專(zhuān)利名稱(chēng)：一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)型dna疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物獸藥技術(shù)領(lǐng)域，是一種具有預(yù)防雞球蟲(chóng)病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。本疫苗含有柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2和雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)。并在chIL-2基因的5’端引入了一段蛋白酶特異性水解序列。本疫苗包含有多個(gè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件。
背景技術(shù)：
雞球蟲(chóng)病是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要寄生蟲(chóng)病，全世界每年因球蟲(chóng)病造成的經(jīng)濟(jì)損失約為20億英鎊。該病由艾美耳屬7種球蟲(chóng)引起，其中以柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)造成的危害最大。目前藥物防治雞球蟲(chóng)病已帶來(lái)一系列的問(wèn)題。如耐藥性的產(chǎn)生，藥物殘留對(duì)環(huán)境造成的危害等等。這些問(wèn)題已經(jīng)引起了人們的日益關(guān)注。人們迫切希望能找到一種行之有效的辦法來(lái)防治雞球蟲(chóng)病。
使用強(qiáng)毒苗和致弱球蟲(chóng)苗接種預(yù)防不失為一種手段，但強(qiáng)毒苗僅適用于種雞，不完全適用于蛋雞和肉雞，肉雞雖可用弱毒球蟲(chóng)苗，但又存在穩(wěn)定性差，接種量難于控制，費(fèi)用高等問(wèn)題，使這些球蟲(chóng)苗不能得到很好的開(kāi)發(fā)和利用。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的快速發(fā)展，人們迫切希望通過(guò)基因工程手段來(lái)研制新型基因工程疫苗，為雞球蟲(chóng)病的防治提供新的手段。
雞對(duì)球蟲(chóng)病的免疫反應(yīng)是機(jī)體對(duì)病原體的綜合性防御表現(xiàn)，既有非特異性免疫又有特異性獲得性免疫—體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫應(yīng)答主要通過(guò)依賴(lài)腔上囊的B淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，細(xì)胞免疫應(yīng)答主要通過(guò)依賴(lài)胸腺的T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雞球蟲(chóng)病的免疫力可因摘除胸腺而受到抑制，而摘除腔上囊則無(wú)影響。說(shuō)明球蟲(chóng)的保護(hù)性免疫中抗體的作用較小。但通過(guò)繼承性免疫淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的結(jié)果已經(jīng)證明，T細(xì)胞免疫反應(yīng)在球蟲(chóng)免疫應(yīng)答中處于核心地位。
核酸疫苗是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型疫苗，因其操作簡(jiǎn)便，既具有重組亞單位疫苗的安全性，又具有減毒活疫苗誘導(dǎo)全方位免疫應(yīng)答的高效、持續(xù)性的優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)今疫苗研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，在抗寄生蟲(chóng)感染方面，核酸疫苗研究已展開(kāi)了積極的探索。
pEtK2基因是Dunn于1996年通過(guò)使用對(duì)淋巴細(xì)胞有增殖作用的抗原所制備的抗血清，即CαEm70/l抗血清，從E.tenella子孢子cDNA文庫(kù)中篩選出來(lái)的，該基因大小為1464bp，編碼55KD的含有鈣調(diào)結(jié)合域的蛋白激酶(EtCDPK，Genebank的登記號(hào)AY389513)。該蛋白存在于子孢子和裂殖子頂器中，能刺激感染雞的T淋巴細(xì)胞增殖，能為感染雞提供較好的保護(hù)作用。
細(xì)胞因子是體內(nèi)免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有廣泛生物學(xué)活性的免疫調(diào)節(jié)因子，在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞，對(duì)免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用。IL-2的主要作用是促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞分化增殖，維護(hù)T細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞(NK)和B細(xì)胞功能。故又叫T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(TCGF)。現(xiàn)已證實(shí)IL-2在抗E.tenella和抗E.acervμlina感染中的作用。Gaarter等(Caarter LL.et al.，Regulation of T cell subsets fronmnative to memory.J Immunol.1998，21(3)181-187)報(bào)道在感染第3天和第5天給雞注射IL-2可使卵囊排出量降低。李祥瑞等(李祥瑞，金紅，盧景良.雞白細(xì)胞介素-2cDNA的克隆.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，22(2)80-84)已克隆和表達(dá)了雞的IL-2基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。
本發(fā)明提供了一種制備具有預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病作用的免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。
另外，本發(fā)明還提供了所述DNA疫苗的用途。
