專利名稱：水飛薊賓酯類衍生物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機化學和藥物化學領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及水飛薊賓酯類衍生物的制備方法和用途。該類化合物通過全合成和半合成的方法得到。該類化合物具有抑制人體乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)以及降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的活性，從而可以預期作為治療病毒性乙型肝炎及相關(guān)病毒性疾病的藥物。此外，本發(fā)明將該系列化合物對過氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細胞損傷體外模型進行了肝細胞損傷保護活性篩選。該類化合物被發(fā)現(xiàn)具有保護肝細胞和促進肝細胞修復的作用。其次，對大鼠急性四氯化碳肝損傷動物體內(nèi)肝損傷模型進行了保護肝損傷活性測試。發(fā)現(xiàn)該類化合物有體內(nèi)保護動物肝損傷的作用。本發(fā)明又對該類化合物抗氧自由基活性進行了測試，發(fā)現(xiàn)其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基誘導之脂過氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預期用于制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。該類化合物還表現(xiàn)出很強的對抗自由基引起的PC12細胞損傷作用，即對模擬腦神經(jīng)細胞的PC12細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在同一濃度下，其清除自由基保護細胞的能力比陽性對照槲皮素還高。說明其對保護腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用。以上活性表明該類化合物可以預期用于制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。
背景技術(shù)：
在眾多抗自由基天然產(chǎn)物中，水飛薊是少數(shù)幾個在臨床上廣泛應用的藥物之一。三十多年的臨床實驗證明該藥具有確切的療效和低毒性(參閱Flora K.等人，Am.J.Gastroenterol，1998，93，139-143；Saller R.等人，Drugs，2001，61(14)，2035-2063)。水飛薊中水飛薊賓含量最多，活性也最高。該藥作用主要有以下幾點。(一)抗自由基活性水飛薊素對于由CCl4，半乳糖胺、醇類和其他肝毒素造成的肝損害具有保護作用。1990年Lotteron等人報道了在小鼠肝微粒體內(nèi)，水飛薊素能減少由CCl4代謝引起的體外脂質(zhì)過氧化及由還原型輔酶單獨引起的過氧化作用這些都表明水飛薊素為鏈中斷抗氧化劑或為自由基清除劑。(二)保護肝細胞膜通過抗脂質(zhì)過氧化反應維持細胞膜的流動性，保護肝細胞膜。還能阻斷真菌毒素鬼筆毒環(huán)肽和α-鵝膏蕈堿等與肝細胞上特異受體的結(jié)合，抑制其對肝細胞的攻擊及跨膜轉(zhuǎn)運，中斷其肝腸循環(huán)，從而增強肝細胞膜對于多種損害因素的抵抗力。(三)促進肝細胞的修復和再生水飛薊賓進入細胞后可以與雌二醇受體結(jié)合，并使之激活，活化的受體可以增強肝細胞核內(nèi)RNA聚合酶1的活性，使RNA轉(zhuǎn)錄增強，促進酶及蛋白質(zhì)的合成，并間接促進DNA的合成，有利于肝細胞的修復和再生。(四)抗腫瘤作用各種活性氧能氧化鳥嘌呤形成8-羥基鳥嘌呤，造成DNA損傷，進而引起腫瘤，水飛薊賓作為一個有效的抗自由基物質(zhì)也顯示了預防和治療腫瘤的作用。
水飛薊賓類化合物具有確切的療效，但是由于其水溶性和生物利用度上的一些不足限制了該藥物的市場。故尋找水飛薊賓類新的衍生物，使其能夠具有更高或者更新的藥理活性，以期獲取自主知識產(chǎn)權(quán)的新藥，實屬必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有抑制乙型肝炎病毒、清除自由基活性、保護肝臟細胞及肝臟器質(zhì)性損傷、治療早老性癡呆癥的活性化合物。具體而言，本發(fā)明提供了一種式(I)所示的水飛薊賓酯類衍生物及其可藥用鹽或其溶劑化物。
式(I)其中n＝0、1；R1、R2、R3為氫、烷氧基、鹵素、硝基、腈基、氨基、酰胺基，R4，R6為氫、烷氧基、鹵素等、R5為氫，烷基，R7為氫或烷氧基，其中烷基或者烷氧基的碳原子數(shù)是1-8個碳原子，可以是直鏈或支鏈烷基或烷氧基。式(I)中2，3位7′，8′的立體構(gòu)型分別是或同時是R構(gòu)型或S構(gòu)型。
本發(fā)明優(yōu)選的式(I)化合物包括化合物I-1對甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-2對硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-3苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2]-甲基酯；化合物I-4間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-53，4-二甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-63，4，5-三甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-7胡椒酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-8對氟苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-9對腈基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氧-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-10對甲基肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-11對氯肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-12對溴肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-13對乙酰氨基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-143，5-二硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-15對甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-16對硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-17對氨基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-183-氨基-5-硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯。


