專利名稱：一種皖貝母提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種皖貝母提取物，本發(fā)明還涉及所述皖貝母提取物的制備方法，本發(fā)明也涉及該皖貝母提取物在制備具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效藥物的用途，本發(fā)明還涉及含有該皖貝母提取物的藥物。
背景技術(shù)：
貝母由于品種產(chǎn)地不同分為浙貝母、川貝母和皖貝母等，通常使用的貝母為浙貝母和川貝母，而皖貝母為安徽貝母，植物拉丁名為Fritillaria anhuiensis.S.C.Chen et S.F.Yin，是于1990年衛(wèi)生部批準(zhǔn)作為藥用的一類中藥材，已用于臨床及制劑中，正逐步推廣使用。人們在對貝母的研究中發(fā)現(xiàn)，貝母中含有許多生物堿，已經(jīng)分離出貝母素甲、貝母素乙、異貝母甲素和貝母辛的明確化學(xué)結(jié)構(gòu)的成分。但是至今沒有發(fā)現(xiàn)將這些成分按照一定比例組合鎮(zhèn)咳祛痰平喘的報道。本發(fā)明人在對皖貝生物總堿的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，它們是主要包括這些已知結(jié)構(gòu)的組份及貝母生物堿甙，并且所含貝母素甲、貝母素乙、異貝母甲素和貝母辛與浙貝母中所含的這些生物堿含量完全不同，皖貝母中異貝母甲素＞貝母素乙＞貝母辛，浙貝母中貝母素乙＞貝母素甲＞異貝母甲素＞貝母辛，而在川貝母中僅含有貝母辛而不含其他三種成分。本發(fā)明人將這些成分的新組合進(jìn)行藥理試驗發(fā)現(xiàn)它們具有更好的鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種皖貝母提取物。
本發(fā)明的另外一個目的是提供該皖貝母提取物的制備方法。
本發(fā)明的又一個目的是提供該皖貝母提取物在制備具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效藥物的用途。
本發(fā)明的還有一個目的是提供含有該皖貝母提取物的藥物。
本發(fā)明所述的皖貝母提取物包括皖貝總生物堿，總生物堿以貝母素乙計，不得少于50％。皖貝總生物堿包括異貝母甲素、貝母素乙、貝母辛、貝母素甲和生物堿甙，其中異貝母甲素∶貝母素乙∶貝母辛∶貝母素甲∶貝母生物堿甙的重量比為3-5∶2-4∶1-3∶0.8-1.5∶0.5-1。優(yōu)選它們之間的比例異貝母甲素∶貝母素乙∶貝母辛∶貝母素甲∶貝母生物堿甙＝3.8∶3.5∶2.5∶1∶0.74。
本發(fā)明皖貝母提取物的制備方法可以是，但不限于，酸堿轉(zhuǎn)移氯仿萃取法、離子交換樹脂法以及大孔樹脂吸附法。
如果采用酸堿轉(zhuǎn)移氯仿萃取法從皖貝母中提取本發(fā)明的提取物，它包括下列步驟先用乙醇溫浸皖貝母，乙醇揮干后的濃縮液以酸水溶解生物堿，酸液堿化后的游離生物堿用氯仿多次萃取，氯仿萃取液水洗后脫水濃縮即得。根據(jù)皖貝母藥材的生物堿含量，此方法得率在90％以上，但由于大量應(yīng)用有機(jī)溶劑，尤其使用有毒價貴的氯仿，只能用于實驗室而難于用于工業(yè)生產(chǎn)。
如果采用離子交換樹脂法從皖貝母中提取本發(fā)明的提取物，它包括下列步驟用0.05mol/L鹽酸溶液作溶劑，對皖貝母進(jìn)行滲漉，滲漉液通過氫型732苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂，樹脂堿化后地索氏提取器中用乙醇回流洗脫，洗脫液減壓濃縮即得，通過薄層層析與藥材對比，生物堿無變化，定量測定，得率可達(dá)到85-90％，此方法所得皖貝母提取物純度較高，得率也不低，但離子交換樹脂的再生需要較大量的酸堿及去離子水，工業(yè)生產(chǎn)用的大型索氏提取器，設(shè)備條件要求也較高。
如果采用大孔吸附樹脂法從皖貝母中提取本發(fā)明的提取物，它包括下列步驟用DA-201大孔樹脂，以0.1mol/L鹽酸滲漉液上柱，80％乙醇洗脫的簡單易行的工藝，所得的濃縮液色澤較深，采用相當(dāng)總堿量30倍的中性氧化鋁柱層析脫色，乙醇洗脫液色澤淺，生物堿無變化，得率在90％左右。因此，本方法操作簡單，設(shè)備要求不高，流程也較合理，生物堿收得率也較高，是一種適合工業(yè)生產(chǎn)的制備工藝。
本發(fā)明所述的皖貝母提取物優(yōu)選采用大孔樹脂法，具體步驟如下(1)藥材滲漉將皖貝母經(jīng)挑選干凈的干品磨成粗粉，以0.1mol/L鹽酸溶液作溶劑，浸漬24小時后裝入滲漉罐，以合適的速度進(jìn)行滲漉，收集滲漉液，滲漉液的體積與生藥重量之比為11ml∶1g；(2)樹脂吸附將處理好的DA-201大孔吸附樹脂裝柱，以去離子水充分洗去殘留的乙醇，將滲漉液加入大孔吸附樹脂柱緩緩?fù)ㄟ^，流速根據(jù)樹脂用量決定，上樣量每1cm3樹脂體積可上相當(dāng)4.6g生藥的量或相當(dāng)本發(fā)明皖貝母提取物2.1mg的量。滲漉完成后加適量去離子水洗去未吸附雜質(zhì)，再以乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)為止，收集洗脫液，減壓濃縮。
