專利名稱：：復(fù)合鼠疫疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于人或動物免受鼠疫桿菌感染的免疫預(yù)防的鼠疫疫苗，特別適合于正常人群的免疫預(yù)防，也涉及所述疫苗的制備方法。具體而言，所述疫苗含鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物與鼠疫桿菌V抗原，可選還包含鼠疫桿菌F1抗原。
背景技術(shù)：
：鼠疫是一種以蚤類為媒介的人畜共患病，其病原體是鼠疫耶爾森菌(也稱為鼠疫桿菌)。世界上曾經(jīng)有三次鼠疫大流行，在1348年歐洲爆發(fā)的第二次流行中，歐洲有三成人口死亡。過去的鼠疫大流行中，共有上億人死于鼠疫?，F(xiàn)在人間鼠疫已不多見，但鼠間鼠疫還很猖獗。世界范圍內(nèi)鼠疫自然疫源地并未縮小，加上經(jīng)濟差異造成各國衛(wèi)生條件參差不齊，因此不能排除局部地區(qū)，特別是貧困地區(qū)爆發(fā)鼠疫的可能性。近年來鼠疫疫情仍時有發(fā)生，雖然抗生素能有效治療腺鼠疫，但由于肺鼠疫和敗血癥型鼠疫病情進(jìn)展迅速，即使使用抗生素死亡率仍很高，可達(dá)50%。此外，鼠疫桿菌還可能被生物恐怖者作為生物戰(zhàn)劑之一。可見，鼠疫仍然是一個關(guān)系到公共健康的問題。傳統(tǒng)的鼠疫疫苗有兩種。一種是滅活全菌體死疫苗，早在1897年Haffkine在印度制出了死疫苗。它的缺點是疫苗價格昂貴；保護期短，每年需加強注射；副反應(yīng)高，局部反應(yīng)發(fā)生率為11%24%，全身反應(yīng)發(fā)生率為4%6%。另一種是減毒活疫苗，減毒活疫苗自1908年開始應(yīng)用，是由鼠疫強毒株分化而來的Pgm-菌株，在人工培養(yǎng)基中(如剛果紅培養(yǎng)基)不能吸收色素，所以為Pgm-。我國于1954年自前蘇聯(lián)引進(jìn)EV弱毒株，選用皮下注射，在使用中發(fā)現(xiàn)副作用極大。1960年，改為皮上劃痕。EV株不是無毒株，小鼠免疫后致死率可達(dá)1%。由于嚴(yán)重副反應(yīng)，西方國家認(rèn)為不能用于大規(guī)模接種。我國采用皮上劃痕接種，反應(yīng)輕微，但不能保證進(jìn)入體內(nèi)的菌數(shù)，影響疫苗保護效果。由于上述兩種傳統(tǒng)鼠疫疫苗存在的缺陷和不足，使得鼠疫新疫苗即鼠疫亞單位疫苗應(yīng)運而生。這方面的研究已經(jīng)很多。Oyston等(1995)首先研究了重組Fl抗原，即用產(chǎn)生Fl抗原的AroA鼠傷寒沙門氏菌活菌免疫家兔，免疫的兔血清可以被動保護小鼠免受鼠疫毒菌的攻擊。之后，Leary等(1995)用鼠疫重組菌產(chǎn)生的V抗原免疫小鼠，進(jìn)行了鼠疫的保護力試驗。而Eyles等(2000)用重組Fl和V亞單位制成聯(lián)合疫苗。中國專利第96193850.1號也涉及包含鼠疫桿菌V抗原和Fl抗原的疫苗，而WO2005/023205A2及WO2005/047309A2涉及進(jìn)一步的研究。此外，目前的鼠疫疫苗大多以鋁鹽為佐劑。鋁鹽是唯一廣泛用于人類的佐劑，具有成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，但多年的使用表明它有許多不足之處，如鋁鹽佐劑對小分子量的抗原增強免疫應(yīng)答的效果還不夠理想；可引起局部的刺激性炎癥；而且，以鋁鹽為佐劑的疫苗不能凍干，必須冷藏保存，造成疫苗的運輸困難；鋁鹽易在體內(nèi)蓄積，特別是腦部，有可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)病變。傳統(tǒng)的鼠疫死疫苗和活疫苗都存在著許多缺點，副反應(yīng)率高和效果不甚理想等問題。雖然，通過基因重組技術(shù)研究鼠疫基因重組亞單位疫苗在解決安全性和免疫保護效果方面有所突破，但仍需要開發(fā)和研究安全性更高和效果更好的鼠疫疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種鼠疫疫苗，它包含鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物與v抗原。