本發(fā)明是部分地建立在本發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)之上含有柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2的真核質(zhì)粒載體能夠?yàn)殡u提供針對(duì)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)的有效免疫保護(hù)；含有chIL-2可提高艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)感染雞盲腸扁桃體和脾臟淋轉(zhuǎn)水平及chIL-2的誘生，并可降低球蟲(chóng)感染的病變記分和糞便中的卵囊數(shù)；在制備DNA疫苗時(shí)，將雞白介素-2基因與球蟲(chóng)保護(hù)性基因(鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2)一起引入真核質(zhì)粒，能夠進(jìn)一步增強(qiáng)所述球蟲(chóng)保護(hù)基因的免疫保護(hù)效果。
一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2的真核質(zhì)粒載體。
本發(fā)明所述DNA疫苗使用真核質(zhì)粒表達(dá)載體作為結(jié)構(gòu)框架，所述真核質(zhì)粒載體除具有表達(dá)載體基本元件，在限制性酶切位點(diǎn)處插入了目的基因。本領(lǐng)域已知的任一種真核質(zhì)粒載體都可用于本發(fā)明，例如，包括但不限于pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX1.0和pcDNA4/His Max。在本發(fā)明的一個(gè)具體優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的真核質(zhì)粒載體為pcDNA4/His Max(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)。
本發(fā)明使用的具有免疫原性的pEtK2基因，該基因是一種球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因，大小為1464bp，是使用CαEm70/1抗血清(使用對(duì)淋巴細(xì)胞有增殖作用的抗原制備的一種抗血清)，從E.tenella子孢子cDNA文庫(kù)中篩選出來(lái)的。該基因編碼的蛋白質(zhì)存在于子孢子和裂殖子頂器中，能刺激感染雞的T淋巴細(xì)胞增殖，能為感染雞提供很好的保護(hù)作用。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述疫苗進(jìn)一步還包含與所述基因pEtK2連接在一起插入所述真核質(zhì)粒載體的雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)，以增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性。
本發(fā)明人成功克隆和表達(dá)了雞的IL-2基因(chIL-2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO1中第1483-1905位所示。本發(fā)明人進(jìn)一步研究了雞IL-2對(duì)雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)病細(xì)胞免疫水平的影響。簡(jiǎn)而言之，試驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、不同劑量卵囊感染組和不同劑量卵囊感染加白細(xì)胞介素-2(IL-2)組，在首次感染的基礎(chǔ)上攻蟲(chóng)，對(duì)首次感染后和攻蟲(chóng)后不同時(shí)間的盲腸扁桃體和脾淋巴細(xì)胞的淋轉(zhuǎn)水平進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合盲腸病變記分和糞便卵囊記數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明，首次感染后，單純感染組盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞淋轉(zhuǎn)水平持續(xù)受抑制；各卵囊感染組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平在第4天均下降。感染的同時(shí)注射IL-2使1、2、5萬(wàn)卵囊感染組盲腸扁桃體淋轉(zhuǎn)水平分別在第4、6、9天高于單純感染組；1、2萬(wàn)卵囊感染組脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平明顯升高。攻蟲(chóng)后不同感染組盲腸扁桃體和脾淋轉(zhuǎn)水平均出現(xiàn)下降趨勢(shì)。加IL-2后能提高盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，但不顯示劑量的差異性；脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平高于單純感染組，第9天高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果表明1)加入重組雞IL-2可以使首次感染和攻蟲(chóng)后1萬(wàn)、2萬(wàn)卵囊感染組的病變記分和糞便中卵囊排出量明顯降低；2)球蟲(chóng)感染雛雞后引起脾和盲腸扁桃體淋巴細(xì)胞免疫抑制，隨感染劑量的加大，免疫抑制程度加深；3)重組IL-2能提高首次感染盲腸扁桃體和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，從而改善球蟲(chóng)首次感染引起的脾和盲腸扁桃體免疫抑制；4).重組IL-2能提高攻蟲(chóng)后盲腸扁桃體和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化水平，對(duì)攻蟲(chóng)有免疫保護(hù)作用。