(3)脫色將洗脫濃縮液加于已活化好的中性氧化鋁柱上，上樣量為30g中性氧化鋁可上相當(dāng)本發(fā)明藥物組合物1g的量，用乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)為止。洗脫液減壓濃縮至無醇味，即本發(fā)明皖貝母提取物的溶液，此溶液真空干燥，即得。
本發(fā)明所述的皖貝母提取物優(yōu)選的制備方法是用0.1mol/L的鹽酸溶液浸漬24小時后，滲漉，得到滲漉液，滲漉液的體積與生藥重量之比為11ml∶1g，將其上到預(yù)處理過的裝有DA-201大孔樹脂的大孔樹脂柱上，用去離子水洗至pH為5，再用80％的乙醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮回收乙醇，將濃縮液上到中性氧化鋁柱上脫色，上樣量為30g中性氧化鋁可上相當(dāng)皖貝母總堿1g的量，用醫(yī)用乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)為止，將洗脫液減壓濃縮回收乙醇，濃縮液在70℃真空干燥，得到。
現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明皖貝母提取物的組份性質(zhì)，采用正交試驗對皖貝母提取方法的工藝參數(shù)進(jìn)行研究，篩選出最佳工藝條件，為充分利用皖貝母資源提供可靠的合理的方法。
(一)實驗材料原料皖貝母(安徽貝母Fritillaria anhuiensis.S.C.Chen et S.F.Yin的干燥鱗莖)，霍山產(chǎn)，購自霍山縣醫(yī)藥公司，粉碎過16目篩。
儀器萬分之一分析天平電熱恒溫真空干燥箱島津UV-240紫外分光光度計試劑與藥品貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所DA-201型大孔吸附樹脂中性氧化鋁(層析用100-200目)乙醇(化學(xué)純)、鹽酸(分析純)、氯仿(分析純)。
(二)實驗方法
l、提取工藝流程取皖貝母粗粉，按規(guī)定加鹽酸液滲漉，至無生物堿反應(yīng)為止，收集滲漉液，上規(guī)定量的大孔吸附樹脂柱，加適量蒸餾水沖洗至pH值為5，按規(guī)定加乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)，收集洗脫液，減壓濃縮，濃縮液上規(guī)定量的中性氧化鋁柱，按規(guī)定加乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)，收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥(70℃)，研勻稱重，即得提取物，為本發(fā)明皖貝母提取物。
2、提取物的含量測定采用酸性染料比色法測定皖貝總堿含量，經(jīng)島津UV-240紫外分光光度計進(jìn)行波長掃描測定，離子對最大吸收波長為410nm，且在70分鐘內(nèi)穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示皖貝總堿的量(以貝母素素計)在2.0-10.0ug/ml范圍內(nèi)符合比爾定律，可作含量測定的依據(jù)。
(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品2.5mg置50ml量瓶中，加氯仿溶解，定容至刻度，搖勻。
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml于60ml分液漏斗中，分別準(zhǔn)確加入氯仿至25ml，再加入pH5鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液2.0ml及2.0ml溴麝香草酚蘭溶液0.001mol/L，密塞，劇烈振搖5分鐘，靜置20分鐘使其充分分層后，分取氯仿層于置有0.25g無水硫酸鈉(105℃干燥4小時)的干燥具塞容器中，密塞，搖勻，隨行空白對照，于島津UV-240紫外分光光度計410nm處測定吸收度，用最小二乘法求得回歸方程為Y＝-0.0013+0.04245X，r＝0.9999(3)供試品溶液的制備精密稱取皖貝母提取物約20mg，置50ml量瓶中，加14％氨水0.2ml，再加混合溶劑(乙醚-氯仿-95％乙醇，25∶8∶2.5)至刻度，振搖使溶解，放置，精密吸取上清液25ml，水浴蒸干，于105℃加熱30分鐘，殘渣用氯仿分次溶解，定量移入50ml量瓶中，加氯仿至刻度，搖勻。
(4)供試品的測定精密吸取供試品溶液1ml依標(biāo)準(zhǔn)曲線項下操作測定吸收度，按下式計算供試品中總生物堿含量(以貝母素乙計)

