專利名稱：一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法。
背景技術(shù)：
脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的研究經(jīng)過(guò)了漫長(zhǎng)的歷程，早在1913年，Loewe就證實(shí)了真皮組織能增強(qiáng)移植皮的韌性、抑制肉芽組織生長(zhǎng)和瘢痕形成，降低創(chuàng)面攣縮程度，由此人們開(kāi)始注意到真皮組織在皮膚移植中的重要作用；1985年Heck等報(bào)道應(yīng)用異體真皮作為自體表皮的移植載體，將二者復(fù)合移植于動(dòng)物模型和燒傷患者的切痂創(chuàng)面，取得了較好的創(chuàng)面修復(fù)和抑制瘢痕增生的效果。但此后的應(yīng)用和研究發(fā)現(xiàn)，同種異體皮膚移植所發(fā)生的免疫排斥反應(yīng)主要源于表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等細(xì)胞，由此推動(dòng)了真皮的無(wú)細(xì)胞化研究(陳斌等.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的研究進(jìn)展.中國(guó)美容醫(yī)學(xué)2001，10(4)358-359.)。1995年，Livesey等首先報(bào)告制成脫細(xì)胞真皮(LIVESEYSA，KERNDON DN.HOLLYOAK MA，et al.Transplanted acellular allograft dermalmatrix.Potential as a template for the reconstruction of viabledermis[J].Transplantation，1995，601-9.)。Wainwright用人的皮膚制成脫細(xì)胞真皮(WAINWRTIGHT DJ.Use of an acellular allograft deMal matrix(AlloDerm)in the management full-thickness bums[J].Burns，1995.21243-248.)。隨后又有研究者將培養(yǎng)的自體表皮細(xì)胞膜片復(fù)合脫細(xì)胞異體真皮基質(zhì)移植修復(fù)全層皮膚缺損獲得成功。美國(guó)LifeCell公司將這一成果商品化，用新鮮的人尸體皮制成脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，命名為AlloDerm，并通過(guò)了美國(guó)FDA的批準(zhǔn)進(jìn)入了醫(yī)用生物材料市場(chǎng)。2000年，香港中文大學(xué)威爾斯親王醫(yī)院陳斯賢、林炳權(quán)等將人體自體培養(yǎng)的表皮細(xì)胞復(fù)合在Integra基質(zhì)上成功3例。國(guó)內(nèi)陳璧等最早開(kāi)始對(duì)異體真皮脫細(xì)胞處理和臨床應(yīng)用研究(崔正軍.陳壁，等.復(fù)合皮研究中去除真皮中上皮成分的方讓和意義[J].中華整形燒傷外科雜志，1997.13(1)37-39.)。1998年，孫永華等報(bào)道37例燒傷患者III度創(chuàng)面和瘢痕切除后，進(jìn)行異體脫細(xì)胞真皮+自體薄皮片移植，成活平均為(96.2±3.4)％，創(chuàng)面收縮輕，外觀平整，功能良好，臨床效果滿意(孫永華，李遲，王春元，等.脫細(xì)胞異體真皮與自體薄皮片移植的研究與應(yīng)用[J].中華整形燒傷外科雜志.1998，14(4)370-373.)。2001年，馮祥生、譚家駒、潘銀根等報(bào)道異種豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體表皮復(fù)合移植修復(fù)23例燒傷患者III度創(chuàng)面及瘢痕切除創(chuàng)面以及作為軟組織凹陷患者的充填材料，成活的復(fù)合皮膚平坦、有彈性、顏色及遠(yuǎn)期效果同正常皮膚，表面光滑、外觀平整、觸軟、皮膚可捏起，無(wú)瘢痕增生或輕度瘢痕增生，臨床效果滿意(馮祥生，潘銀根，譚家駒，等.異種(豬)脫細(xì)胞真皮與自體表皮復(fù)合移植研究[J].中華整形外科雜志.2000.16(1)40-42.)。江蘇啟東醫(yī)用材料研究所在此理論基礎(chǔ)上推出了異種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，并已獲得了SFDA的批準(zhǔn)進(jìn)入臨床應(yīng)用于燒傷創(chuàng)面的覆蓋。隨著脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在燒傷領(lǐng)域的應(yīng)用成功，口腔粘膜缺損的修復(fù)也漸漸引起了人們的關(guān)注，并有部分學(xué)者就脫細(xì)胞真皮基質(zhì)修補(bǔ)口腔粘膜缺損進(jìn)行了臨床研究。2003年4月，法永紅、李志韌、蔡興偉應(yīng)用脫細(xì)胞真皮修復(fù)口腔頜面外科皮膚、粘膜缺損并取得了滿意的效果(法永紅，李志韌，等.異體軟組織修復(fù)材料在口腔頜面部缺損中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志2004.18(1)67-68.)；同年8月，石冰、宋慶高等應(yīng)用組織工程化口腔粘膜修復(fù)裸露上顎取得了不錯(cuò)的效果(石冰、宋慶高等.組織工程化口腔黏膜移植修復(fù)裸露硬腭對(duì)上頜骨生長(zhǎng)發(fā)育影響的研究華西口腔醫(yī)學(xué)雜志2003.8 255-258.)。國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，北京桀亞公司、北京清源偉業(yè)生物組織工程科技有限公司將脫細(xì)胞真皮基質(zhì)應(yīng)用于皮膚缺損修復(fù)和口腔粘膜缺損修復(fù)的產(chǎn)品中，并均已取得了中國(guó)SFDA的批準(zhǔn)。同種異體脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，具有以下特點(diǎn)①抗原性??；②低毒性；③植入后有新生血管和成纖維細(xì)胞長(zhǎng)入。但同時(shí)存在著一些不足1、原料來(lái)源狹窄，有倫理方面的顧慮，不易普及；2、價(jià)格昂貴；3、有傳播病毒的危險(xiǎn)。