所用鼠疫桿菌菌株為鼠疫桿菌弱毒菌株，可以是國家藥品管理當(dāng)局批準(zhǔn)的皮上劃痕用鼠疫活疫苗制造菌株一鼠疫桿菌弱毒EV菌株，但其它鼠疫桿菌弱毒菌株也同樣適用。優(yōu)選地，上述疫苗還包含有鼠疫桿菌F1抗原。上述V或F1抗原可以是分離純化得到的，但優(yōu)選由轉(zhuǎn)化有能表達(dá)鼠疫桿菌V或Fl抗原的表達(dá)載體的重組微生物產(chǎn)生。表達(dá)鼠疫桿菌V或Fl抗原的重組微生物宿主也沒有特別的限制，優(yōu)選為大腸桿菌。其中表達(dá)的V或F1抗原基因優(yōu)選克隆自鼠疫桿菌的強毒株。而且，可以采用現(xiàn)有技術(shù)已知的表達(dá)V或F1抗原的重組微生物，也可根據(jù)已公開的V或F1抗原的核苷酸序列，而通過常規(guī)的重組技術(shù)來制備得到這種重組微生物。這方面可參考已公開的文獻(xiàn)，如中國專利CN1155707C、傅林鋒等(微生物學(xué)報，2003，Vo1.43，No.4;微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，Vol.32，No.3)、黃順軍等(免疫學(xué)雜志，2004，Vol.20,No.3)等提供了V或Fl抗原基因的重組表達(dá)的詳細(xì)方法。本發(fā)明的鼠疫疫苗可以制成液體疫苗或凍干制劑。由于本發(fā)明疫苗中的菌體裂解產(chǎn)物集中了有良好佐劑作用細(xì)菌細(xì)胞壁、抗原特異性的菌體蛋白及富含細(xì)菌DNA具有較強免疫活性的CpG片段，無需添加佐劑，從而避免或減少了目前常規(guī)疫苗注射后出現(xiàn)的副作用，提高了制品的安全性。而且，通過與鼠疫桿菌V抗原或進(jìn)一步與F1抗原聯(lián)合應(yīng)用，更加改善了免疫效果。本發(fā)明提供制備上述鼠疫疫苗的方法，包括如下步驟-a.鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物的制備將鼠疫桿菌弱毒菌株傳代培養(yǎng)三代；收集菌體；裂解所述菌體，制備成細(xì)胞勻漿，離心取上清即為鼠疫弱毒菌株菌體裂解產(chǎn)物，滅菌備用；b.制備鼠疫桿菌的V抗原，純化備用；任選地，還制備鼠疫桿菌的Fl抗原，純化備用；.c.將第a步中獲得的鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物與第b步中制備得到的V抗原混合即可制成成品疫苗。相應(yīng)地，任選還加入Fl抗原得到菌體裂解產(chǎn)物與V抗原及Fl抗原的混合物，以制備成品疫苗。成品疫苗可以是液體疫苗或凍干制劑。培養(yǎng)鼠疫桿菌的培養(yǎng)基也是本領(lǐng)域熟知的，優(yōu)選采用厚氏瓊脂培養(yǎng)基，其制備方法例如可參見《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》(陳天壽編著，1995年，北京出版社)第62頁。為獲得鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物而裂解細(xì)菌菌體的方法沒有特別的限制，可采用本領(lǐng)域熟知的各種方法，如采用超聲破碎法裂解細(xì)胞。但優(yōu)選地，釆用高壓勻漿法對收集培養(yǎng)的鼠疫細(xì)菌菌體進(jìn)行裂解。裂解產(chǎn)物的滅菌方法也是本領(lǐng)域熟知的技術(shù)，優(yōu)選通過輻照滅菌。由于鼠疫弱毒菌株雖然在28i:培養(yǎng)時生長很好，但F1抗原產(chǎn)生量較少(附圖l)。如果鼠疫桿菌傳代培養(yǎng)溫度在三代培養(yǎng)時均采用28—3(TC，由于產(chǎn)生F1抗原量較少，那么在菌體裂解產(chǎn)物中添加V抗原之外，可以進(jìn)一步增加Fl抗原,以改善疫苗的效果?？