專利名稱：一種重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療糖尿病并發(fā)性潰瘍的重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑。
背景技術(shù)：
糖尿病是全球高發(fā)性非傳染性疾病之一，后期患者的一個(gè)特殊問(wèn)題是足部及下肢發(fā)生潰瘍，很難治愈，目前臨床主要有維持、預(yù)防感染和營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)三種治療方法，但無(wú)法從根本上使組織再生，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。病人的潰瘍長(zhǎng)期不能愈合，并發(fā)感染，最終的結(jié)果是截肢。而血小板衍生生長(zhǎng)因子可促進(jìn)創(chuàng)面組織再生，增加糖尿病足的治愈率，降低截肢的危險(xiǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于治療糖尿病神經(jīng)病變性下肢潰瘍的重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑。
本發(fā)明所提供的重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑，每1000g含有如下重量的組分重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子 0.08-0.12g，透明質(zhì)酸鈉0.40-0.6g，羧甲基纖維素鈉20-30g，賴氨酸鹽酸鹽 4-6g，磷酸氫二鈉0.45-0.75g，磷酸二氫鈉0.04-0.06g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯 1.2-1.9g，對(duì)羥基苯甲酸丙酯 0.15-0.25g，氯化鈉7.50-8.0g，加水至1000g。
其中，該重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑優(yōu)選配方為，每1000g含有如下重量的組分重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子 0.1g，透明質(zhì)酸鈉0.5g，
羧甲基纖維素鈉24g，賴氨酸鹽酸鹽 5g，磷酸氫二鈉0.6g，磷酸二氫鈉0.05g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯 1.6g，對(duì)羥基苯甲酸丙酯 0.2g，氯化鈉7.8g，加水至1000g。
在本發(fā)明中，重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子優(yōu)選為重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子Thr6-PDGF-BB，該生長(zhǎng)因子可按照中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)(一種重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子及其編碼基因與表達(dá)方法，申請(qǐng)?zhí)?00410068993.2)進(jìn)行制備。
本發(fā)明通過(guò)篩選凝膠劑配方，將重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子(Thr6-PDGF-BB)制備為凝膠劑，可以直接涂覆于糖尿病神經(jīng)病變性下肢潰瘍的創(chuàng)口部位，效果良好，使用方便，具有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式


圖1為凝膠劑的制備工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、凝膠劑的制備凝膠劑的配方重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子0.1g，透明質(zhì)酸鈉 0.5g，羧甲基纖維素鈉 24g，賴氨酸鹽酸鹽5g，磷酸氫二鈉 0.6g，磷酸二氫鈉 0.05g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯1.6g，對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.2g，氯化鈉 7.8g，加注射用水到1000g。
所用的原料來(lái)源與標(biāo)準(zhǔn)如表1。
表1原料來(lái)源與標(biāo)準(zhǔn)表

其制備工藝流程如圖1所示，包括如下步驟(1)取80％重量的注射用水，加入氯化鈉、對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯，加熱使溶解；(2)將上述溶液放至室溫，加入磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，使溶解；(3)取此溶液的一半，加入羧甲基纖維素鈉，溶脹過(guò)夜，105℃滅菌20分鐘，得混合溶液I；(4)另一半溶液中加入賴氨酸鹽酸鹽、間甲酚使溶解，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，再加入透明質(zhì)酸鈉攪拌使溶解，得混合溶液II；(5)將重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子(Thr6-PDGF-BB)經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾加入到混合溶液II中，再與混合溶液I混合，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值到6.5-7.5，加注射用水補(bǔ)充到全量。
(6)分裝。
實(shí)施例2、凝膠劑指標(biāo)評(píng)價(jià)按照表2的配方制作對(duì)比例凝膠劑和本發(fā)明凝膠劑。
表2凝膠劑配方