盡管已有異種脫細(xì)胞真皮的應(yīng)用，但目前脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法中為了降低材料的免疫原性，方法中都使用化學(xué)固定劑，如戊二醛等，這將大大改變了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，并阻礙了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)在生物體內(nèi)的降解。另外，目前的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)制備方法中都沒(méi)有考慮如何殺滅瘋牛病等人畜共患病病原體的方法，這使得脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的臨床應(yīng)用承擔(dān)了一定的風(fēng)險(xiǎn)。
動(dòng)物源性醫(yī)療器械種類(lèi)廣泛。動(dòng)物組織和其衍生物在其特性方面要優(yōu)于無(wú)生命體材料如金屬、塑料或者紡織品。動(dòng)物組織原料的數(shù)量和品種也是多樣的。這些原料作為醫(yī)療器械的主要組成(如豬、牛的心臟，羊腸縫合線、止血?jiǎng)┑?，產(chǎn)品外結(jié)構(gòu)或者鞏固體(如肝磷脂、凝膠、膠原等)，或者用于生產(chǎn)加工過(guò)程(如動(dòng)物脂)。目前動(dòng)物源性醫(yī)療器械產(chǎn)品市場(chǎng)前景廣闊。人畜共患并特別是瘋牛并為動(dòng)物源性醫(yī)療器械帶來(lái)了風(fēng)險(xiǎn)。早在發(fā)現(xiàn)?；集偱２r(shí)，英國(guó)、德國(guó)、法國(guó)等國(guó)的專家學(xué)者就開(kāi)始了對(duì)其它動(dòng)物易感性及與人類(lèi)得到感染的可能性進(jìn)行了系統(tǒng)的科學(xué)研究。研究證實(shí)，瘋牛病可以實(shí)驗(yàn)感染的其它動(dòng)物有鼠、牛、綿羊、山羊、豬、水貉等等。英國(guó)野生動(dòng)物園的長(zhǎng)角羚及德國(guó)動(dòng)物園駝鳥(niǎo)均發(fā)生瘋牛病。英國(guó)還有69只貓吃了牛肉(骨)為所制成的動(dòng)物飼料后感染了瘋牛病的報(bào)道。至1997年2月底，英國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了17例新型克雅-氏綜合癥人。估計(jì)，英國(guó)感染上新型克雅氏綜合癥的人多達(dá)200萬(wàn)人，此病的潛伏期為10-30年，10年后有可能會(huì)出現(xiàn)克雅氏綜合癥大流行。目前，瘋牛病病原體的滅活方法很有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種殺滅細(xì)菌、病毒及瘋牛病等病原體的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
本發(fā)明所提供的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，是將哺乳動(dòng)物皮膚依次用氫氧化鈉溶液和去污劑處理后得到的產(chǎn)品。
所述氫氧化鈉溶液的濃度為2-5N，去污劑可為質(zhì)量百分濃度為1-5％的吐溫-80、吐溫-20、TRITON-X100或其它化學(xué)去污劑。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種上述脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法。
本發(fā)明所提供的上述脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下步驟1)剝離哺乳動(dòng)物體表皮膚；2)清除皮下附帶成分；3)清洗皮膚；4)將皮膚用2-5N氫氧化鈉溶液處理10-60分鐘；5)置換新的2-5N氫氧化鈉溶液，處理10-60分鐘；6)重復(fù)步驟5)1-3次；7)將步驟6)經(jīng)氫氧化鈉溶液處理的皮膚用質(zhì)量百分濃度為1-5％的去污劑進(jìn)行處理；8)用去熱原水對(duì)皮膚進(jìn)行清洗，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
在上述制備方法中，步驟1)中可用于制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的哺乳動(dòng)物的選擇是多種多樣的，包括豬、牛、羊、馬或兔等。
步驟2)中的皮下附帶成分是指哺乳動(dòng)物皮下附帶的脂肪，肌肉和毛發(fā)等成分。
步驟4)-6)中氫氧化鈉溶液的濃度優(yōu)選為2N，處理時(shí)間優(yōu)選為20-30分鐘；步驟6)中重復(fù)處理的次數(shù)為1即可。
步驟7)中所用的去污劑可為吐溫-80、吐溫-20、TRITON-X100或其它化學(xué)去污劑，優(yōu)選為吐溫-80；去污劑處理時(shí)間可為10-60分鐘，優(yōu)選為30分鐘。
用上述方法制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)可保存于磷酸鹽緩沖溶液(phosphatebuffered saline，PBS)中。