基于上述發(fā)現(xiàn)，因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明所述的DNA疫苗中引入與所述基因pEtK2連接在一起插入所述真核質(zhì)粒載體的雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗的免疫保護(hù)作用進(jìn)一步增強(qiáng)。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述疫苗還包含在所述的基因pEtK2與基因chIL-2之間插入一段蛋白酶凝血因子X(jué)a特異性水解序列編碼核苷酸序列CCT ACC CTC GAT。在球蟲(chóng)保護(hù)性基因和chIL-2之間插入蛋白酶特異性水解序列編碼核苷酸序列，這樣就可使得本發(fā)明所述DNA疫苗在肌肉細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)的球蟲(chóng)保護(hù)性抗原與chIL-2的融合蛋白中含有了蛋白酶特異性位點(diǎn)。因而，可確保，蛋白酶能夠在蛋白酶特異性位點(diǎn)水解該融合蛋白，得到球蟲(chóng)抗原和chIL-2蛋白，從而使得這兩種蛋白能獨(dú)自形成高級(jí)結(jié)構(gòu)并發(fā)揮相應(yīng)的功能。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，通過(guò)引物設(shè)計(jì)的方法，在chIL-2基因的5’端引入蛋白酶凝血因子X(jué)a特異性水解序列編碼核苷酸序列GAATTCCCTACCCTCGAT(如SEQ ID NO1中第1465-1482位核苷酸所示)，從而制備出一種插入真核質(zhì)粒載體中的融合基因pEtK2-Xa-chIL-2(按從5’到3’的方向)，該融合基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的方法。簡(jiǎn)而言之，其技術(shù)路線(xiàn)如下1.PCR擴(kuò)增制備球蟲(chóng)保護(hù)性抗原基因pEtK2和雞白介素2基因(chIL-2)通過(guò)PCR擴(kuò)增手段，克隆得到基因pEtK2和chIL-2。其中在本發(fā)明的一個(gè)具體的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)引物設(shè)計(jì)手段，在chIL-2基因的5’端引入了一段蛋白酶凝血因子X(jué)a特異性水解序列編碼核苷酸序列GAA TTC CCTACC CTC GAT；2.DNA疫苗重組真核質(zhì)粒及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu)建利用分子生物學(xué)常規(guī)的重組方法，制備出含pEtK2或含pEtK2-(Xa)-chIL-2的重組真核質(zhì)粒，然后用其轉(zhuǎn)化宿主菌，在本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案中，所述宿主菌為大腸桿菌JM109，篩選后獲得重組基因工程菌；3.基因工程菌的發(fā)酵及DNA疫苗重組真核質(zhì)粒的大規(guī)模分離純化。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面是本發(fā)明所述的柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeriatenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的用途。用純化的含pEtK2或含pEtK2-(Xa)-chIL-2的重組DNA疫苗直接免疫動(dòng)物后，通過(guò)每克糞便指數(shù)、卵囊減少率、盲腸病變記分和抗球蟲(chóng)指數(shù)等多項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，這兩者都具有很好的免疫保護(hù)效果(其中后者保護(hù)效果更為顯著)。因此，本發(fā)明所述的DNA疫苗可用于制備可預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病的藥物制劑。


圖1為本發(fā)明柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的編碼雞白細(xì)胞介素2的重組質(zhì)粒pBV220-chIL-2的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為重組質(zhì)粒pMD18-T-pEtK2的構(gòu)建流程圖。
圖4為重組質(zhì)粒pET-chIL-2的構(gòu)建流程圖。
圖5為重組質(zhì)粒pcDNA4/His Max-pEtK2的構(gòu)建流程圖。
圖6為重組質(zhì)粒pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2的構(gòu)建流程圖。
圖7為RT-PCR檢測(cè)DNA疫苗pcDNA4/His Max-pEtK2、pVAX1.0-pEtK2、pcDNA4/His Max-pEtK2-chIL-2和pVAX 1.0-pEtK2-chIL-2在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄情況，RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。
1為DL2000 Marker；2和3為pcDNA4/His Max-pEtK2和pVAX 1.0-pEtK2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用pEtK2引物擴(kuò)增)；4和5為pcDNA4/His Max-pEtK2-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2-chIL-2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用pEtK2引物擴(kuò)增)；6和7為pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用IL-2引物擴(kuò)增)8、9、10和11分別為pcDNA4/His Max-pEtK2，pVAX1.0-pEtK2，pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿部)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用pEtK2引物擴(kuò)增)；12和13分別為pcDNA4/His Max-pEtK2-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2-chIL-2重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿部)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(用chIL-2引物擴(kuò)增)。
圖8為Western-印跡檢測(cè)含pEtK2或pEtK2-(Xa)-chIL-2的DNA疫苗在肌肉中的表達(dá)結(jié)果圖。