砂慈缦轮亓颗浔葋砘旌希缑縿┦笠咭呙缰芯w裂解產(chǎn)物與V抗原重量配比為5—100:5—50，優(yōu)選為5—50:5—50，更優(yōu)選為30:10。其中，對菌體裂解產(chǎn)物而言，所述重量配比中是以其所含蛋白質(zhì)含量進(jìn)行計算的，即按常規(guī)方法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量作為菌體裂解產(chǎn)物的蛋白量，以此作為配比的指標(biāo)與V抗原的重量進(jìn)行配比(下同)。更具體而言，每劑疫苗中含5_IOO叫菌體裂解產(chǎn)物、5—50嗎V抗原、5—50嗎F1抗原，優(yōu)選為菌體裂解產(chǎn)物5—50昭、V抗原及Fl抗原5—50ug，進(jìn)一步優(yōu)選為菌體裂解產(chǎn)物30pg、V抗原及F1抗原10"g。本發(fā)明人進(jìn)一步通過研究表明鼠疫弱毒菌株在34—39°C，尤其是37'C下培養(yǎng)，能夠產(chǎn)生足量的有保護性的F1抗原。因此，本發(fā)明優(yōu)選在第一代和第二代培養(yǎng)時，采用的培養(yǎng)溫度為28—3(TC，而在第三代培養(yǎng)時采用34—39'C，優(yōu)選為37i:,以期產(chǎn)生足量的F1抗原，這對于最終疫苗產(chǎn)品的效果非常有益。從說明書附圖1可以明顯看出，第三代于37'C培養(yǎng)可產(chǎn)生較大量的F1抗原，高于28'C培養(yǎng)所產(chǎn)生的量。根據(jù)上述研究結(jié)果，本申請的相應(yīng)的優(yōu)選實施方案如下如果在第三代培養(yǎng)時的溫度采用37'C，則會產(chǎn)生較大量的F1抗原，則菌體裂解產(chǎn)物中可以不額外添加F1抗原，僅添加V抗原即能達(dá)到好的效果。其具體配比可按如下重量配比來混合,例如菌體裂解產(chǎn)物:V抗原F1抗原的重量比為5—100:5—50:5—50，優(yōu)選為5—50:5—50:5—50，更優(yōu)選為30:10:10。更具體地，每劑疫苗中含5—100嗎菌體裂解產(chǎn)物、5—50昭V抗原，優(yōu)選含5—50嗎菌體裂解產(chǎn)物、5—50叫V抗原，更優(yōu)選地，含菌體裂解產(chǎn)物30嗎與V抗原lOyg。因此，對于菌體裂解產(chǎn)物與V抗原混合制備鼠疫疫苗的一個優(yōu)選的實施方案中，制備菌體裂解產(chǎn)物前的鼠疫桿菌于34—39'C，最優(yōu)選于37'C下被培養(yǎng)一代。需要說明的是，在鼠疫桿菌的傳代培養(yǎng)的第三代采取何種溫度，例如采用28'C培養(yǎng)，雖然產(chǎn)生Fl抗原的量較少，但添加Fl抗原并不必需的。本領(lǐng)域技術(shù)人員共知的，單獨利用V抗原制備疫苗在現(xiàn)有技術(shù)中己經(jīng)有公開，那么V抗原與菌體裂解產(chǎn)物聯(lián)合制備疫苗應(yīng)當(dāng)是可行的。上面的研究，只是為了更進(jìn)一步的改善鼠疫疫苗的效果而考慮F1抗原的量。對于Fl和V抗原，優(yōu)選通過培養(yǎng)能夠表達(dá)鼠疫桿菌V或Fl抗原的重組微生物，收獲重組表達(dá)的V或F1抗原，經(jīng)純化備用；本發(fā)明的鼠疫疫苗的比較具體的制備實施方式，可按如下步驟進(jìn)行1、鼠疫弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物(勻槳)的制備1.1、菌體培養(yǎng)將低溫保藏菌種室溫下溶解，接種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基，283(TC培養(yǎng)4448小時為第一代，將第一代轉(zhuǎn)種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基，283(TC培養(yǎng)4448小時為第二代，將第二代轉(zhuǎn)種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基，2839'C培養(yǎng)4872小時；1.2、菌體收集以凍干保護液洗下厚氏瓊脂培養(yǎng)基表面的菌體。