jié)構(gòu)如圖1所示。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，鼻咽癌細(xì)胞是鼻咽癌細(xì)胞株5-8F、鼻咽癌細(xì)胞株6-10B、鼻咽癌細(xì)胞株CNE2其中一種。其中鼻咽癌細(xì)胞株5-8F是高成瘤、高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞株，中山大學(xué)引進(jìn)，鼻咽癌細(xì)胞株6-10B是成瘤但不轉(zhuǎn)移的鼻咽癌細(xì)胞株，中山大學(xué)引進(jìn)，鼻咽癌細(xì)胞株CNE2是從中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所引進(jìn)。
本發(fā)明可視化鼻咽癌模型的制備方法，第一步中，綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞的方法可以是如陽離子脂質(zhì)體法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法和使用基因槍轉(zhuǎn)染。本發(fā)明轉(zhuǎn)染最好是陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。
本發(fā)明所述的陽離子脂質(zhì)體法，是本領(lǐng)域常用的陽離子轉(zhuǎn)染方法，可以參考(Chishima T，Miyagi Y，Wang X，et al.Visualization of the metastatic process by green fluorescentprotein expression.Anticancer Res，1997；17(4A)2377-2384)。本發(fā)明所使用的陽離子脂質(zhì)體是LipofectamineTM2000(Invitrogen life technology)。還可以使用本領(lǐng)域已知的陽離子脂質(zhì)體?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法得到陽離子脂質(zhì)體優(yōu)選的使用用量和形式。
本發(fā)明所述的陽離子轉(zhuǎn)染法，具體含有以下步驟在微量離心管中準(zhǔn)備溶液A、B，其中A液組成為50μl OPTI-MEM和5μl lipofectamine2000，B液組成為50μl OPTI-MEM和3μg的質(zhì)粒pEGFP-N1。將A、B兩液混合后室溫放置半小時(shí)，然后將混合液滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，放置在37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染液，換不含抗生素的1640完全培養(yǎng)液；然后0.25％胰蛋白酶消化，稀釋培養(yǎng)，加入G418篩選，亞克隆獲得EGFP轉(zhuǎn)染的鼻咽癌細(xì)胞。
本發(fā)明所述的OPTI-MEM購(gòu)自Invitrogen life technology公司；lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen life technology公司；本發(fā)明所述的G418為新霉素，購(gòu)買于sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，胰蛋白酶，購(gòu)自Sigma公司。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，第二步中用作模型的脊椎動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，可以是家兔、大鼠、小鼠等常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。用作模型的脊椎動(dòng)物還可以是靈長(zhǎng)類動(dòng)物。本發(fā)明所述的脊椎動(dòng)物最好是裸鼠或SCID鼠。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法的一個(gè)較佳技術(shù)方案是采用陽離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞，接著加G418篩選，獲得EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞并離心富集，接種105～106個(gè)活細(xì)胞于裸鼠前腋皮下或爪墊。為了不影響細(xì)胞活性，必須將收集的細(xì)胞置于冰上，且整個(gè)過程在40分鐘內(nèi)完成。
本發(fā)明所述的可視化鼻咽癌模型的制備方法，第二步中，可視化鼻咽癌模型的熒光檢測(cè)是借助本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的儀器和方法。整體綠色熒光檢測(cè)是借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS實(shí)現(xiàn)的。
本發(fā)明所述的熒光檢測(cè)可以借助整體熒光成像系統(tǒng)適時(shí)跟蹤觀察皮下或爪墊腫瘤的生長(zhǎng)過程及腫瘤血管形成的情況。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1借助整體熒光成像系統(tǒng)觀察，可以適時(shí)跟蹤觀察皮下或爪墊腫瘤的生長(zhǎng)過程，這對(duì)于早期進(jìn)行腫瘤的治療研究具有開拓性的意義；2由于本發(fā)明可以適時(shí)跟蹤腫瘤的血管形成，作為初步篩選抑制腫瘤血管生成的藥物具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)探討通過抑制腫瘤血管生成來治療腫瘤將具有重要指導(dǎo)意義。


圖1質(zhì)粒pEGFP-N1結(jié)構(gòu)2EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B，熒光顯微鏡采集的圖片(放大400倍)。