1和2為Western-印跡檢測(cè)pcDNA4/His Max-pEtK2和pVAX1.0-pEtK2重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿部)的蛋白表達(dá)結(jié)果；3和4為Western-印跡檢測(cè)pcDNA4/His Max-pEtK2-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2-chIL-2重組質(zhì)粒非注射部位肌肉(腿部)的蛋白表達(dá)結(jié)果；5和6為Western-印跡檢測(cè)pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的蛋白表達(dá)結(jié)果；7和8為Western-印跡檢測(cè)pcDNA4/His Max-pEtK2和pVAX1.0-pEtK2重組質(zhì)粒注射部位肌肉(胸肌)的蛋白表達(dá)結(jié)果。
圖9為pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2疫苗免疫組，攻蟲(chóng)后雞盲腸病變圖。
圖10為PBS免疫組，攻蟲(chóng)后雞盲腸病變圖。
實(shí)施例基礎(chǔ)材料含雞白細(xì)胞介素-2基因(chIL-2)的重組質(zhì)粒pBV220-chIL-2(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖2)；真核表達(dá)載體pcDNA4/His Max和pVAX1.0(美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品)；pMD18-T(大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司)pET-28(+)(美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品)。
實(shí)施例1.pEtK2基因的制備1.合成引物P1、P2，序列分別為根據(jù)pEtK2的公開(kāi)的核苷酸序列(Genebank登記號(hào)AY389513)設(shè)計(jì)下列引物P15’-AAGGATCC CCAGCAGCGTCCAA-3′P25’-GAAGAATTCCGCTGCGGTATCTCCG-3’其中下劃線(xiàn)部分分別為引入的酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI，；方框部分為起始密碼子。
2.球蟲(chóng)總RNA的提取取E.tenella純種孢子化卵囊0.1g(約107個(gè))置玻璃勻漿器中，加入1ml Trizol試劑，研磨5分鐘使卵囊壁破裂，一步法提取子孢子總RNA。具體步驟如下將勻漿后溶液置1.5ml eppendorf管中，加入0.2mL 24∶1的氯仿/異戊醇混合物，用力搖動(dòng)樣品15s，置冰上5min，4℃12000轉(zhuǎn)離心15min，小心將含有RNA的水相(上層)轉(zhuǎn)到另一eppendorf管中并置冰上，加入0.5ml異丙醇，輕輕混勻樣品并置室溫10min，4℃12000轉(zhuǎn)離心15min，RNA在試管底形成黃白色沉淀，小心去掉異丙醇，加入1ml 70％乙醇洗滌RNA沉淀，通過(guò)搖晃或吸打使RNA沉淀重新懸浮，4℃12000轉(zhuǎn)離心8min，去掉乙醇，室溫干燥，測(cè)A260/A280比值，加入20μl DEPC處理過(guò)的水，置-20℃保存。
3.cDNA的合成按下列比例加入試劑合成cDNA第一鏈總RNA 10μl500μg/ml Oligo(dT) 1.0μl上述試劑混勻后70℃放置5分鐘，立即置冰上冷卻，再加入下列成分2.5mmol/L dNTP 3.5μlRNASin(TaKaRa公司) 1.0μl5×RT buffer5.0μl200U/μl M-MLV 1.5μl25mmol/L MgCL223.0μl無(wú)RNase水補(bǔ)至25.0μl 混勻，低速瞬時(shí)離心，甩下管壁上的液滴，37℃反應(yīng)1h。90℃ 5min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物立即進(jìn)行PCR或-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 4.pEtK2基因的PCR擴(kuò)增在薄壁PCR管中加入下列成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增
cDNA2.5μl2.5mmol/L dNTP 4.0μlP1(50pmol) 1.0μlP2(50pmol) 1.0μl10×PCR buffer 5.0μl25mmol/L MgCL223.0μlTaq DNA聚合酶(5U/μl) 0.5μlddH2O 33.0μl總計(jì)50.0μl將上述成分離心混勻后，于PCR儀上94℃變性5min；94℃45sec，60℃60sec，72℃75sec，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10min。
經(jīng)測(cè)序表明，擴(kuò)增得到的pEtK2基因具有如SEQ ID NO1中第1-1464位所示的核苷酸序列。
實(shí)施例2.chIL-2基因的制備1.合成引物P3、P4，序列分別為P35’-CTAGAATTCCCTACCCTCGAT TGCAAAGTACTGATCT-3’P45’-TTAGTCGACTTGCAGATATCTCACAAAGTT-3’其中下劃線(xiàn)部分為引入的酶切位點(diǎn)EcoRI和SalI；方框部分為起始密碼子；斜體字母部分為凝血因子X(jué)a特異性水解序列編碼核苷酸序列(如SEQID NO1中第1465-1482位所示的核苷酸序列)。
2.chIL-2基因的PCR擴(kuò)增在薄壁PCR管中加入下列成分進(jìn)行PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pBV220-chIL-2(50ng/μl) 1.0μl2.5mmol/L dNTP 4.0μlP3(50pmol) 1.0μlP4(50pmol) 1.0μl10×PCR緩沖液5.0μl25mmol/L MgCL223.0μlTaq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μlddH2O 34.5μl總計(jì) 50.0μl
將上述成分離心混勻后，于PCR儀上94℃變性5分鐘；94℃30秒，58℃45秒，72℃45秒，共30個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10分鐘。