1.3、鼠疫弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物的制備以凍干保護液將上述菌體配成所需濃度例如50—200億菌/ml的菌液，經(jīng)高壓勻漿裂解菌體，制備細(xì)胞勻質(zhì)，高壓均質(zhì)機的高壓氣流剪切技術(shù)勻漿破碎菌體條件為400-2000bar。低溫低速離心條件為2-8。C、1000-6000轉(zhuǎn)/分離心10-30分鐘，然后取上清液作為鼠疫弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物(勻漿)，測定其蛋白含量，并用6()0)照射15分鐘滅菌。其中凍干保護液，可以任何合適的緩沖液，但在本發(fā)明中優(yōu)選按如下方法制備在1500重量份去離子水中加入3.75重量份味精、3.75重量份蔗糖、10.8重量份氯化鈉、6.525重量份無水磷酸二氫鉀配成鉀液，在1500重量份去離子水中加入3.75重量份味精、3.75重量份蔗糖、10.8重量份氯化鈉、6.525重量份無水磷酸二氫鈉配成鈉液取，取1500重量份鉀液和1100重量份鈉液混合，使混合液的pH為6.0-8.0，優(yōu)選7.0-7.4，最優(yōu)選7.2，混合液通過G3漏斗過濾后110°C—135'C蒸汽處理10-40分鐘，優(yōu)選115'C蒸汽滅菌30分鐘即為磷酸鹽緩沖液。下面提及的凍干保護液也同樣適用此處的描述。2、重組表達(dá)鼠疫桿菌V抗原2.1、V基因的克隆表達(dá)根據(jù)已知的鼠疫桿菌V基因序列設(shè)計引物，以鼠疫強毒株基因為模板，用PCR擴增出V基因片段。將純化的基因產(chǎn)物連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，進(jìn)行基因測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)用大腸桿菌中，獲得重組菌。2.2、V抗原的純化將培養(yǎng)的重組菌的菌液離心，將菌體重懸于Tris緩沖液，超聲破碎，離心，上DEAE陰離子交換柱，收集洗脫液，在所得溶液中加入硫酸銨，上PhenylSepharoseFastFlow(lowsub)疏水柱，收集洗脫液，經(jīng)凍千保護液透析即為V抗原原液。3、成品制備無菌條件下分裝上述細(xì)胞勻漿與V抗原原液混合，即可制成鼠疫液體疫苗，或經(jīng)冷凍干燥制得鼠疫疫苗的凍干制劑。如果需要增加F1抗原，則也通過類似于制備V抗原的過程來獲得F1抗原、以及類似的純化方法以便加入上述混合物中，獲得含有鼠疫菌體裂解產(chǎn)物和Fl抗原及V抗原的疫苗。例如通過下述步驟來獲得Fl抗原1、Fl基因的克隆表達(dá)根據(jù)已知的鼠疫桿菌F1基因序列設(shè)計引物，以鼠疫強毒株基因為模板，用PCR擴增出Fl基因片段。將純化的基因產(chǎn)物連接到質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，進(jìn)行基因測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)用大腸桿菌中，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見Fl抗原可以分泌到培養(yǎng)液上清中。2、Fl抗原的純化將培養(yǎng)液上清用硫酸銨沉淀，離心，將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液，用磷酸鹽緩沖液將樣品透析，上QSepharoseF.R陰離子交換柱，收集洗脫液。在所得溶液中加入硫酸銨，上PhenylSepharoseHighPerformance疏水柱，收集洗脫液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析即為Fl原液。