式中y為吸收度；n為稀釋倍數(shù)；w為稱樣量(g)(三)正交實驗1、實驗設(shè)計①正交試驗因素與水平選擇，見表1表1

注Δg/cm3表示生藥量/樹脂體積ΔΔ表示生藥量/中性氧化鋁量②實驗按L8(27)正交分布安排，結(jié)果見表2表2


2、實驗結(jié)果與分析(1)含量數(shù)據(jù)分析表見表3表3

(2)得率數(shù)據(jù)分析表見表4表4

(3)直觀分析①通過含量數(shù)據(jù)分析表可見影響含量指標(biāo)的因素，由極差(I-II)的大小確定由主到次的因素為A→E→B→D→C，其較好的因素水平為A2B1C1D2E1。
②通過得率數(shù)據(jù)分析表可見影響得率指標(biāo)的因素由極差(I-II)的大小確定由主到次因素為C→A→B、D→E，較好因素水平為A2B1C1D1E1。
③通過以上兩表可見D因素均為次要因素，對含量指標(biāo)和得率指標(biāo)的影響不大，可以任意選擇，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，故選用D1，所以綜合以上兩表選取最佳工藝水平為A2B1C1D1E1。
4、方差分析本實驗為二水平試驗，所以列變動的計算采用下列算式

①含量的方差分析S1=(I-II)28=(-47)28=276.125]]>以下同S2＝231.125S3＝66.125S4＝28.125S5＝36.125S6＝136.125S7＝36.125據(jù)正交表頭設(shè)計有SA＝S1＝276.125 fA＝f1＝1SR＝S3＝66.125 fR＝fa＝1SC＝S4＝28.125 fC＝f4＝1SD＝S5＝36.125 fD＝fs＝1SE＝S6＝136.125 fE＝f6＝1S誤＝S2+S7＝267.125 f誤＝f2+f7＝2因為

因為


所以因子B、C、D的變動并入誤差得SΔ誤＝S誤+SB+SC+SD＝397.625fΔ誤＝f誤+FB+fC+fD＝5方差分析見表5表5


注*符號表示對得率指標(biāo)有較大影響，F(xiàn)0.10(1，5)＝4.06Fo.25(1，5)＝1.69Δ記號的那些因子將其變動歸入誤差根據(jù)以上方差分析表可見A和E對含量指標(biāo)有較大影響，B、C、D因素對含量指標(biāo)影響很小，可以任意選擇，考慮到經(jīng)濟(jì)因素選B1C1D1較適宜，所以從含量指標(biāo)來看，最佳工藝條件為A2B1C1D1E1。
②得率的方差分析計算方法同上，方差分析表見表6表6

注*符號表示對得率指標(biāo)有較大影響，F(xiàn)0.10(1，5)＝16.62 F0.10(1，5)＝4.06**符號表示對得率指標(biāo)有顯著影響，F(xiàn)0.05(1，5)＝6.61 F0.10(1，5)＝4.06 F0.25(1，5)＝1.69Δ符號表該因子其變動歸入誤差根據(jù)以上分析表可見因素C的變化對得率指標(biāo)有顯著影響，A因素的變化對得率指標(biāo)有較大影響。B、D、E因素應(yīng)選E1，考慮到經(jīng)濟(jì)因素B、D應(yīng)選B1、D1所以從得率指標(biāo)看，最佳工藝條件為A2B1C1D1E1。
③綜合含量指標(biāo)和得率指標(biāo)來看，B、D因素對兩者影響不大，可任意選擇，考慮到經(jīng)濟(jì)因素應(yīng)選B1D1。而A因素對含量指標(biāo)和得率指標(biāo)都有較大影響，都應(yīng)選A2，而因素E對含量指標(biāo)有較大影響，而對得率指標(biāo)影響不大，所以應(yīng)選C1，綜合以上分析，選擇最佳工藝為A2B1C1D1E1。即滲漉溶劑(鹽酸)用0.1mol/L，DA-201型大孔吸附樹脂用量為每4.6g生藥用1cm3樹脂，洗脫大孔樹脂乙醇濃度為80％，中性氧化鋁用量為每6.6g生藥用1g中性氧化鋁，洗脫中性氧化鋁柱用94％的乙醇。
(四)驗證試驗稱取皖貝母2份，每份100g，應(yīng)用本工藝參數(shù)對每份樣品進(jìn)行試驗，結(jié)果見表7。
表7