由于使用P3和P4作為引物，所以得到的chIL-2基因的5’端含有凝血因子X(jué)a特異性水解序列編碼核苷酸序列(即，Xa-chIL-2)經(jīng)測(cè)序表明，擴(kuò)增得到的chIL-2基因具有如SEQ ID NO1中第1483-1905位所示的核苷酸序列。
實(shí)施例3.DNA疫苗的制備1.重組質(zhì)粒pMD18-T-pEtK2的構(gòu)建(見(jiàn)圖3)取實(shí)施例1中獲得的PCR產(chǎn)物50μl，1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說(shuō)明書(shū)。取純化的PCR產(chǎn)物與經(jīng)BamHI和EcoRI酶切后線(xiàn)性化的pMD18-T載體連接，反應(yīng)體系如下PCR回收產(chǎn)物 4.0μlpMD18-T載體 1.0μlLigation solution I 5.0μl總體積 10.0μl將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切及測(cè)序等鑒定，確定為pMD18-T-pEtK2。
2.重組質(zhì)粒pET-Xa-chIL-2的構(gòu)建(見(jiàn)圖4)取實(shí)施例2中獲得的PCR產(chǎn)物50μl，1％瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下切下目的條帶處瓊脂糖凝膠，用大連寶生物公司的膠回收試劑盒回收純化目的片段，方法參照說(shuō)明書(shū)。取純化的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28(+)，分別用EcoRI和Sal I雙酶切，產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。然后將兩種純化產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物/EcoR I+Sal I(20ng/μl)5.0μlpET-28(+)/EcoRI+Sal I(25ng/μl) 2.0μl5×T4連接buffer 2.0μlT4DNA連接酶(2U/μl) 1.0μl總體積10.0μl將上述成分在薄壁eppendorf管中混合均勻后4℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21，提取質(zhì)粒，用EcoRI和SalI雙酶切及測(cè)序等鑒定，確定為pET-Xa-chIL-2。
3.重組質(zhì)粒pVAX1.0-pEtK2(或pcDNA4/HisMax-pEtK2)的構(gòu)建(見(jiàn)圖5)分別用BamHI和EcoRI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pMD18-T-pEtK2和pVAX1.0(或pcDNA4/His Max)，回收pEtK2目的基因和pVAX1.0(或pcDNA4/HisMax)大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，確定為pVAX1.0-pEtK2(或pcDNA4/His Max-pEtK2)DNA疫苗。
4.重組質(zhì)粒pcDNA-pEtK2-Xa-chIL-2的構(gòu)建(見(jiàn)圖6)分別用EcoRI+NotI雙酶切克隆質(zhì)粒載體pET-Xa-chIL-2和pVAX1.0-pEtK2(或pcDNA4/His Max-pEtK2)，然后回收Xa-chIL-2目的基因和pVAX1.0-pEtK2(或pcDNA4/His Max-pEtK2)大片段，按照合適比例進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，用EcoRI和NotI雙酶切鑒定，確定為pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2(pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2)DNA疫苗。
實(shí)施例4.免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗在雞體內(nèi)表達(dá)情況的檢測(cè)分別大量提取pVAX1.0-pEtK2(或pcDNA4/His Max-pEtK2)和pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2(pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2)重組質(zhì)粒，經(jīng)胸部肌肉注射14日齡雛雞100μg/只，7天后分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)1、RT-PCR檢測(cè)DNA疫苗的轉(zhuǎn)錄一步法提取肌肉總RNA，用RT-PCR法分別擴(kuò)增pEtK2基因和chIL-2基因。結(jié)果表明DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了轉(zhuǎn)錄(見(jiàn)圖7)。
2、Western-印跡檢測(cè)DNA疫苗的翻譯分別取注射部位(胸肌)和非注射部位肌肉(腿部)制樣，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，麗春紅染色，洗滌后加入5％脫脂奶粉封閉無(wú)關(guān)蛋白結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)，然后加入抗pEtK2重組蛋白免疫兔血清(一抗)作用1小時(shí)，洗滌緩沖液洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(二抗)作用1小時(shí)，最后DAB顯色液顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA疫苗在雞肌肉細(xì)胞內(nèi)獲得了很好的表達(dá)(見(jiàn)圖8)實(shí)施例5.本發(fā)明DNA疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果120羽1日齡雛雞，隨機(jī)分為4組，每組30羽。14日齡和21日齡時(shí)分別肌肉注射100μl PBS(第一組)、100μl PBS(第二組)、100μg pVAX 1.0-pEtK2(第三組)、100μg pVAX 1.0-pEtK2-Xa-chIL-2(第四組)。28日齡時(shí)分別經(jīng)口感染E.tenella孢子化卵囊0個(gè)(第一組)、105個(gè)(第二組)、105個(gè)(第三組)、105個(gè)(第四組)。對(duì)免疫保護(hù)效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