本發(fā)明提供了一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法。在該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法中，采用氫氧化鈉溶液對(duì)其進(jìn)行處理的目的是充分殺滅瘋牛病等人畜共患病的病原體，還可以有效地去除組織中細(xì)胞的遺傳物質(zhì)-DNA；使用去污劑的目的是去除細(xì)胞膜中的脂類(lèi)物質(zhì)。本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)來(lái)源廣泛，生產(chǎn)成本低廉；2)有效去殺滅細(xì)菌、病毒以及瘋牛病等病原體，消除了人畜共患病傳播的危險(xiǎn)；3)有效去除了材料的抗原性；4)處理過(guò)程中未使用固定劑，因而所制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)保留了天然結(jié)構(gòu)，可以被降解，并可有效地引導(dǎo)組織再生。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)1)有利于修復(fù)細(xì)胞長(zhǎng)入其中，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞及新生膠原沿其組織結(jié)構(gòu)排列成編織狀，愈合后近似正常組織的結(jié)構(gòu)；2)組織相容性較好，易與自體組織融合；3)排異反應(yīng)?。?)可有效改善創(chuàng)面愈合過(guò)程中的組織順應(yīng)性，對(duì)細(xì)胞及組織順應(yīng)性的影響可能對(duì)創(chuàng)面愈合及減少瘢痕的過(guò)度增生具有積極作用。其作為一種新型生物材料是安全、有效的，可用于皮膚創(chuàng)傷修復(fù)，口腔黏膜缺損修復(fù)，疝修復(fù)，泌尿系統(tǒng)組織缺損等軟組織修復(fù)。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。


圖1為脫細(xì)胞真皮基質(zhì)經(jīng)凍干后的照片圖2為脫細(xì)胞真皮基質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的電鏡觀察結(jié)果圖3為人成纖維細(xì)胞在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上生長(zhǎng)的熒光照片圖4A為對(duì)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行大鼠皮下包埋實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)操作4B為植入后第1周取樣制作成的組織學(xué)切片的觀察結(jié)果圖4C為植入后第4周取樣制作成的組織學(xué)切片的觀察結(jié)果圖5為脫細(xì)胞真皮基質(zhì)DNA殘留情況的PCR檢測(cè)結(jié)果圖6為用脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對(duì)右上頜惡性纖維組織細(xì)胞瘤病例進(jìn)行口腔軟組織淺層缺損修復(fù)手術(shù)過(guò)程中的照片圖7為術(shù)后2周創(chuàng)面區(qū)的照片圖8為術(shù)后第1、2、3、4、6、12周四個(gè)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合情況的觀察結(jié)果圖9為在電鏡及光鏡下對(duì)本發(fā)明脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的正、反面進(jìn)行觀察的結(jié)果圖10為術(shù)后1周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果圖11為術(shù)后2周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果圖12為術(shù)后4周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果圖13為術(shù)后6周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果圖14為術(shù)后12周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果圖15為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面皮膚組織的皮膚組織順應(yīng)性比較結(jié)果
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，所述百分比濃度均為質(zhì)量百分濃度，所用引物均由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。
實(shí)施例1、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備以羊?yàn)橹苽涿摷?xì)胞真皮基質(zhì)的材料來(lái)源，具體制備過(guò)程包括如下步驟1)剝離羊的體表皮膚；2)清除皮下脂肪，肌肉和毛發(fā)等附帶成分；3)用清水將皮膚清洗干凈；4)用2N氫氧化鈉溶液對(duì)皮膚處理40分鐘；5)置換新的2N氫氧化鈉溶液，再處理40分鐘；6)將步驟5)重復(fù)一次；7)用5％吐溫-80對(duì)皮膚處理20分鐘；8)用去熱原水對(duì)經(jīng)上述步驟處理的皮膚充分清洗，去掉化學(xué)成分殘留，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，將其保存于PBS中。
實(shí)施例2、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備以牛為制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的材料來(lái)源，具體制備過(guò)程包括如下步驟1)剝離牛的體表皮膚；2)清除皮下脂肪，肌肉和毛發(fā)等附帶成分；3)用清水將皮膚清洗干凈；4)用5N氫氧化鈉溶液對(duì)皮膚處理30分鐘；5)置換新的5N氫氧化鈉溶液，再處理30分鐘；6)將步驟5)重復(fù)二次；7)用1％TRITON-X100，對(duì)皮膚處理30分鐘；8)用去熱原水對(duì)經(jīng)上述步驟處理的皮膚充分清洗，去掉化學(xué)成分殘留，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，將其保存于PBS中。