(五)小結(jié)直觀分析和方差分析表明，C因素的水平變化對得率指標(biāo)影響顯著而對含量指標(biāo)影響很小，A因素的水平變化對得率指標(biāo)和含量指標(biāo)都有較大影響，E因素的水平變化對含量指標(biāo)有較大影響，對得率指標(biāo)影響很小，而B、D因素的水平變化對含量指標(biāo)和得率指標(biāo)影響都很小，考慮到經(jīng)濟(jì)因素，綜合考慮選擇最佳工為A2B1C1D1E1即滲漉溶劑(鹽酸)用0.1mol/L，用量為每1g生藥用11倍量的鹽酸液即可滲漉完全。大孔樹脂用量為每4.6g生藥用1cm3樹脂，洗脫大孔樹脂乙醇用80％濃度，用量為每1g生藥用20倍量的80％乙醇即可洗脫完全，中性氧化鋁用量為每6.6g生藥用1g中性氧化鋁，洗脫中性氧化鋁柱乙醇濃度為94％，用量為每1g生藥用2.5倍量的94％乙醇即可洗脫完全。應(yīng)用A2B1C1D1E1工藝參數(shù)對皖貝母提取兩次，得本發(fā)明藥物組合物含量為72.6％每100g皖貝母中得率為0.518g。通過本工藝的驗證實驗及放大中試提取，均能獲得不具吸濕性的皖貝母提取物，含量及得率均較滿意。
我們對上述提取方法獲得的提取物進(jìn)行分析，以確認(rèn)所得提取物的成分。對上述提取方法獲得的提取物進(jìn)行薄層色譜掃描(見圖1)，根據(jù)掃描的峰面積，可以獲知主要生物堿含量比例(表8)
表8

為對比皖貝母提取物和原藥材皖貝母的生物堿組成，以及與特征性有效成分貝母素甲，貝母素乙的比較。應(yīng)用硅膠G薄層，環(huán)乙烷-醋酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1)為展開劑以展開生物堿。注意到同屬貝母藥材(如浙貝母)的生物堿是否引起混淆，我們曾將皖貝母與浙貝母，川貝母的生物堿進(jìn)行對比分析，應(yīng)用薄層掃描法測定主要生物堿，結(jié)果如下表9表9.3種貝母生物堿的含量(％)