1、增重效果注射DNA疫苗前每組雞逐只稱(chēng)重，然后在攻蟲(chóng)前、攻蟲(chóng)后第7天對(duì)對(duì)應(yīng)的雞再逐只稱(chēng)重，觀察攻蟲(chóng)前、攻蟲(chóng)后雞的體重變化情況，然后計(jì)算平均增重和相對(duì)增重。平均增重1＝攻蟲(chóng)時(shí)重-首免時(shí)重；平均增重2＝最后撲殺時(shí)重-攻蟲(chóng)時(shí)重；相對(duì)增重＝(各試驗(yàn)組平均增重/非感染非免疫組平均增重)×100％。增重結(jié)果(見(jiàn)表1)表明，疫苗的注射對(duì)雞的增重?zé)o影響，即疫苗的毒副作用與PB S相當(dāng)。而攻蟲(chóng)后pVAX 1.0-pEtK2-Xa-chIL-2DNA疫苗免疫組增重與非感染非免疫組差異不顯著，說(shuō)明pVAX 1.0-pEtK2-Xa-chIL-2DNA疫苗具有明顯的保護(hù)作用。
表1本發(fā)明DNA疫苗的增重效果

同一列中含相同字母表示差異不顯著，不含相同字母表示差異顯著，不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(p＜0.05)。
2、每克糞便卵囊數(shù)攻蟲(chóng)后每天檢查糞便，第7天分別收集各組糞便，混勻后，每組各取10g，加入90mL蒸餾水制成10倍稀釋液，經(jīng)充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笥陲@微鏡下用紅細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)每克糞便中的蟲(chóng)卵數(shù)。
表2.每克糞便卵囊數(shù)

3、卵囊減少率卵囊減少率是判斷疫苗保護(hù)效果的另外一個(gè)指標(biāo)，其計(jì)算公式如下卵囊減少率＝[(感染非免疫組糞便卵囊排出數(shù)-試驗(yàn)組糞便卵囊排出數(shù))/感染非免疫組糞便卵囊排出數(shù)]×100％。
表3卵囊減少率

4、盲腸病變記分攻蟲(chóng)后第7天，每組取10只雞剖殺，觀察盲腸病變。按Johnson方法進(jìn)行盲腸病變記分。也就是將盲腸病變分為0～+4五個(gè)等級(jí)。0分表示正常，無(wú)肉眼病變；+1分盲腸壁有很少量散在的淤點(diǎn)，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常；+2分病變數(shù)量較多，盲腸內(nèi)容物明顯帶血，盲腸壁稍增厚，內(nèi)容物正常；+3分盲腸內(nèi)有多量血液或盲腸芯(血凝塊或灰白色干酪樣的香蕉型塊狀物)，盲腸壁肥厚明顯，盲腸中糞便含量少；+4分因充滿(mǎn)大量血液或腸芯而盲腸腫大，腸芯中含有糞渣或不含，死亡雞只也記+4分。兩側(cè)盲腸病變不一致時(shí)，以嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn)。相對(duì)病變記分＝(實(shí)驗(yàn)組病變記分/感染非免疫組病變記分)×100％(病變見(jiàn)圖9，10)。
表4.盲腸病變記分

注同一列中含相同字母表示差異不顯著，不含相同字母表示差異顯著，
不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(p＜0.05)。
5、抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)ACI是包括存活率、增重、病變、卵囊產(chǎn)量等多項(xiàng)參數(shù)，綜合評(píng)定后作為判定球蟲(chóng)耐藥性或藥物效力的指標(biāo)，也可用于球蟲(chóng)疫苗保護(hù)效果檢測(cè)的指標(biāo)。ACI判定公式ACI＝(存活率+相對(duì)增重率)-(病變值+卵囊值)。(ACI≥180為保護(hù)效果明顯，ACI＝160～179為保護(hù)效果一般，ACI＜160為無(wú)保護(hù)效果。)結(jié)果如表5，本發(fā)明的pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2 DNA疫苗ACI達(dá)到198.20，具有很好的免疫保護(hù)效果。
表5抗球蟲(chóng)指數(shù)(ACI)

用pcDNA4/His Max-pEtK2和pcDNA4/His Max-pEtK2-Xa-chIL-2分別相應(yīng)地代替pVAX1.0-pEtK2和pVAX1.0-pEtK2-Xa-chIL-2進(jìn)行了上述試驗(yàn)(其他對(duì)照、步驟及參數(shù)都完全相同)，也取得了令人滿(mǎn)意的近似結(jié)果(數(shù)據(jù)未給出)。
序列表<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗<210>1<211>1905<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>融合基因<220>
<221>CDS(鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2)<222>(1)..(1464)<220>
<221>蛋白酶凝血因子X(jué)a特異性水解序列的編碼序列<222>(1465)..(1482)<220>
<221>CDS(雞白介素-2基因)<222>(1483)..(1905)<400>1atg cca gca gcg tcc aag tca gac aaa ctg gct gcc acg ccg ggc atg 48Met Pro Ala Ala Ser Lys Ser Asp Lys Leu Ala Ala Thr Pro Gly Met1 5 10 15
ttt gtg cag cac tct aca gca gcc ttc agc gat agg tac aag ggc cag96Phe Val Gln His Ser Thr Ala Ala Phe Ser Asp Arg Tyr Lys Gly Gln20 25 30cgc gtg ttg ggc aag ggc agt ttc ggt gaa gtt att ttg tgc aaa gat 144Arg Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Glu Val Ile Leu Cys Lys Asp35 40 45aaa gta act gga cag gaa tat gcc gtg aag gtg att tca aaa cgg caa 192Lys Val Thr Gly Gln Glu Tyr Ala Val Lys Val Ile Ser Lys Arg Gln50 55 60gtg aag cag aag acg gac aaa gag ctg ctg ctc aag gag gtg gag ctc 240Val Lys Gln Lys Thr Asp Lys