圖3EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B裸鼠皮下接種5小時(shí)后，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖4EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B裸鼠皮下接種48小時(shí)后，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖5EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B裸鼠皮下接種4天后，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖6EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B裸鼠皮下接種7天后，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖7EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B裸鼠皮下接種23天后，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖8EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B裸鼠皮下接種40天后，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖9EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F，熒光顯微鏡采集的圖片(放大400倍)。
圖10EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F裸鼠爪墊瘤體血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖11EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F裸鼠皮下瘤體血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖12EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2，熒光顯微鏡采集的圖片(放大400倍)。
圖13EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2裸鼠皮下接種后的7天血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖14EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2裸鼠皮下接種后的10天血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖15EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2裸鼠皮下接種后的14天血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖16EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2裸鼠皮下接種后的20天血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖17EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2裸鼠皮下接種后的25天血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
圖18EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2裸鼠皮下接種后的35天血管圖，整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS采集的圖片。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，但不限于所述實(shí)施例。
實(shí)施例1可適時(shí)跟蹤觀察鼻咽癌生長(zhǎng)模型的制備第一步制備EGFP轉(zhuǎn)染人鼻咽癌細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染前24小時(shí)分別將鼻咽癌細(xì)胞6-10B按2×105接種于24孔板中，含15％小牛血清、無抗生素的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％融合度時(shí)棄培養(yǎng)基，用不含血清的1640液洗滌細(xì)胞2次，再加1ml不含血清的1640繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約90％以上融合度時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在微量離心管中準(zhǔn)備溶液A、B。A液50μl OPTI-MEM+5μl lipofectamine2000；B液50μl OPTI-MEM+3μg質(zhì)粒pEGFP-N1。將A、B兩液混合后室溫放置半小時(shí)，然后將混合液均勻滴加在轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面，顛倒混勻，放置37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)，棄去轉(zhuǎn)染液，換不含抗生素的1640完全培養(yǎng)液。
24小時(shí)后，將24孔板中的細(xì)胞用0.25％胰酶消化后，按1∶5轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)，24小時(shí)待細(xì)胞貼壁后，倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)量，當(dāng)100倍放大時(shí)，每個(gè)視野中發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)不少于5個(gè)時(shí)，進(jìn)行G418抗性篩選，逐步提高G418濃度500-2000μg/ml，10-15天后，停止用藥；待G418抗性克隆長(zhǎng)至肉眼可見大小時(shí)，挑選表達(dá)GFP的陽性克隆于24孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)，倒置熒光顯微鏡觀察其是否繼續(xù)發(fā)出綠色熒光，對(duì)表達(dá)GFP的人鼻咽癌細(xì)胞株陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，繼續(xù)倒置熒光顯微鏡觀察熒光，獲得非G418依賴的EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2。其倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示。
第二步EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B皮下接種在小鼠上。
EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞6-10B生長(zhǎng)至90％左右時(shí)，0.25％胰酶消化，血球記數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，500rpm離心3分鐘濃縮細(xì)胞，加適量預(yù)冷的無血清1640原液調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，接種0.08ml細(xì)胞懸液于(含105～106個(gè)活細(xì)胞)5～6周齡的裸鼠前腋皮下。為了不影響細(xì)胞活性，必須將收集的細(xì)胞置于冰上，且40分鐘內(nèi)完成。