由于皖貝與浙貝所含生物堿成分較近似，但從薄層層析圖譜(見圖2)及總堿含量和主要生物堿含量的比例，是有顯著差別，皖貝總堿含量高于浙貝的總堿含量，同時主要生物堿含量比例也不同，皖貝母異貝母甲素＞貝母素乙＞貝母辛，浙貝母貝母素乙＞貝母素甲＞異貝母甲素＞貝母辛。
本發(fā)明所述的皖貝母提取物經(jīng)藥效學(xué)試驗證實，它對小鼠氨水引咳和貓電刺激喉上神經(jīng)均有明顯的鎮(zhèn)咳作用，與可待因比較無明顯差異，并無快速耐受現(xiàn)象；小鼠酚紅法和大鼠毛細(xì)管法的藥理試驗表明，它有較好的祛痰作用，與必嗽平比較無明顯差異；整體動物引喘實驗結(jié)果證實它有平喘作用；小鼠耳二甲苯致炎和肉芽腫形成實驗結(jié)果顯示，它能明顯減輕炎癥反應(yīng)及抑制炎癥增殖期的作用。因此，本發(fā)明的皖貝母提取物可用于制備治療具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效的藥物。
本發(fā)明的皖貝母提取物還可以作為活性成分與藥學(xué)上可接受的載體制備成具有治療鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效的藥物。該藥物可以是各種劑型如片劑、顆粒劑、口服液、膠囊劑、丸劑、注射液等。
具體的實施方式實施例1將165kg皖貝母用每1g生藥用11倍量的0.1mol/L的鹽酸浸漬24小時后，滲漉，得到滲漉液，滲漉液的體積與生藥重量之比為11ml∶1g，將其上到預(yù)處理過的每4.6g生藥用1cm3樹脂裝有DA-201大孔樹脂的大孔樹脂柱上，用去離子水洗至pH為5，再用1g生藥用20倍量的80％乙醇洗脫，將洗脫液減壓濃縮回收乙醇，將濃縮液上到每6.6g生藥用1g中性氧化鋁的中性氧化鋁柱上脫色，上樣量為30g中性氧化鋁可上相當(dāng)皖貝母總堿1g的量，用每1g生藥用2.5倍量的94％乙醇洗脫至無生物堿反應(yīng)為止，將洗脫液減壓濃縮回收乙醇，濃縮液在70℃真空干燥，得到本發(fā)明的皖貝母提取物1000g。
實施例2先用乙醇溫浸100kg皖貝母，乙醇揮干后的濃縮液以酸水溶解生物堿，酸水液堿化后的游離生物堿用氯仿多次萃取，氯仿萃取液水洗后脫水濃縮即得465g，得率為95％。
實施例3用0.05mol/L鹽酸溶液作溶劑，對150kg皖貝母進(jìn)行滲漉，滲漉液通過氫型732苯乙烯磺酸型陽離子交換樹脂，樹脂堿化后在索氏提取器中用乙醇回流洗脫，洗脫液減壓濃縮即得667g，通過薄層層析與藥材對比，生物堿無變化，定量測定，得率可達(dá)到89％，試驗例1、皖貝母提取物的鎮(zhèn)咳作用1、對小鼠氨水引咳實驗(1)材料動物小白鼠為昆明種。普通級動物，由本所動物室提供，雌雄各半，體重20±2g。
藥物皖貝母提取物(5mg/ml總生物堿)由我植化室提供。磷酸可待因，系青海制藥廠出品，批號870919(2)方法與結(jié)果實驗按小鼠氨水引咳法進(jìn)行，取小鼠100只，隨機(jī)分成5組，用25％氨水在恒定壓力下噴霧，使氣霧通入盛有小白鼠的容器內(nèi)，當(dāng)小鼠接受一定時間的氣霧刺激后，立即取出小鼠，觀察1分鐘內(nèi)出現(xiàn)3次以上典型咳嗽者為陽性反應(yīng)。實驗設(shè)計采用“上下法”，以引起一半小白鼠咳嗽的噴霧時間(EDT50)為指標(biāo)，結(jié)果見表10。
表10本發(fā)明皖貝母提取物對小鼠氨水引咳的作用 *與可待因比較P＞0.05從表10可看出本發(fā)明皖貝母提取物3個劑量組和可待因組給小鼠灌藥后半小時，對氨水引起半數(shù)小鼠咳嗽所需的時間(EDT50)比對照組(生理鹽水)明顯延長，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，給藥組與對照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.001，本發(fā)明皖貝母提取物組與可待因組比較P＞0.05，無顯著性差異。說明本發(fā)明皖貝母提取物對氨水引咳有明顯止咳作用。
2.對貓喉上神經(jīng)引咳的影響(1)材料動物貓，購自貓市場，在本所動物室飼養(yǎng)，剔除不健康者，體重2.5±0.5kg，雌雄兼有。
藥物皖貝母提取物，磷酸可待因。
(2)方法與結(jié)果貓39只，隨機(jī)分成6組，2組十二指腸給藥，4組靜脈給藥。用苯巴比妥鈉75mg/kg和戊巴比妥鈉15mg/kg混合腹腔麻醉，使貓保持在較淺的麻醉狀態(tài)下，按Domeyoz等氏方法，分離一側(cè)喉上神經(jīng)，電刺激時按置一付靈活的電導(dǎo)子于神經(jīng)干上引起咳嗽反應(yīng)。記錄咳嗽反應(yīng)，用自制玻璃罩管置咽喉于聲帶之上，罩管的出口端通過T型管與馬利氏氣鼓相連，使貓的正常呼吸運動與咳嗽反應(yīng)由氣鼓的杠桿系統(tǒng)直接描出，刺激器用YSD-4藥理、生理實驗多用儀，刺激參數(shù)在給藥前后不變，給藥前兩次電刺激喉上神經(jīng)，引出貓典型而穩(wěn)定的咳嗽反應(yīng)后，十二指腸(或靜脈)給藥，每隔20min(或10min)，按原條件刺激，發(fā)現(xiàn)咳嗽次數(shù)(見表11)和強(qiáng)度(見圖3)均受到不同程度抑制，十二指腸給藥組的動物咳嗽被抑制時間約維持2-3小時，最明顯受抑制約在藥后60min左右；靜脈給藥組的動物咳嗽被抑制時間約維持1-2小時，最明顯受抑制約在藥后30min左右。計算受抑制最明顯時的咳嗽減少次數(shù)，求t值，作自身及組間比較。
表11本發(fā)明皖貝母提取物的鎮(zhèn)咳作用