實(shí)施例3、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的結(jié)構(gòu)觀察及檢測(cè)一、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的電鏡結(jié)構(gòu)觀察實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)經(jīng)凍干后的照片如圖1所示，再對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)用電鏡進(jìn)行觀察，如圖2所示，表明材料空間保持20-100微米大小的空隙，所制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)適合于各類(lèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)。
二、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的生物相容性檢測(cè)將人成纖維細(xì)胞接種于實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)上，接種的細(xì)胞數(shù)為106個(gè)，在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察人成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，接種后細(xì)胞的生長(zhǎng)情況如圖3所示，人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，表明所制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)具有很好的細(xì)胞相容性。
三、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的免疫原性檢測(cè)對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行大鼠皮下包埋實(shí)驗(yàn)，以檢測(cè)其是否可引起動(dòng)物免疫原性反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)操作如圖4A所示，分別于植入后第1和第4周后取樣，將其制作成組織學(xué)切片進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4B和圖4C所示，表明該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)不引起明顯的免疫原性反應(yīng)。
四、國(guó)家藥檢局檢評(píng)中心的檢測(cè)將實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)送交國(guó)家藥檢局SFDA濟(jì)南檢測(cè)中心，對(duì)該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如下1)無(wú)菌 合格2)細(xì)菌內(nèi)毒素小于0.5Eu/mL 合格3)溶血率0.8％(應(yīng)不大于5％) 合格4)細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于1級(jí) 合格5)無(wú)皮膚致敏反應(yīng) 合格6)無(wú)皮內(nèi)刺激反應(yīng) 合格以上所檢測(cè)指標(biāo)均認(rèn)定合格，并認(rèn)定該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)具有較低的免疫原性和較好的可降解性。
五、PCR檢測(cè)脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的DNA殘留情況用PCR的方法對(duì)實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的DNA殘留情況進(jìn)行檢測(cè)。從材料中提取DNA并以此為模板，陰性對(duì)照模板為水，陽(yáng)性對(duì)照模板取自動(dòng)物皮膚抽提的DNA，在引物15’-acgactcactatagggcttttttttttttgc-3’和引物25’-acaatttcacacaggatacaa cgagg-3’的引導(dǎo)下，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為先95℃2分鐘；再94℃15秒，49℃30秒，72℃90秒，共5個(gè)循環(huán)；然后94℃15秒，60℃30秒，72℃90秒，共37個(gè)循環(huán)；最后72℃7分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(泳道M為DNA Marker；水為陰性對(duì)照；膠原1為脫細(xì)胞基質(zhì)制備過(guò)程中的中間產(chǎn)物；膠原2為未處理的皮膚組織；膠原3為所制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì))，表明從脫細(xì)胞基質(zhì)制備過(guò)程中的中間產(chǎn)物和未處理的皮膚組織中均檢測(cè)到DNA殘留，而從所制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)中未檢測(cè)到DNA殘留，證明本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法能徹底脫除細(xì)胞殘留成分。