適時(shí)跟蹤觀察裸鼠皮下鼻咽癌生長(zhǎng)過程借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS適時(shí)跟蹤觀察鼻咽癌細(xì)胞裸鼠接種后5小時(shí)觀察，即可見直徑約0.4cm彌散的熒光團(tuán)，見圖3；2天后，彌散的熒光團(tuán)明顯縮小、集中，約0.2cm左右，見圖4；4天后，熒光團(tuán)的熒光呈現(xiàn)明顯集中的趨勢(shì)，大小仍然約0.2cm左右，沒有明顯變化，見圖5；第七天觀察，可見GFP腫瘤明顯生長(zhǎng)、擴(kuò)大，見圖6；第23天觀察，可見GFP腫瘤明顯生長(zhǎng)、擴(kuò)大，見圖7；40天后，處死，見圖8。從圖3～8可看出，隨著時(shí)間推移，瘤體的形成、生長(zhǎng)、發(fā)展過程，可適時(shí)跟蹤觀察。
實(shí)施例2一、可視化鼻咽癌血管形成模型的建立第一步制備EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F。
同實(shí)施例1，獲得非G418依賴的EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F。見圖9。
第二步EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F在裸鼠爪墊接種。
EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞5-8F生長(zhǎng)至90％左右時(shí)，0.25％胰酶消化，血球記數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，500rpm離心3分鐘濃縮細(xì)胞，加適量預(yù)冷的無血清1640原液調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，裸鼠后肢爪墊內(nèi)側(cè)皮下接種0.05ml(含105～106個(gè)活細(xì)胞)40分鐘內(nèi)完成。
二、可視化鼻咽癌血管形成模型的觀察結(jié)果。
早期荷瘤裸鼠的生活、活動(dòng)狀態(tài)沒有明顯影響，借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS觀察，在明亮熒光腫瘤的襯托下，誘生的新生血管清晰可辨，“黑色蜘蛛網(wǎng)”布滿瘤體。熒光觀察結(jié)果見圖10、11。
實(shí)施例3一、適時(shí)跟蹤觀察鼻咽癌血管形成模型的建立第一步制備EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2。
同實(shí)施例1，獲得非G418依賴的EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2。見圖12。
第二步EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE2在裸鼠皮下接種。
接種方法同實(shí)施例1。
二、可視化鼻咽癌血管形成模型的觀察結(jié)果。
早期荷瘤裸鼠的生活、活動(dòng)狀態(tài)沒有明顯影響，借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS觀察，在明亮熒光腫瘤的襯托下，誘生的新生血管清晰可辨，“黑色蜘蛛網(wǎng)”布滿瘤體。
借助整體熒光成像系統(tǒng)LT-9MACIMSYSPLUS，對(duì)同一腫瘤的血管形成進(jìn)行長(zhǎng)期適時(shí)跟蹤觀察。熒光觀察結(jié)果第7天，見圖13；第10天，見圖14；第14天，見圖15；第20天，見圖16；第25天，見圖17；第35天，見圖18；從圖13-18可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，血管的數(shù)量、密度和總長(zhǎng)度呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，包括以下步驟首先用綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；然后用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞并離心富集，取105～106個(gè)活細(xì)胞懸液接種在裸鼠前腋皮下或爪墊，建立可視化鼻咽癌血管形成模型，以適時(shí)跟蹤腫瘤的生長(zhǎng)及腫瘤血管的形成。
2.權(quán)利要求1所述的可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，其特征是所用的鼻咽癌細(xì)胞是6-10B、CNE2、5-8F其中一種。
3.權(quán)利要求1所述的可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，其特征是綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞方法是陽離子脂質(zhì)體法。
4.權(quán)利要求1、2或3所述的可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，含有以下步驟采用陽離子脂質(zhì)體法將質(zhì)粒pEGFP-N1導(dǎo)入鼻咽癌細(xì)胞，接著加G418篩選，獲得EGFP轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染細(xì)胞并離心富集，接種105～106個(gè)活細(xì)胞于裸鼠前腋皮下或爪墊。
全文摘要
本發(fā)明為一種可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，涉及醫(yī)學(xué)模型技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明可視化鼻咽癌血管形成模型的制備方法，包括以下步驟首先用綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞；然后用胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞并離心富集，取10
文檔編號(hào)A61K49/00GK1824330SQ20051012087
公開日2006年8月30日 申請(qǐng)日期2005年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月28日
發(fā)明者姚開泰, 丁彥青, 劉騰飛, 任彩萍 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)