在具體實施方式部分也提供了一個具體的制備實例。同時，本發(fā)明另一方面，上述鼠疫菌疫苗在制備用于人或動物免受鼠疫桿菌感染的的免疫預(yù)防的藥物中的用途，特別是適合于正常人群的免疫預(yù)防。利用本發(fā)明的鼠疫疫苗對人或動物進(jìn)行免疫預(yù)防時，其方法可按本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行操作，例如皮下接種等。圖l:鼠疫弱毒菌株于28'C和37'C培養(yǎng)時，制備得到的菌體勻漿中Fl抗原量的經(jīng)SDS-PAGE分析比較。其中，1為F1抗原對照；2為分子量Marker;3為鼠疫弱毒菌株于37°〇培養(yǎng)；4為鼠疫弱毒菌株于28'C培養(yǎng)。具體實施例方式下面通過具體實施例來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，以幫助閱讀者更好地理解本發(fā)明的精神和實質(zhì)，但不能解釋為對本發(fā)明范圍的任何限制。實施例1:鼠疫弱毒EV菌株的菌體裂解產(chǎn)物與重組的V抗原及Fl抗原組成的鼠疫疫苗的制備1、鼠疫弱毒EV菌株菌體裂解產(chǎn)物的制備1.1、菌體培養(yǎng)將低溫保藏的鼠疫弱毒EV菌株菌種(來自蘭州生物制品研究所菌株號52006)于室溫下溶解，接種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基，28'C培養(yǎng)48小時為第一代，將第一代轉(zhuǎn)種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基，28'C培養(yǎng)48小時為第二代，將第二代轉(zhuǎn)種于厚氏瓊脂培養(yǎng)基，28。C培養(yǎng)72小時為第三代。1.2、菌體收集用凍干保護液(其制備方法按前面提及的優(yōu)選方法制備)洗下厚氏瓊脂培養(yǎng)基表面的菌體。1.3、鼠疫弱毒EV菌株勻漿的制備以凍干保護液(其制備方法按前面提及的優(yōu)選方法制備)將上述菌體配成70億菌/ml濃度的菌液，經(jīng)高壓均質(zhì)機(丹麥APV公司生產(chǎn)的Homogenizer，Model-2000)的髙壓氣流剪切技術(shù)勻漿破碎菌體，碎菌體條件為l，000bar、破碎6次，然后低溫低速離心去除顆粒沉淀物，離心條件為4'C、2，000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，然后取上清液，測定蛋白含量，經(jīng)6QCo照射15分鐘滅菌，獲得鼠疫菌體裂解產(chǎn)物稱為菌體勻槳。2、重組V抗原的制備2.1、V基因的克隆表達(dá)根據(jù)文獻(xiàn)報道鼠疫桿菌的V抗原基因設(shè)計如下引物，正向引物5，-GACGAGTCCATATGATTAGAGCCTACGAAC-3，；反向引物5，"CCGGAATTCTCATTTACCAGACGTGTC-3，，以鼠疫桿菌DNA為模板，在DNA聚合酶作用下PCR擴增目的基因，經(jīng)內(nèi)切酶Ndel和EcoRl酶切與經(jīng)過相同酶切的pET-30a經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，進(jìn)行基因測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。2.2、V抗原的純化將培養(yǎng)的菌液6，000r/min、30min、4'C離心，將細(xì)菌重懸于A液lmMEDTA、50mMTris緩沖液(PH8.0),超聲破碎9秒X3秒X100次，8，000r/min、60min、4'C離心，取上清上DEAE陰離子交換柱，B液lmMEDTA、0.5M氯化鈉的50mMTris緩沖液(PH8.0)，收集用40%B的洗脫溶液，在所得溶液中加入終濃度為0.7M的硫酸銨，上PhenylSepharoseFastFlow(lowsub)疏水柱，用B液含0.7M硫酸銨、0.2M氯化鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(PH7.4)平衡柱子,'A液50mM磷酸鹽緩沖液(PH7.4),收集用30%B的洗脫溶液，經(jīng)凍干保護液(其制備方法按前面提及的優(yōu)選方法制備)透析，然后經(jīng)0.22pm濾膜過濾即為V抗原原液。