一、質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)兩種凝膠劑進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)指標(biāo)包括外觀、pH、無(wú)菌、活度等方面。
外觀性狀直接目視觀察。
pH值取本品，參照中國(guó)藥典2005年版二部附錄VApH值測(cè)定法測(cè)定。
無(wú)菌取本品，依法(中國(guó)藥典2005年版三部附錄XIIA，薄膜過(guò)濾法)檢查，應(yīng)符合規(guī)定。
色譜法測(cè)定含量取本品，采用高效液相色譜法進(jìn)行測(cè)定。
活度采用MTT測(cè)定細(xì)胞增殖的方法，使用重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)確定效價(jià)。
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BALB/C 3T3細(xì)胞，棄去培養(yǎng)瓶中的完全培養(yǎng)液，以無(wú)血清DMEM潤(rùn)洗2～3次，胰蛋白酶消化后用測(cè)定培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以測(cè)定培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/ML，接種96細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100μl，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)2-3h。取rhPDGF-BB參考品，以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液溶解并稀釋至40U/ML，同法稀釋待測(cè)樣品，將已預(yù)稀釋的參考品和待測(cè)樣品以測(cè)定培養(yǎng)液于96孔板上以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行倍比梯度稀釋，工作12梯度濃度，每一梯度設(shè)2個(gè)復(fù)孔；將梯度稀釋好的參考品和待測(cè)樣品每孔加入100μl至已接種BALB/C 3T3細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，終體積為200μl(CMS胎牛血清終濃度為1％)；培養(yǎng)48h，取出每孔吸去100μl培養(yǎng)液后加入10μlMTT溶液，培養(yǎng)4h；棄去孔中全部液體加入200μl裂解液，吹打混勻后，用酶標(biāo)儀測(cè)量其A570值，橫坐標(biāo)為參考品濃度，縱坐標(biāo)為A570光吸收值的平均數(shù)，選用的回歸模型為4參數(shù)方程，并按以下公式計(jì)算結(jié)果待檢品效價(jià)＝標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)×待檢品預(yù)稀釋倍數(shù)/參考品預(yù)稀釋倍數(shù)×待檢品半效稀釋倍數(shù)/參考品半效稀釋倍數(shù)。
檢測(cè)結(jié)果如表3所示。
表3質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果

上述兩個(gè)凝膠劑的各項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)明顯差異，對(duì)其進(jìn)行影響因素試驗(yàn)。
二、影響因素實(shí)驗(yàn)高溫實(shí)驗(yàn)—由于本品為蛋白質(zhì)，是熱敏感藥物，因此確定影響因素實(shí)驗(yàn)的溫度為40℃，并同時(shí)進(jìn)行常規(guī)的保存條件2-8℃條件下的試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。由于本品的包裝材料需要采用對(duì)光和水蒸氣具有完全阻隔作用的鋁塑復(fù)合性材料作為包裝材料，因此，影響因素不進(jìn)行強(qiáng)光試驗(yàn)和高濕試驗(yàn)。
取重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠小試樣品，分別置于40℃烘箱和4℃的冰箱中，分別于5天、10天取樣，按照《中國(guó)藥典》2005版規(guī)定注射液穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項(xiàng)目的規(guī)定，對(duì)樣品的性狀、均勻性、含量、活度進(jìn)行考察，結(jié)果如表4-表9所示。
表4影響因素考察0天結(jié)果