實(shí)施例4、口腔軟組織淺層缺損修復(fù)的臨床試驗(yàn)選擇右上頜惡性纖維組織細(xì)胞瘤病例6例，門(mén)診4例，病房2例。用實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(規(guī)格5×5cm)對(duì)上述口腔軟組織淺層缺損病例進(jìn)行修復(fù)試驗(yàn)，手術(shù)過(guò)程如圖6所示。術(shù)后2周拆包，觀察創(chuàng)面區(qū)成活情況，如圖7所示，創(chuàng)面區(qū)顏色接近自體組織，表明本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對(duì)有軟組織或骨面支撐的病例具有較好的修復(fù)效果。
實(shí)施例5、皮膚修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的對(duì)于皮膚缺損的手術(shù)后創(chuàng)面愈合是否具有改善作用，以評(píng)價(jià)其有效性及安全性。具體的實(shí)驗(yàn)方法為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF級(jí)雄性SD大鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重230-300g，于術(shù)前一天硫化鋇脫毛，經(jīng)2.5％戊巴比妥鈉(35mg/kg體重)腹腔注射麻醉，消毒，將動(dòng)物隨機(jī)分為4個(gè)處理組正常對(duì)照組、單純創(chuàng)傷組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)的動(dòng)物數(shù)為6只。對(duì)上述四組動(dòng)物進(jìn)行如下處理正常對(duì)照組動(dòng)物不做特殊處理；其余三組動(dòng)物于SD大鼠背部正中切取2.5cm×2.5cm的全層皮膚，單純創(chuàng)傷組創(chuàng)面不做植皮處理，包扎后任其自然愈合；陽(yáng)性對(duì)照組創(chuàng)面應(yīng)用已商品化的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(ADM)并移植自體刃厚皮；實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面應(yīng)用實(shí)施例1和實(shí)施例2制備的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)并移植自體刃厚皮，用無(wú)菌紗布包扎。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下一、大體觀察結(jié)果于術(shù)后第1、2、3、4、6、12周觀察創(chuàng)面愈合情況，結(jié)果如圖8所示(圖8中的A為正常對(duì)照組)。單純創(chuàng)傷組術(shù)后創(chuàng)面收縮明顯，上皮化后創(chuàng)面呈線性(見(jiàn)圖8中的B-D圖，B單純對(duì)照組術(shù)后1周創(chuàng)面；C單純對(duì)照組術(shù)后3周創(chuàng)面；D單純對(duì)照組術(shù)后12周愈合創(chuàng)面)。陽(yáng)性對(duì)照組術(shù)后1周時(shí)移植皮片轉(zhuǎn)色，創(chuàng)面愈合良好，術(shù)后4周移植皮片生長(zhǎng)良好(見(jiàn)圖8中的E和G圖，E陽(yáng)性對(duì)照組術(shù)后1周創(chuàng)面；G陽(yáng)性對(duì)照組術(shù)后4周創(chuàng)面)，而實(shí)驗(yàn)組植入材料最初只用手術(shù)刀做線性小切口，應(yīng)用于創(chuàng)面后易形成皮下血腫甚或皮片干結(jié)壞死，部分較好的可局部存活(見(jiàn)圖8中的F和H圖，F(xiàn)實(shí)驗(yàn)組(改進(jìn)前)術(shù)后1周移植皮片干結(jié)壞死；H實(shí)驗(yàn)組(改進(jìn)前)術(shù)后4周時(shí)愈合較好的創(chuàng)面(局部存活))。對(duì)實(shí)驗(yàn)組中所用的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的正、反面在電鏡及光鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖9所示(A脫細(xì)胞真皮基質(zhì)反面表面(真皮面)電鏡照片；B脫細(xì)胞真皮基質(zhì)正面表面(表皮面)電鏡照片；C脫細(xì)胞真皮基質(zhì)光鏡下結(jié)構(gòu)(200倍))，脫細(xì)胞真皮基質(zhì)真皮面孔隙較少，不利于組織液滲透及引流，可能是導(dǎo)致皮片移植失敗的原因。據(jù)此，對(duì)手術(shù)方案進(jìn)行改進(jìn)改進(jìn)前給脫細(xì)胞真皮基質(zhì)打洞時(shí)是用手術(shù)刀在其上作線性切口，考慮到該生物膜結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)韌，如切口寬度不夠則仍不利于組織液的滲透及引流，改進(jìn)后，在給生物膜打孔過(guò)程中將切口的寬度加大(約0.5mm)，再于術(shù)后第1、4周進(jìn)行觀察，移植皮片可在術(shù)后1周轉(zhuǎn)色，創(chuàng)面愈合良好(見(jiàn)圖8中的I和J圖，I術(shù)后1周實(shí)驗(yàn)組(改進(jìn)后)創(chuàng)面愈合情況；J術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組(改進(jìn)后)創(chuàng)面愈合情況)，表明脫細(xì)胞真皮基質(zhì)經(jīng)上述處理后有利于移植皮片的生長(zhǎng)。上述觀察結(jié)果表明用本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)進(jìn)行皮膚修復(fù)可獲得較好的愈合效果。