3、重組蛋白F1抗原的制備3.1:Fl基因的克隆表達(dá)Fl正向引物5'-GGCGAGTCCATATGAAAAAAATCAGTTCC-3，；Fl反向引物5'-CCGGAATTCTTATTGGTTAGATACGGT-3'，以鼠疫桿菌DNA為模板，在DNA聚合酶作用下PCR擴增目的基因，經(jīng)內(nèi)切酶Ndel和EcoRl酶切與經(jīng)過相同酶切的pET-30a經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，進(jìn)行基因測序，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，收集樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可見F1抗原可以分泌到培養(yǎng)液上清中。3.2:Fl抗原的純化將培養(yǎng)液上清用硫酸銨沉淀，6,000r/min、30min、4'C離心。將沉淀溶于1/20體積的20mM磷酸鹽緩沖液(PH5.8)，用20mM磷酸鹽緩沖液(PH5.8)將樣品透析，上QSepharoseF.F.陰離子交換柱，A液20mM磷酸鹽緩沖液(PH5.8)，B液含l.OM氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(PH5.8)，收集用20%B的洗脫溶液。在所得溶液中加入終濃度為1.2M的硫酸銨，上PhenylSepharoseHighPerformance疏水柱，用B液1.2M硫酸銨、0.2M氯化鈉的20mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)平衡柱子，A液20mM磷酸鹽緩沖液(PH6.0)，收集20°/。B的洗脫溶液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液透析，然后經(jīng)022tim濾膜過濾即為Fl原液。4、成品制備無菌條件下分裝上述菌體勻漿與V及F1抗原的混合液，即制得鼠疫液體疫苗，或經(jīng)冷凍千燥制得鼠疫疫苗的凍千制劑，稱為菌體勻漿+V+F1疫苗。其中配比的計算中，對于菌體裂解產(chǎn)物即菌體勻漿是按其中所含蛋白量來計算的，例如實施例中的"菌體勻漿56.4嗎"表示所使用的菌體勻漿量中含蛋白質(zhì)56.4pg。下面實施例中的相關(guān)描述均為此種含義，不再重復(fù)描述。實施例2安全性試驗為了驗證，上述菌體勻漿+V+Fl疫苗的安全性，將實驗分成四組，每組雄性BALB/c小鼠10只，分別為1)陰性對照組生理鹽水0.1ml/只2)菌體勻槳組菌體勻漿56.4ng/0.1ml/只3)菌體勻漿+V+Fl疫苗組菌體勻漿+Fl、V各10ng/0.1ml/只4)鼠疫弱毒EV活疫苗lX107/0.1mlAR采用背部皮下免疫接種，觀察7天。接種56.4嗎菌體勾漿組(相當(dāng)于2X1C)S鼠疫弱毒EV菌株)、菌體勻漿+V+Fl疫苗組及陰性對照組的動物，注射部位未觸及腫塊，動物無逆毛、腹瀉、或其他中毒現(xiàn)象。而接種1X107鼠疫弱毒EV活疫苗的動物，有3只死亡，其余動物在注射部位均可觸及腫塊。初步的安全性實驗表明，菌體勻漿及菌體勻漿+V+Fl疫苗是安全的。實施例3免疫原性檢測為研究本申請疫苗的免疫原性，將實驗分成四個組，每組雌性Balb/c小鼠10只，分別為1)陰性對照組生理鹽水0.1ml/只2)菌體勻漿+V+Fl疫苗組菌體勻漿30嗎+Fl、V各10ng/0.1ml/只3)Fl+V組(F1與V抗原聯(lián)合)Fl、V各1(Hig/0.1ml/只4)A1隱(F1+V)組A1(0H)3+F1、V各10pg/0.1ml/只分別在第0天和第21天，背部皮下免疫接種小鼠。