Glu Leu Leu Leu Lys Glu Val Glu Leu65 70 75 80ctt aag aag ctg gtc cac ccc aac atc atg aag ctc tac gag ttc ttc 288Leu Lys Lys Leu Val His Pro Asn Ile Met Lys Leu Tyr Glu Phe Phe85 90 95gag gac aag ggc tac ttc tac tta gtc aca gaa gtc tat acc ggc gga 336Glu Asp Lys Gly Tyr Phe Tyr Leu Val Thr Glu Val Tyr Thr Gly Gly100 105 110gag ctc ttc ggc gag atc atc agc aga aag agg ttc agc gag gtt gac 384Glu Leu Phe Gly Glu Ile Ile Ser Arg Lys Arg Phe Ser Glu Val Asp115 120 125gct gcc cgc atc att cga caa gtg ctt tcg ggc att acg tat atg cac 432Ala Ala Arg Ile Ile Arg Gln Val Leu Ser Gly Ile Thr Tyr Met His130 135 140
aag aac aaa atc gtt cac aga gac ctc aag cct gaa aat ctg ctg ctg 480Lys Asn Lys Ile Val His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu145 150 155160gaa aac aaa aga aaa gat gct aac att cgc atc att gac ttc ggc ctt 528Glu Asn Lys Arg Lys Asp Ala Asn Ile Arg Ile Ile Asp Phe Gly Leu165 170 175tcc act cac ttt gag tcc acc aag gaa atg aag gac aag atc gga acg 576Ser Thr His Phe Glu Ser Thr Lys Glu Met Lys Asp Lys Ile Gly Thr180 185 190gcc tat tac att gcc cca gag gtc ttg cat ggg gcc tac gac gag aag 624Ala Tyr Tyr Ile Ala Pro Glu Val Leu His Gly Ala Tyr Asp Glu Lys195 200 205tgc gac gtg tgg tcc aca ggg gtc att ttg tat atc ctt ctt tct gga 672Cys Asp Val Trp Ser Thr Gly Val Ile Leu Tyr Ile Leu Leu Ser Gly210 215220tgc ccc cca ttt aac ggg gca aac gaa ttt gac att ttg aag aaa gtc 720Cys Pro Pro Phe Asn Gly Ala Asn Glu Phe Asp Ile Leu Lys Lys Val225 230 235 240gaa aaa gga aag ttc acc ttg gat ctg ccg caa tgg aag aag gtg agc 768Glu Lys Gly Lys Phe Thr Leu Asp Leu Pro Gln Trp Lys Lys Val Ser245 250 255gag tca gcc aaa gac ttg att cgt aag atg ctg gcg tac gtg ccc aca 816Glu Ser Ala Lys Asp Leu Ile Arg Lys Met Leu Ala Tyr Val Pro Thr
260 265 270atg cgg ata tct gca cga gac gcc ctc gag cac gag tgg ctc aag act 864Met Arg Ile Ser Ala Arg Asp Ala Leu Glu His Glu Trp Leu Lys Thr275280285aca gac gca gcc act gac agt att gat gtg cct tcg ctt gag agc acc 912Thr Asp AlaAla Thr Asp Ser Ile Asp Val Pro Ser Leu Glu Ser Thr290295300ata ctt aac atc aga cag ttc cag ggg acg caa aag ctt gcc gcg gct 960Ile Leu Asn Ile Arg Gln Phe Gln Gly Thr Gln Lys Leu Ala Ala Ala305310315320gcg ctg ctc tat atg ggc agc aag ctg acc acc aac gaa gag aca gtt 1008Ala Leu Leu Tyr Met Gly Ser Lys Leu Thr Thr Asn Glu Glu Thr Val325330335gag ctc aac aag att ttc caa agg atg gac aaa aac gga gat ggc cag 1056Glu Leu Asn Lys Ile Phe Gln Arg Met Asp Lys Asn Gly Asp Gly Gln340345350ctt gat aag cag gag ctc atg gaa ggc tac gtg gag ctg atg aag ctg 1104Leu Asp Lys Gln Glu Leu Met Glu Gly Tyr Val Glu Leu Met Lys Leu355360365aaa ggc gaa gac gtt tcg gcg ctg gac cag agc gcc atc gag ttc gag 1152Lys Gly Glu Asp Val Ser Ala Leu Asp Gln Ser Ala Ile Glu Phe Glu370375380gtg gag cag gtg ctc gac gct gtg gac ttt ggc aag aac ggc ttc ata 1200