表5影響因素考察4℃5天結(jié)果

表7影響因素考察40℃5天結(jié)果

表8影響因素考察4℃10天結(jié)果

表9影響因素考察40℃10天結(jié)果

根據(jù)影響因素實(shí)驗(yàn)考察的結(jié)果，對(duì)比例在40℃條件保存時(shí)，第10天出現(xiàn)沉淀物，色譜法測(cè)定的含量有一定的下降；而本發(fā)明凝膠劑則可以保持穩(wěn)定。
實(shí)施例3、凝膠劑對(duì)皮膚損傷創(chuàng)面的修復(fù)實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料1.糖尿病Wistar雄性大鼠36只，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所；2.凝膠劑采用實(shí)施例1的配方。
3.凝膠基質(zhì)不加入重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子Thr6-PDGF-BB，其余物質(zhì)用量與二、實(shí)驗(yàn)步驟1.制備全層皮膚缺損創(chuàng)面在試驗(yàn)前糖尿病Wistar大鼠單籠喂養(yǎng)1周，自由飲水與攝食。大鼠試驗(yàn)當(dāng)日禁食，用乙醚吸入麻醉，背部剃毛，75％酒精常規(guī)消毒。用直徑18mm的環(huán)鉆在糖尿病Wistar大鼠脊柱兩側(cè)各壓出1個(gè)圓形印跡(2.54cm2)，外科手術(shù)剪刀沿壓痕剪去全層皮膚(達(dá)深筋膜)，即每只大鼠背部各制成兩個(gè)圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面，止血備用。
2.試驗(yàn)分組將上述糖尿病Wistar大鼠36只隨機(jī)分成五組(1)空白對(duì)照組致傷后創(chuàng)面不給凝膠基質(zhì)，也不給Thr6-PDGF-BB治療藥(n＝7)，涂以0.9％NaCl；(2)基質(zhì)對(duì)照組致傷后創(chuàng)面涂無(wú)Thr6-PDGF-BB的凝膠基質(zhì)(n＝7)。
(3)凝膠劑治療組，分為三個(gè)不同的劑量組3.5μg劑量治療組致傷后創(chuàng)面涂以凝膠劑，Thr6-PDGF-BB劑量為3.5μg/cm2(n＝8)；7.0μg劑量治療組致傷后傷面涂以凝膠劑，Thr6-PDGF-BB劑量為7.0μg/cm2(n＝7)；14.0μg劑量治療組致傷后傷面涂以凝膠劑，Thr6-PDGF-BB劑量為14μg/cm2(n＝7)。
3.給藥方法將糖尿病Wistar大鼠每個(gè)創(chuàng)面滴注試劑，并涂布均勻，用單層油紗布(紹興福清衛(wèi)生用品有限公司)和4-6層無(wú)菌紗布覆蓋，再用3M膠帶固定。動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，每天給藥1次，至傷后12d。
三、評(píng)價(jià)指標(biāo)及方法1.測(cè)定血糖血糖測(cè)定儀(韓國(guó)，Blood Glucose Test Meter，GlucoDrTM)測(cè)定糖尿病Wistar大鼠血糖。分別于手術(shù)當(dāng)天和傷后3、7、10和14d，剪鼠尾將血吸入血糖測(cè)試條內(nèi)，在11秒即可顯示血糖讀數(shù)(mmol/L)。
2.稱體重用電子天平(精確度為g)分別于手術(shù)當(dāng)天和傷后3、7、10和14d對(duì)各組糖尿病Wistar大鼠稱重(g)。
3.測(cè)量傷腔容量傷后0、2、3、4、5、6和7d用向傷腔內(nèi)滴注生理鹽水，記錄滴至傷腔液面與創(chuàng)緣皮膚相平時(shí)的液量(ml/創(chuàng)面)。
4.測(cè)定創(chuàng)面面積傷后0、3、7、10和14d用透明載玻片覆蓋創(chuàng)面，用記號(hào)筆沿創(chuàng)面邊緣描繪出創(chuàng)面，再用平整厚度均勻的透明塑料膜復(fù)制并剪下該創(chuàng)面圖樣，以萬(wàn)分之一電子分析天平(西德，Sartorius A 120S)稱取透明塑料膜圖樣的質(zhì)量，并換算成相應(yīng)創(chuàng)面的面積(首先稱取透明塑料膜單位面積的質(zhì)量，g/cm2)。