二、光鏡觀察結(jié)果于術(shù)后第1、2、3、4、6、12周從四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面手術(shù)提取實(shí)驗(yàn)材料，留取組織學(xué)標(biāo)本的大小約為0.5cm×1cm，用10％福爾馬林固定，制成石蠟切片，作HE染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖10-14所示。
正常組對(duì)照組的皮膚組織細(xì)胞外基質(zhì)排列呈編織狀，其間可見(jiàn)少量深染的成纖維細(xì)胞，可見(jiàn)毛囊及汗腺結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖10-14中的A、E、I、M和Q圖)。
術(shù)后1周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果如圖10所示(A正常對(duì)照組的皮膚組織結(jié)構(gòu)；B單純創(chuàng)傷組，成纖維細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞與新生膠原平行排列于皮膚表面；C陽(yáng)性對(duì)照組，ADM中可見(jiàn)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞，ADM與自體組織間可見(jiàn)明顯間隙；D實(shí)驗(yàn)組，組織間隙可見(jiàn)組織結(jié)構(gòu)排列走行的成纖維細(xì)胞及新生膠原，細(xì)胞呈多角形。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體組織未融合，可見(jiàn)明顯間隙)，術(shù)后1-2周，單純創(chuàng)傷組創(chuàng)面尚未上皮化，創(chuàng)面由大量肉芽組織填充，組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，可見(jiàn)大量的排列密集的成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞呈梭形，與新生膠原平行排列于皮膚表面；細(xì)胞間隙中有少量纖細(xì)的膠原，尤以創(chuàng)面中心部分明顯；毛細(xì)血管增生明顯，走行方向與皮膚表面垂直。陽(yáng)性對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組植入的生物材料中均可見(jiàn)，組織間隙存在大量增生的成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞呈多角形，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中僅見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組生物材料中成纖維細(xì)胞多，細(xì)胞淡染。陽(yáng)性對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)少，細(xì)胞深染。術(shù)后2周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果如圖11所示(E正常對(duì)照組的皮膚組織結(jié)構(gòu)；F單純創(chuàng)傷組，成纖維細(xì)胞呈梭形，數(shù)量多，新生膠原纖細(xì)，平行于皮膚表面；G陽(yáng)性對(duì)照組，ADM中可見(jiàn)成纖維細(xì)胞，量少，ADM與自體組織易分辨；H實(shí)驗(yàn)組，成纖維細(xì)胞及新生膠原以生物膜組織結(jié)構(gòu)排列，細(xì)胞呈多角形。脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與自體組織融合，原結(jié)構(gòu)輪廓不易區(qū)分)，術(shù)后1周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組生物材料與移植自體皮間間隙大，尚未融合，術(shù)后2周時(shí)生物材料與自體皮已經(jīng)基本融合，無(wú)明顯間隙存在，且生物材料被成纖維細(xì)胞及新生的膠原填充，原材料結(jié)構(gòu)的輪廓已不明顯。陽(yáng)性對(duì)照組的生物材料鏡下為紫褐色，容易與移植自體皮及新生膠原相分辨，術(shù)后12周時(shí)與自體皮之間仍可見(jiàn)間隙存在(見(jiàn)圖14中的S圖)。
術(shù)后3-4周，單純創(chuàng)傷組完成上皮化，組織中仍可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞數(shù)量較術(shù)后早期明顯下降，細(xì)胞多呈長(zhǎng)梭形或屈曲狀，與皮膚表面平行排列，胞體大，淡染，新生膠原纖細(xì)、致密、平行于皮膚表面排列。實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，呈多角形，少見(jiàn)炎性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組生物材料輪廓不明顯，該部分細(xì)胞外基質(zhì)呈編織狀排列，但膠原仍較纖細(xì)。術(shù)后4周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果如圖12所示(I正常對(duì)照組的皮膚組織結(jié)構(gòu)；J單純創(chuàng)傷組，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少；K陽(yáng)性對(duì)照組，ADM中可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞，ADM輪廓清晰，被新生纖維組織包繞；L實(shí)驗(yàn)組，成纖維細(xì)胞及新生膠原與生物膜組織結(jié)構(gòu)不可分，組織呈編織狀排列，細(xì)胞數(shù)較多)。