結(jié)果表明，十二指腸給藥二個劑量組的咳嗽次數(shù)均較給藥前顯著減少；靜脈給藥三個劑量組的咳嗽次數(shù)也均較給藥前顯著減少，且呈量效關(guān)系趨勢(見表11)。
3.皖貝母提取物鎮(zhèn)咳作用的耐受性實驗(1)材料同前(2)方法與結(jié)果鎮(zhèn)咳方法同前。貓4只，麻醉后無菌手術(shù)分離左側(cè)喉上神經(jīng)，給藥前引起典型而穩(wěn)定的咳嗽反應(yīng)后，腹腔注射本發(fā)明藥物組合物5mg/kg，給藥后30分鐘按原條件電刺激，見咳嗽反應(yīng)減弱，次數(shù)減少，45分鐘時更弱，后漸恢復(fù)。縫合切口，喂養(yǎng)。每天按實驗時的劑量給貓腹腔注射一次，連續(xù)7天，第8天重復(fù)第1天實驗，見皖貝母提取物對貓的鎮(zhèn)咳情形同第一次結(jié)果，說明皖貝母提取物鎮(zhèn)咳無耐受性。
通過上述實驗，證明皖貝母提取物有明顯的鎮(zhèn)咳作用。與可待因比較無明顯差異，并無快速耐受現(xiàn)象。
試驗例2、皖貝母提取物的祛痰作用1、改良的小鼠酚紅法(1)材料動物昆明種小白鼠，雌雄均有，體重20±2g。
藥物皖貝母提取物，鹽酸溴己胺片(必嗽片)上海第十一制藥廠，滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1981)第0259號。
(2)方法與結(jié)果在我國藥理工作者建立的酚紅法基礎(chǔ)上，Engler等又進(jìn)行了方法學(xué)上的研究和補(bǔ)充，證明祛痰劑以劑量依賴性的方式增加氣管內(nèi)酚紅的分泌，我們用此改良的酚紅法進(jìn)行實驗。
小鼠50只，隨機(jī)分成5組，灌胃給藥半小時后，給小鼠腹腔注射500mg/kg用生理鹽水配制的2.5％酚紅濃度，待30分鐘，將小鼠頸椎脫臼處死，取其氣管放入2ml生理鹽水中浸洗30分鐘，取出氣管后，在試管中加入0.2ml INNaOH，以穩(wěn)定洗出液的PH。用島津UV-240紫外可見分光光度計在558nm處測定酚紅濃度。結(jié)果見表12。
表12本發(fā)明皖貝母提取物對氣管洗出液中酚紅濃度的影響


*酚紅濃度(μg/ml)**與必嗽平比較P＞0.05實驗結(jié)果提示，本發(fā)明皖貝母提取物5mg/kg有祛痰作用的趨勢；本發(fā)明皖貝母提取物兩組(10mg/kg、15mg/kg)與必嗽平均能促進(jìn)氣管內(nèi)酚紅的分泌，有祛痰作用，與生理鹽水組比較，均有顯著性差異，P＜0.05，但與陽性對照藥必嗽平組間比較無顯著性差異，P＞0.05。
2、氣管洗出液中已糖含量的測定(1)材料同改良的小鼠酚紅法。
(2)方法與結(jié)果分組同上，灌服各藥后，30分鐘處死小鼠，按上法取氣管，用0.3ml生理鹽水浸洗30分鐘，在浸出液中加入終濃度60％的濃硫酸，80℃水解10分鐘，待水解液冷至室溫后加入1％苔黑酚顯色，用島津UV-240紫外一可見分光光度計在480nm處，測定已糖的濃度，見表13。
表13本發(fā)明皖貝母提取物對氣管洗出液中已糖含量的影響