分別在免疫后l、2、3、4、5周內(nèi)采血，用ELISA方法測血清抗體滴度。Fl和V抗體滴度結(jié)果分別見表1和表2。表1Fl抗體滴度(log10)(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注t表示與菌體勻漿+V+Fl組比較，PO.05對于F1抗體滴度，免疫第四周菌體勻漿+V+Fl組抗體滴度高于Fl+V組和A1—(F1+V)組，P值均小于0.05。免疫第五周菌體勻漿+V+Fl組抗體滴度高于A1—(Fl+V)組，P值小于0.05。表2V抗體抗體滴度(log10)(7±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注"^表示與菌體勻漿+Fl+V組比較，PO.05"表示與菌體勻漿+Fl+V組比較，PO.01由表2可知，對于V抗體滴度而言，免疫第4周抗體滴度比較菌體勻漿+1+￥組抗體滴度高于？1+￥組和八1一(？1+￥)組，P值分別為小于O.Ol、小于0.05;免疫第5周抗體滴度比較菌體勻漿+Fl+V組抗體滴度高于Fl+V組和A1—(Fl+V)組，P值分別為小于O.Ol、小于0.05。基于以上結(jié)果，表明菌體勻漿+Fl+V疫苗能誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體，具有良好的免疫原性。實施例428'C和37'C培養(yǎng)鼠疫桿菌產(chǎn)生F1抗原量的比較1、按照實施例1中菌體培養(yǎng)步驟的方法培養(yǎng)鼠疫桿菌，但在第三代分別于28'C和37'C培養(yǎng)菌株，以比較不同溫度對產(chǎn)生F1抗原量的影響。之后按實施例1的"鼠疫弱毒EV菌株菌體裂解產(chǎn)物的制備"中的步驟制備細(xì)胞勻漿。2、通過常規(guī)的SDS—PAGE分析，28'C和37'C培養(yǎng)所制備的細(xì)胞勻漿中含F(xiàn)1抗原的量。結(jié)果如圖l所示?？梢钥闯?，第三代于37'C培養(yǎng)可產(chǎn)生較大量的Fl抗原，而于28'C培養(yǎng)得到細(xì)胞勻漿中含有的Fl抗原量較少。因此，在實施例1制備的菌體勻漿(28'C培養(yǎng)得到)+F1+V具備較好的安全性和免疫原性的基礎(chǔ)上，結(jié)合本實施例的研究結(jié)果，在第三代培養(yǎng)采用37。C，已經(jīng)產(chǎn)生較大量的Fl抗原，則菌體裂解產(chǎn)物中可以不再額外添加Fl抗原，僅添加V抗原，可以顯然的得知，也應(yīng)具備較好的安全性和免疫原性。權(quán)利要求1、一種鼠疫疫苗，其特征在于包含鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物與鼠疫桿菌V抗原，優(yōu)選地，所述V抗原是通過重組表達(dá)獲得的重組V抗原。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的鼠疫疫苗，其特征在于每劑鼠疫疫苗中菌體裂解產(chǎn)物與V抗原重量配比為5—100:5—50，優(yōu)選為5—50:5—50,更優(yōu)選為30:10，其中菌體裂解產(chǎn)物按其所含蛋白量進(jìn)行計算。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的鼠疫疫苗，其特征在于在制備所述鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物之前，所述鼠疫桿菌弱毒菌株于34—39'C，優(yōu)選于37'C培養(yǎng)一代。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的鼠疫疫苗，其特征在于進(jìn)一步包含鼠疫桿菌F1抗原，優(yōu)選地，所述Fl抗原是通過重組表達(dá)獲得的重組Fl抗原。