5.創(chuàng)面收縮百分率測(cè)定糖尿病Wistar大鼠創(chuàng)面愈合過(guò)程創(chuàng)面收縮百分率(％)，即測(cè)定傷后某天(n)創(chuàng)面收縮面積與原創(chuàng)面面積的比率，某天創(chuàng)面是指某天開(kāi)放創(chuàng)面面積或開(kāi)放創(chuàng)面面積與再上皮化面積的總面積(cm2)。分別于傷后0、3、7、10和14d用透明塑料上畫(huà)出該創(chuàng)面的邊緣。再用上面介紹的稱重法測(cè)量計(jì)算創(chuàng)面的面積，并計(jì)算創(chuàng)面收縮百分率(％)。創(chuàng)面收縮百分率通過(guò)下式計(jì)算Cn＝(A1-An)/A1式中Cn＝傷后某天(n)創(chuàng)面收縮百分率(％)A1＝最初創(chuàng)面面積(0d)An＝傷后某天創(chuàng)面面積(開(kāi)放創(chuàng)面或開(kāi)放創(chuàng)面與再上皮化的總面積)6.創(chuàng)面上皮化面積即測(cè)定傷后某天創(chuàng)面新生上皮面積(cm2)，某天創(chuàng)面新生上皮面積是指某天新生上皮從創(chuàng)緣向創(chuàng)面中心移行的上皮面積。肉眼觀察原創(chuàng)面邊緣與新生上皮起始邊緣至創(chuàng)心裸露創(chuàng)面(即無(wú)上皮)間的面積。分別于傷后0、3、7、10和14d用透明載玻片畫(huà)出該創(chuàng)面邊緣和新生上皮至創(chuàng)心的邊緣。再用稱重法測(cè)量計(jì)算創(chuàng)面的面積。
7.創(chuàng)面閉合百分?jǐn)?shù)測(cè)定糖尿病Wistar大鼠創(chuàng)面愈合過(guò)程中創(chuàng)面肉芽組織形成和表皮再上皮化情況。肉眼很容易從濕潤(rùn)肉芽組織辨別在創(chuàng)緣移行的上皮。傷后3、7、10和14d在透明塑料上描記上皮向創(chuàng)面中心移行的邊緣。用上面介紹的稱重法測(cè)量計(jì)算創(chuàng)面的面積，并計(jì)算創(chuàng)面閉合的百分率(％)。創(chuàng)面閉合百分率是某天創(chuàng)面以最初創(chuàng)面面積的百分率表示，通過(guò)下式計(jì)算
創(chuàng)面閉合(％)＝[(0d面積-Nd面積)/0d面積]×100％8.組織學(xué)觀察在傷后7d或14d活檢各組創(chuàng)面組織，進(jìn)行組織學(xué)觀察。以吸入致命劑量的乙醚處死大鼠，切取整個(gè)創(chuàng)面，包括5mm無(wú)損傷的正常皮膚，切至筋膜，放入10％甲醛液中固定。從創(chuàng)面中心部切開(kāi)，取其中一半用石臘包埋固定，蘇木精和曙紅(HE)染色、切片。用光學(xué)顯微鏡觀察組織肉芽組織、新生上皮生長(zhǎng)和炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)變化。
9.創(chuàng)面定時(shí)照相創(chuàng)面于0、3、7、10和14d定期照相，觀察了解各組在不同時(shí)間創(chuàng)面的愈合情況。
四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 11統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料組間和組內(nèi)不同時(shí)間的比較選用方差分析，所有數(shù)據(jù)均表示為x±s，P＜0.05和P＜0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示本發(fā)明凝膠劑治療組對(duì)糖尿病Wistar大鼠創(chuàng)面的修復(fù)有較好的促進(jìn)作用觀察發(fā)現(xiàn)在傷后3d，本發(fā)明凝膠劑治療組和對(duì)照組創(chuàng)面肉芽組織增生都不明顯，但治療組創(chuàng)面比對(duì)照組創(chuàng)面明顯新鮮，很容易出血，提示已有肉芽組織生長(zhǎng)形成；傷后4d治療組肉芽組織增生很明顯，創(chuàng)緣已有新生上皮向創(chuàng)面中心生長(zhǎng)移行；傷后5-7d治療組創(chuàng)面肉芽組織生長(zhǎng)很活躍(6d填充量達(dá)100％)，新生上皮向創(chuàng)面中心生長(zhǎng)移行略3-4mm，比兩個(gè)對(duì)照組顯著多(p＜0.05)；基質(zhì)對(duì)照和空白對(duì)照組4-7d肉芽組織生長(zhǎng)不太活躍，創(chuàng)面顯得蒼白，此后部分創(chuàng)面才有較多的肉芽組織生長(zhǎng)，創(chuàng)緣新生上皮生長(zhǎng)較少(1-3mm)。