*已糖含量(μg/ml)由表可看出，促進(jìn)氣管內(nèi)酚紅分泌的本發(fā)明皖貝母提取物和必嗽平，只有本發(fā)明皖貝母提取物使氣管洗出液中已糖的濃度顯著下降，P＜0.001。
3、大白鼠毛細(xì)管法(1)材料動物大白鼠，Wistar封閉群，雌雄兼有，體重180±20g，由本所動物室供應(yīng)，是普通級動物。
藥物本發(fā)明皖貝母提取物，鹽酸溴己胺片。
(2)方法與結(jié)果大白鼠實驗前禁食不禁水24小時，以25％烏拉坦1mg/kg腹腔麻醉，在甲狀腺下緣氣管正中，兩軟骨環(huán)之間，用6號針頭刺一小孔，然后插入毛細(xì)管(長4cm，內(nèi)徑8mm)一根，深度和位置要恰當(dāng)，以使氣管內(nèi)的分泌液通過毛細(xì)管緩緩虹吸上升。當(dāng)毛細(xì)管被分泌液充滿時，立即再換1根。計算每小時毛細(xì)管內(nèi)液柱的長度(cm)。記錄給藥前2小時的正常分泌量，給藥后再繼續(xù)觀察5小時，比較給藥前后平均每小時的分泌量，以此判斷其祛痰作用的強(qiáng)弱。
實驗用大白鼠40只，隨機(jī)分成5組(生理鹽水、必嗽平、本發(fā)明藥物組合物設(shè)三個劑量組)，灌胃給藥，以此來觀察皖貝母提取物的祛痰作用及量效關(guān)系。
結(jié)果本發(fā)明皖貝母提取物三個劑量組，給藥前后分泌量自身比較，與對照組比較，均表現(xiàn)顯著增加，且呈量效關(guān)系趨勢。表14及附圖4。
表14本發(fā)明皖貝母提取物的祛痰作用 *增加的痰分泌量(cm/h)**與必嗽平比較，P＞0.05試驗例3、本發(fā)明皖貝母提取物的平喘作用1、整體動物藥物引喘法(1)材料動物取幼年豚鼠，體重在200g以下，雌雄均有。由本所動物室供應(yīng)。
藥物本發(fā)明皖貝母提取物，氨茶堿北京第三制藥廠，批號901115；磷酸組織胺衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，批號510-9010。
(2)方法與結(jié)果將豚鼠隨機(jī)分為4組對照組，氨茶堿組(100mg/kg)，本發(fā)明藥物組合物二個劑量組(10、20mg/kg)。每日灌胃給藥一次，連續(xù)3天，第三天各組給藥60分鐘后，放入噴霧裝置容器內(nèi)，將組織胺(2mg/ml)等壓力勻速噴霧15秒。記錄自噴霧開始至豚鼠發(fā)生抽搐、翻滾的時間(潛伏期)，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果見表15。
表15本發(fā)明皖貝母提取物的平喘作用

顯示本發(fā)明皖貝母提取物二個劑量組有抑制哮喘反應(yīng)，潛伏期延長，與對照組比較有顯著性差異，且20mg/kg組的平喘作用較10mg/kg組強(qiáng)。但其平喘作用較弱于氨茶堿。
2、離體氣管法(1)材料動物豚鼠400-600g，雌雄皆有。由本所動物室供應(yīng)。
藥物皖貝母提取物、磷酸組織胺衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，批號510-9010。
(2)方法與結(jié)果取豚鼠6只，每次1只，擊斃，細(xì)心分離出氣管，制成離體氣管片標(biāo)本，放入盛有克-享氏液的離體器管恒溫浴槽中(37℃)，供氧穩(wěn)定20-30分鐘后進(jìn)行描記(負(fù)重約2g)，氣管平滑肌無自動收縮，待基線穩(wěn)定后即可給藥，觀察藥物反應(yīng)。
結(jié)果表明，本發(fā)明皖貝母提取物在不同濃度(1ug/ml、10ug/ml、100ug/ml)下，對離體氣管片無明顯影響。
試驗例4、本發(fā)明皖貝母提取物的抗炎作用1、小鼠耳二甲苯致炎法(1)材料動物體重25-30g雄性小白鼠，昆明種。
藥物本發(fā)明皖貝母提取物，阿斯匹林片西北第二合成廠，批號〔82〕00503；二甲苯，天津市化學(xué)試劑二廠，批號830508。
(2)方法與結(jié)果將動物隨機(jī)分成4組對照組、阿斯匹林組(100mg/kg)，本發(fā)明皖貝母提取物二個劑量組(10、15mg/g)，每日灌胃給藥一次，連續(xù)5天。第5天藥后1小時用100％二甲苯0.02ml/只，涂于小鼠左耳前后兩面，4小時后將小白鼠頸椎脫臼致死，用9mm直徑打孔囂分別在同一部位打下園耳片，分析天平稱重，每鼠左耳重量減去右耳片重即為腫脹度。將對照組與給藥組的腫脹程度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，見表16表16本發(fā)明皖貝母提取物對小鼠耳二甲苯炎癥的影響