術(shù)后6周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果如圖13所示(M正常對(duì)照組的皮膚組織結(jié)構(gòu)；N單純創(chuàng)傷組，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原逐漸變粗大；O陽(yáng)性對(duì)照組，ADM中可見(jiàn)少量深染成纖維細(xì)胞，ADM輪廓清晰可辨，與自體組織間仍可見(jiàn)間隙；P實(shí)驗(yàn)組，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，組織結(jié)構(gòu)呈編織狀排列，類(lèi)似正常組織結(jié)構(gòu))，術(shù)后6周時(shí)，各組成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯較少，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)較陽(yáng)性對(duì)照組多。
術(shù)后12周組織切片的光鏡(200倍)觀察結(jié)果如圖14所示(Q正常對(duì)照組的皮膚組織結(jié)構(gòu)，組織呈編織狀排列；R單純創(chuàng)傷組，成纖維細(xì)胞深染，膠原變粗大，集束狀；S陽(yáng)性對(duì)照組，ADM中可見(jiàn)少量深染成纖維細(xì)胞，ADM輪廓清晰可辨，與自體組織間仍可見(jiàn)間隙；T實(shí)驗(yàn)組，成纖維細(xì)胞數(shù)量明顯減少，組織結(jié)構(gòu)呈編織狀排列，接近正常組織結(jié)構(gòu))，術(shù)后12周，單純創(chuàng)傷組創(chuàng)面部分膠原變粗大、呈集束狀、排列逐漸趨向正常皮膚組織，可見(jiàn)少量的成纖維細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面膠原粗大、集束狀、排列呈編織狀，可見(jiàn)少量深染的成纖維細(xì)胞，接近正常皮膚組織的膠原排列。陽(yáng)性對(duì)照組植入的生物材料輪廓清晰。上述組織切片的光鏡觀察結(jié)果表明與陽(yáng)性對(duì)照組所用的ADM相比，本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)更有利于修復(fù)細(xì)胞的長(zhǎng)入，容易與自體組織融合。
異體或異種材料植入后會(huì)有不同程度的排異反應(yīng)，排異反應(yīng)過(guò)強(qiáng)不利于創(chuàng)面的愈合。在觀察中發(fā)現(xiàn)，與ADM相比，將本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)植入大鼠創(chuàng)面后，亦未見(jiàn)創(chuàng)面組織出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞尤其是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的現(xiàn)象，表明產(chǎn)生的排異反應(yīng)較小，其排異反應(yīng)程度對(duì)創(chuàng)面愈合的負(fù)面影響不大。
三、創(chuàng)面皮膚組織順應(yīng)性的檢測(cè)于術(shù)后第1、2、3、4、6、12周從四個(gè)實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面手術(shù)提取實(shí)驗(yàn)材料，檢測(cè)四個(gè)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面皮膚組織的組織順應(yīng)性，測(cè)定方法為自術(shù)后2周開(kāi)始于創(chuàng)面中部橫向切取寬0.5cm、兩端(始于創(chuàng)面周?chē)恼Ｆつw)距創(chuàng)緣各2.5cm的皮片一條，剪去皮下組織，測(cè)量標(biāo)本創(chuàng)面部分的長(zhǎng)度、厚度及皮片寬度(于創(chuàng)面部分取三點(diǎn)測(cè)量，取其平均值)，用INSTRON生物力學(xué)測(cè)定儀(INSTRON 5542-C8609)，以負(fù)荷量20N、0.5mm/min的恒速拉伸皮片，拉伸距離為10％ΔL(皮片創(chuàng)面部分的長(zhǎng)度)，測(cè)定四個(gè)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面皮膚組織的相應(yīng)負(fù)荷量。皮膚組織順應(yīng)性即為組織的變形能力，以單位體積、單位位移的負(fù)荷量的倒數(shù)來(lái)表示(順應(yīng)性與負(fù)荷量呈反比)，計(jì)算公式如下

四個(gè)實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面皮膚組織的皮膚組織順應(yīng)性的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示，比較結(jié)果如圖15所示，術(shù)后2周單純創(chuàng)傷組的組織順應(yīng)性增大，高于正常組，兩者相比具有顯著性差異(P＜0.05)；2周后單純創(chuàng)傷組的組織順應(yīng)性降低，顯著低于正常組(P＜0.05)；術(shù)后2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組的組織順應(yīng)性顯著低于單純創(chuàng)傷組，術(shù)后3-12周顯著高于單純創(chuàng)傷組(P＜0.05)，表明大鼠皮膚組織缺損后，如任其自然愈合，創(chuàng)面組織順應(yīng)性明顯下降，而復(fù)合移植(生物材料+自體皮移植)可明顯改善大鼠皮膚組織缺損后創(chuàng)面的組織順應(yīng)性，已有研究證實(shí)，組織順應(yīng)性的下降可促使成纖維細(xì)胞功能活躍，是瘢痕過(guò)度增生的重要因素之一。