Val Glu Gln Val Leu Asp Ala Val Asp Phe Gly Lys Asn Gly Phe Ile385 390 395400gag tac tcg gag ttc gtc aca gtg gca atg gac cgc aag aca ctc ttg 1248Glu Tyr Ser Glu Phe Val Thr Val Ala Met Asp Arg Lys Thr Leu Leu405 410415tct cgc cag cga ctg gaa aga gcc ttt gga atg ttc gac gct gac ggc 1296Ser Arg Gln Arg Leu Glu Arg Ala Phe Gly Met Phe Asp Ala Asp Gly420 425 430tcg ggc aag att tcc tct tca gag ttg gcc acc ata ttc ggg gtg agc 1344Ser Gly Lys Ile Ser Ser Ser Glu Leu Ala Thr Ile Phe Gly Val Ser435 440445gag gtc gac tcc gaa acc tgg cgc cgc atc ctc gcg gag gtg gac aga 1392Glu Val Asp Ser Glu Thr Trp Arg Arg Ile Leu Ala Glu Val Asp Arg450 455 460aac aac gac ggg gaa gtg gac ttt gag gag ttc cgg cag atg ctc ctg 1440Asn Asn Asp Gly Glu Val Asp Phe Glu Glu Phe Arg Gln Met Leu Leu465 470 475 480aag ttg tgc gga gat acc gcg gcg gaattcccta ccctcgat atg tgc aaa 1491Lys Leu Cys Gly Asp Thr Ala Ala Met Cys Lys485490gta ctg atc ttt ggc tgt att tcg gta gca acg cta atg act aca gct 1539Val Leu Ile Phe Gly Cys Ile Ser Val Ala Thr Leu Met Thr Thr Ala495500 505
tat gga gca tct cta tca tca gca aaa agg aaa cct ctt caa aca tta 1587Tyr Gly Ala Ser Leu Ser Ser Ala Lys Arg Lys Pro Leu Gln Thr Leu510 515 520ata aag gat tta gaa ata ttg gaa aat atc aag aac aag att cat ctc 1635Ile Lys Asp Leu Glu Ile Leu Glu Asn Ile Lys Asn Lys Ile His Leu525 530535gag ctc tac aca cca act gag acc cag gag tgc acc cag caa act ctg 1683Glu Leu Tyr Thr Pro Thr Glu Thr Gln Glu Cys Thr Gln Gln Thr Leu540 545 550 555cag tgt tac ctg gga gaa gtg gtt act ctg aag aaa gaa act gaa gat 1731Gln Cys Tyr Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Lys Lys Glu Thr Glu Asp560 565 570gac act gaa att aaa gaa gaa ttt gta act gct att caa aat atc gaa 1779Asp Thr Glu Ile Lys Glu Glu Phe Val Thr Ala Ile Gln Asn Ile Glu575 580 585aag aac ctc aag agt ctt acg ggt cta aat cac acc gga agt gaa tgc 1827Lys Asn Leu Lys Ser Leu Thr Gly Leu Asn His Thr Gly Ser Glu Cys590 595 600aag atc tgt gaa gct aac aac aag aaa aaa ttt cct gat ttt ctc cat 1875Lys Ile Cys Glu Ala Ash Asn Lys Lys Lys Phe Pro Asp Phe Leu His605 610 615gaa ctg acc aac ttt gtg aga tat ctg caa 1905Glu Leu Thr Asn Phe Val Arg Tyr Leu Gln620 62權(quán)利要求
1.一種柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗，該疫苗包含其中插入了柔嫩艾美耳球蟲(chóng)鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2的真核質(zhì)粒載體。
2.按權(quán)利要求1所述的DNA疫苗，其中進(jìn)一步還包含與所述基因pEtK2連接在一起插入所述真核質(zhì)粒載體的雞白細(xì)胞介素-2基因。
3.按權(quán)利要求2所述的DNA疫苗，其中進(jìn)一步還包含在所述的基因pEtK2與基因chIL-2之間插入一段蛋白酶凝血因子X(jué)a特異性水解序列編碼核苷酸序列GAA TTC CCT ACCCTC GAT，組成一融合基因pEtK2-Xa-chIL-2。
4.權(quán)利要求3所述的DNA疫苗，其中所述的融合基因具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗，其中所述的真核質(zhì)粒載體為pcDNA3.0、pcDNA3.1、pVAX1.0或pcDNA4/His Max。
6.權(quán)利要求權(quán)利要求5中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗，其中所述的真核質(zhì)粒載體為pVAX1.0。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的DNA疫苗在制備預(yù)防或治療雞球蟲(chóng)病的藥物制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有預(yù)防和治療雞球蟲(chóng)病作用的免疫調(diào)節(jié)型的DNA疫苗。本疫苗含有柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Eimeria tenella)鈣調(diào)結(jié)合域蛋白激酶基因pEtK2和雞白細(xì)胞介素－2基因，并在chIL－2基因的5’端引入了一段蛋白酶特異性水解序列。本疫苗包含有多個(gè)T細(xì)胞免疫應(yīng)答元件，能夠有效地預(yù)防和治療雞的球蟲(chóng)病。
文檔編號(hào)A61K39/012GK1803195SQ200510124049
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日
發(fā)明者李祥瑞, 謝昆, 嚴(yán)若峰, 徐立新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)