結(jié)果證實，本發(fā)明皖貝母提取物的兩個劑量組能明顯減輕炎癥反應(yīng)，尢以15mg/kg組作用明顯，與對照組比較，均有顯著性差異。與阿斯匹林抗炎作用相似。
2、肉芽腫形成實驗法(棉球法)(1)材料動物Wistar大白鼠，120±150g，雄性。
藥物本發(fā)明皖貝母提取物，阿斯匹林(同前)(2)方法與結(jié)果動物隨機(jī)分成4組對照組、阿斯匹林組(100mg/kg)，本發(fā)明皖貝母提取物二個劑量組(10、20mg/kg).。每日灌胃給藥1次。第3天在淺麻下，腹部切口，將兩個滅菌棉球(每個重20mg，加青、鏈霉素各0.1mg，，以防感染)，分別植入大鼠兩側(cè)腹股溝皮下，共連續(xù)7天給藥。第8天頸椎脫臼處死，剝出周圍已包裹肉牙組織的棉球，在60℃烘箱放置12小時稱重，減去原棉球重量即為肉芽腫凈重，結(jié)果見表17。
表17本發(fā)明皖貝母提取物對大鼠棉球肉芽腫的影響

結(jié)果證實，本發(fā)明皖貝母提取物10mg/kg有抑制炎癥的趨勢，隨劑量增大20mg/kg，有明顯的抑制炎癥的作用。與對照組比較，有非常顯著性差異(P＜0.001。與阿斯匹林抗炎作用相似。


圖1左圖為本發(fā)明皖貝母提取物薄層色譜掃描圖，其中標(biāo)號1代表原點(生物堿甙)，標(biāo)號2代表貝母素甲，標(biāo)號3代表異貝母甲素，標(biāo)號4代表貝母辛，標(biāo)號5代表貝母素乙。右圖為貝母素甲對照品，其中標(biāo)號1代表貝母素甲。
圖2為皖貝母、浙貝母薄層色譜對比圖，其中標(biāo)號1代表皖貝母，標(biāo)號2代表浙貝母，標(biāo)號3代表本發(fā)明皖貝母提取物。薄層板為硅膠G-CMC，展開劑為環(huán)己烷-醋酸乙酯-二乙胺(6∶4∶1)，顯色劑為稀碘化鉍鉀試液。
圖3為本發(fā)明皖貝母提取物通過貓的十二指腸給藥后的鎮(zhèn)咳作用(咳嗽減少次數(shù)與時間的關(guān)系)圖。給藥劑量為10mg/kg體重。
圖4依次為生理鹽水(等容量)、必嗽平(10mg/kg)與本發(fā)明皖貝母提取物三個劑量組(10mg/kg、15mg/kg、22.5mg/kg)的祛痰作用比較。圖中陰影部分為給藥前，空白部分為給藥后。
權(quán)利要求
1.一種皖貝母提取物，它可以用下列方法獲得先用乙醇溫浸皖貝母，乙醇濃縮液以酸水溶解生物堿，酸水液堿化后游離生物堿用氯仿萃取，氯仿萃取液水洗后脫水濃縮即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的皖貝母提取物，其特征在于它包括總生物堿，總生物堿以貝母素乙計，不得少于50％。
3.按照權(quán)利要求2所述的皖貝母提取物，其中的總生物堿包括貝母素甲、貝母素乙、異貝母甲素、貝母辛和貝母生物堿甙。
4.按照權(quán)利要求3所述的皖貝母提取物，其中異貝母甲素∶貝母素乙∶貝母辛∶貝母素甲∶貝母生物堿甙的重量比為3-5∶2-4∶1-3∶0.8-1.5∶0.5-1。
5.按照權(quán)利要求4所述的皖貝母提取物，其中異貝母甲素∶貝母素乙∶貝母辛∶貝母素甲∶貝母生物堿甙的重量比為3.8∶3.5∶2.5∶1∶0.74。
6.一種制備皖貝母提取物的方法，它包括用先用乙醇溫浸皖貝母，乙醇濃縮液以酸水溶解生物堿，酸水液堿化后游離生物堿用氯仿萃取，氯仿萃取液水洗后脫水濃縮即得。
7.權(quán)利要求1-5中任何一項所述的皖貝母提取物在制備具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效藥物的用途。
8.含有權(quán)利要求1-5中任何一項所述皖貝母提取物的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種皖貝母提取物及其制備方法，該提取物含有至少50％的總生物堿，包括貝母素甲、貝母素乙、異貝母甲素、貝母辛和貝母生物堿甙。本發(fā)明所述的皖貝母提取物經(jīng)藥效學(xué)試驗證實，它的鎮(zhèn)咳作用與可待因比較無明顯差異，并無快速耐受現(xiàn)象；它的祛痰作用與必嗽平比較無明顯差異；它還具有平喘作用明顯減輕炎癥反應(yīng)及抑制炎癥增殖期的作用。本發(fā)明還公開了皖貝母提取物在制備具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘功效藥物的用途和含有它的藥物。
文檔編號A61P11/06GK1903312SQ20051012920
公開日2007年1月31日 申請日期2003年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月24日
發(fā)明者趙新先 申請人:三九醫(yī)藥股份有限公司