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的鼠疫疫苗，其特征在于每劑鼠疫疫苗中的各組分重量配比為菌體裂解產(chǎn)物V抗原Fl抗原-5—100:5—50:5—50,優(yōu)選為5—50:5—50:5_50，更優(yōu)選為30:10:10，其中菌體裂解產(chǎn)物按其所含蛋白含量進(jìn)行計算。6、一種鼠疫疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟-a.將鼠疫桿菌弱毒菌株傳代培養(yǎng)三代；收集菌體，裂解所述菌體，制備成細(xì)胞勻漿，離心取上清液，制得鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物；b.將第a步中獲得的菌體裂解產(chǎn)物與鼠疫桿菌V抗原混合，制備成疫苗，優(yōu)選地，所述鼠疫桿菌v抗原是通過重組表達(dá)獲得的重組v抗原。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述鼠疫桿菌弱毒菌株的傳代培養(yǎng)中，第三代培養(yǎng)的溫度為34—39'C，優(yōu)選為37'C。8、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于每劑鼠疫疫苗中菌體裂解產(chǎn)物與V抗原重量配比為5—100:5—50，優(yōu)選為5—50:5—50，更優(yōu)選為30:10,其中菌體裂解產(chǎn)物按其所含蛋白含量進(jìn)行計算。9、根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述鼠疫桿菌弱毒菌株的傳代培養(yǎng)中，第一代至第三代培養(yǎng)的溫度均為28—3(TC。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于在第b步中，進(jìn)一步還混合鼠疫桿菌F1抗原，優(yōu)選地，所述F1抗原是通過重組表達(dá)獲得的重組F1抗原。11、根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于每劑鼠疫疫苗中菌體裂解產(chǎn)物V抗原Fl抗原的重量配比為5—100:5—50:5—50，優(yōu)選為5—50:5—50:5—50,更優(yōu)選為30:10:10，其中菌體裂解產(chǎn)物按其所含蛋白含量進(jìn)行計算。12、根據(jù)權(quán)利要求l一5任一項所述鼠疫疫苗或由權(quán)利要求6—11任一項所述制備方法制備得到的鼠疫疫苗在制備用于人或動物免受鼠疫桿菌感染的免疫預(yù)防藥物中的用途。全文摘要本發(fā)明提供一種復(fù)合鼠疫疫苗及其制備方法，該疫苗包含鼠疫桿菌弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物與重組鼠疫桿菌V抗原，進(jìn)一步的還包含鼠疫桿菌F1抗原。其中，通過收集生長于培養(yǎng)基上的鼠疫弱毒菌株的菌體，用高壓勻漿法裂解制備得到的鼠疫弱毒菌株的菌體裂解產(chǎn)物。該裂解產(chǎn)物集中了有良好佐劑作用的細(xì)菌細(xì)胞壁、抗原特異性的菌體蛋白(含有保護性莢膜抗原F1)及富含細(xì)菌DNA的具有較強免疫活性的CpG片段；利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的含有鼠疫桿菌V抗原基因或F1抗原基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)后用純化獲得重組鼠疫桿菌V抗原和F1抗原。本發(fā)明疫苗可用于正常人群對鼠疫的免疫預(yù)防。文檔編號A61P31/04GK101337069SQ200510123930公開日2009年1月7日申請日期2005年11月25日優(yōu)先權(quán)日2005年11月25日發(fā)明者王國治,王秉翔,東魏申請人:中國藥品生物制品檢定所