復(fù)合移植對(duì)組織順應(yīng)性的改善將有利于減輕瘢痕的過(guò)度增生。實(shí)驗(yàn)組的組織順應(yīng)性在術(shù)后3-4周顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P＜0.05)，其余時(shí)相點(diǎn)均無(wú)顯著性差異，這一結(jié)果與組織學(xué)上該時(shí)間段組織中成纖維細(xì)胞數(shù)量較多、功能活躍的觀察結(jié)果相一致，表明在創(chuàng)面愈合早期，本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)對(duì)組織順應(yīng)性的改善較ADM略差，但其遠(yuǎn)期效果兩者之間無(wú)明顯差異，因此本發(fā)明的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)亦可有效改善創(chuàng)面的組織順應(yīng)性。另外，創(chuàng)面愈合早期，單純創(chuàng)傷組創(chuàng)面組織順應(yīng)性顯著高于其它組，可能因創(chuàng)面愈合早期，創(chuàng)面由大量新生肉芽組織填充，此時(shí)新生肉芽組織中主要以大量的細(xì)胞成分為主，而細(xì)胞外基質(zhì)相對(duì)較少，排列疏松，所以其順應(yīng)性反而較高，隨著創(chuàng)面的愈合，上皮化的完成，細(xì)胞外基質(zhì)的大量沉積，細(xì)胞外基質(zhì)的排列變得致密，抗變形能力提高，故其順應(yīng)性明顯下降。
表1不同處理組創(chuàng)面皮膚組織順應(yīng)性的數(shù)據(jù)分析結(jié)果(x±s)#(n＝4-6)


注#各數(shù)據(jù)均乘以103；△正常組、陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與單純創(chuàng)傷組比較P＜0.05；▲實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組比較P＜0.05。
權(quán)利要求
1.一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，是將哺乳動(dòng)物皮膚依次用氫氧化鈉溶液和去污劑處理后得到的產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于所述氫氧化鈉溶液的濃度為2-5N。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，其特征在于所述去污劑為質(zhì)量百分濃度為1-5％的吐溫-80、吐溫-20或TRITON-X100。
4.一種權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的制備方法，包括以下步驟1)剝離哺乳動(dòng)物體表皮膚；2)清除皮下附帶成分；3)清洗皮膚；4)將皮膚用2-5N氫氧化鈉溶液處理10-60分鐘；5)置換新的2-5N氫氧化鈉溶液，處理10-60分鐘；6)重復(fù)步驟5)1-3次；7)將步驟6)經(jīng)氫氧化鈉溶液處理的皮膚用質(zhì)量百分濃度為1-5％的去污劑進(jìn)行處理；8)用去熱原水對(duì)皮膚進(jìn)行清洗，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中用于制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的哺乳動(dòng)物為豬、牛、羊、馬或兔。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟4)-6)中氫氧化鈉溶液的濃度為2N，處理時(shí)間為20-30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟6)中重復(fù)處理的次數(shù)為1。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟7)中的去污劑為吐溫-80、吐溫-20或TRITON-X100。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述步驟7)中去污劑處理時(shí)間為10-60分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于所述去污劑為吐溫-80，處理時(shí)間為30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種脫細(xì)胞真皮基質(zhì)及其制備方法。該脫細(xì)胞真皮基質(zhì)是將哺乳動(dòng)物皮膚依次用氫氧化鈉溶液和去污劑處理后得到的產(chǎn)品。其制備方法包括以下步驟1)剝離哺乳動(dòng)物體表皮膚；2)清除皮下附帶成分；3)清洗皮膚；4)將皮膚用2－5N氫氧化鈉溶液處理10－60分鐘；5)置換新的2－5N氫氧化鈉溶液，處理10－60分鐘；6)重復(fù)步驟5)1－3次；7)將步驟6)經(jīng)氫氧化鈉溶液處理的皮膚用質(zhì)量百分濃度為1－5％的去污劑進(jìn)行處理；8)用去熱原水對(duì)皮膚進(jìn)行清洗，得到脫細(xì)胞真皮基質(zhì)。本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1775189SQ200510126108
公開(kāi)日2006年5月24日 申請(qǐng)日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者董群, 林萍, 孫先昌 申請(qǐng)人:煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司