從傷后3d開(kāi)始創(chuàng)面出現(xiàn)明顯收縮，治療組創(chuàng)面比對(duì)照組收縮小，3.5μg組與對(duì)照組相比差異顯著(p＜0.05)；傷后7d兩個(gè)對(duì)照組創(chuàng)面收縮百分率大約為60％，本發(fā)明凝膠劑治療組則為40％左右，兩者差異顯著(p＜0.05)；傷后14d治療組創(chuàng)面收縮率仍比對(duì)照組明顯小(p＜0.05)；傷后14d各組創(chuàng)面閉合率都在98.5％以上，組間沒(méi)有顯著性差異。
創(chuàng)面組織學(xué)觀察表明，本發(fā)明凝膠劑治療組傷后7d肉芽組織、新生毛細(xì)血管和新生上皮比兩個(gè)對(duì)照明顯多；傷后14d該組有較多的新合成的膠原，絕大多數(shù)創(chuàng)面已完全被多層新生上皮覆蓋；兩個(gè)對(duì)照組新合成的膠原較少，新生真皮較薄，新生上皮也比治療組少。結(jié)果表明，本發(fā)明凝膠劑有明顯促進(jìn)糖尿病并發(fā)性創(chuàng)面肉芽組織增生和創(chuàng)緣新生上皮生長(zhǎng)移行的作用，并有一定“抑制”和延遲創(chuàng)面收縮的作用。
權(quán)利要求
1.一種血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑，每1000g含有如下重量的組分血小板衍生生長(zhǎng)因子0.08-0.12g，透明質(zhì)酸鈉0.40-0.6g，羧甲基纖維素鈉20-30g，賴氨酸鹽酸鹽 4-6g，磷酸氫二鈉0.45-0.75g，磷酸二氫鈉0.04-0.06g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯 1.2-1.9g，對(duì)羥基苯甲酸丙酯 0.15-0.25g，氯化鈉7.50-8.0g，加水至1000g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑，其特征在于所述血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑每1000g含有如下重量的組分血小板衍生生長(zhǎng)因子0.1g，透明質(zhì)酸鈉0.5g，羧甲基纖維素鈉24g，賴氨酸鹽酸鹽 5g，磷酸氫二鈉0.6g，磷酸二氫鈉0.05g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯 1.6g，對(duì)羥基苯甲酸丙酯 0.2g，氯化鈉7.8g，加水至1000g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑，其特征在于所述血小板衍生生長(zhǎng)因子為重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子Thr6-PDGF-BB。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑。本發(fā)明所提供的血小板衍生生長(zhǎng)因子凝膠劑，每1000g含有如下重量的組分血小板衍生生長(zhǎng)因子0.08－0.12g，透明質(zhì)酸鈉0.40－0.6g，羧甲基纖維素鈉20－30g，賴氨酸鹽酸鹽4－6g，磷酸氫二鈉0.45－0.75g，磷酸二氫鈉0.04－0.06g，對(duì)羥基苯甲酸甲酯1.2－1.9g，對(duì)羥基苯甲酸丙酯0.15－0.25g，氯化鈉7.50－8.0g，加水至1000g。本發(fā)明通過(guò)篩選凝膠劑配方，將血小板衍生生長(zhǎng)因子制備為凝膠劑，可以直接涂覆于糖尿病神經(jīng)病變性下肢潰瘍的創(chuàng)口部位，效果良好，使用方便，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1814280SQ20051012426
公開(kāi)日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2005年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月29日
發(fā)明者陳薇, 于長(zhǎng)明, 付玲, 白森 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所, 北京勁邦生物工程有限公司