本發(fā)明的另一個目的是提供一種水飛薊賓酯類衍生物式I的制備方法，化合物I的制備方法是 R1，R2，R3，R7定義與式(I)相同，其中偶氮二甲酸二酯為二甲酯，二乙酯，丙酯，異丙酯或丁酯，溶劑為四氫呋喃，二甲亞砜，二甲基甲酰胺，反應溫度為室溫至回流，水飛薊賓∶苯甲酸∶偶氮二甲酸二酯∶三苯基磷＝1∶1～3∶1～3∶1～3，反應時間0.5～20小時。
本發(fā)明的另一個目的是提供了式(I)化合物用于防治肝臟細胞及肝臟器質(zhì)性損傷，和防治病毒性乙型肝炎疾病的用途。
本發(fā)明的再一個目的是提供了一種含有式(I)化合物的用于防治肝臟細胞及肝臟器質(zhì)性損傷，和防治病毒性乙型肝炎疾病的藥物組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供了一種含有式(I)化合物的用于制備基于抗氧化自由基機制的抗衰老藥物、防治早老性癡呆癥的用途。
本發(fā)明的再一個目的是提供了一種含有式(I)化合物的用于制備基于抗氧化自由基機制的抗衰老藥物、防治早老性癡呆癥的藥物組合物。
本發(fā)明的又一目的是提供了式(I)化合物的用于制備由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的生理改變或疾病特別是心血管及腦血管病變藥物的用途。
本發(fā)明的再一個目的是提供了一種含有式(I)化合物的用于制備由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的生理改變或疾病特別是心血管及腦血管病變藥物的藥物組合物。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用實施例的形式說明化合物制備的過程，實施例給出了代表性化合物的部分物理和化學及波譜學數(shù)據(jù)。必須說明，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
實施例1化合物I-1，對甲氧基苯甲酸[3-(羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯的制備 在干燥的反應瓶中加入1克化合物I-a(水飛薊賓)，0.6克對甲氧基苯甲酸和1.6克三苯基磷，用20毫升無水四氫呋喃溶解，加入1克偶氮二甲酸二乙酯，加完后于室溫攪拌10小時，減壓蒸餾除去溶劑，加入5毫升氯仿，過濾除去白色固體，母液經(jīng)柱層析，得淺黃色粉末0.7克，收率47％。
化合物I-1Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.33；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.80(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，4.20(m，1H，H-9′a)，4.34(m，1H，H-8′)，4.48(m，1H，H-9′b)，4.53(m，1H，H-3)，4.98(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.00(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，5.99(s，1H，H-6)，6.05(s，1H，H-8)，6.93(d，J＝8.8Hz，1H，H-3，5)，6.85-7.20(m，6H，Ar-H)，7.94(d，J＝8.8Hz，1H，H-2，6)11.21(s，1H，5-OH)；ESI-MS615[M-1]+。
根據(jù)實施例1相同的方法制備表一中實施例2-16所示化合物表一

各化合物理化數(shù)據(jù)化合物I-2(對硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.18；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.87(s，3H，OCH3)，4.34(m，1H，H-9′a)，4.52(m，1H，H-8′)，4.56(m，2H，H-3，H-9′b)，4.97(d，J＝6.8Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.04(s，1H，H-6)，6.11(s，1H，H-8)，7.55(d，J＝8.8Hz，2H，2，6)，6.90-8.16(m，6H，Ar-H)，8.30(d，J＝8.8Hz，2H，3，5)，11.17(s，1H，5-OH)；ESI-MS630[M-1]+。
化合物I-3(苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.20，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.85(s，3H，OCH3)，4.21(m，1H，H-9′a)，4.28(m，1H，H-8′)，4.52(m，2H，H-3，H-9′b，)，4.96(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.02(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.02(s，1H，H-6)，6.06(s，1H，H-8)，6.92-8.06(m，11H，Ar-H)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS585[M-1]+。
化合物I-4(間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.16，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.86(s，3H，OCH3)，4.26(m，1H，H-9′a)，4.38(m，1H，H-8′)，4.53(m，2H，H-3，H-9′b)，4.97(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.00(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.00(s，1H，H-6)，6.07(s，1H，H-8)，6.87-7.87(m，10H，Ar-H)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS619[M-1]+。
化合物I-5(2，3-二甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.19，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.81(s，3H，OCH3)，3.93(s，3H，OCH3)，3.97(s，3H，OCH3)，4.25(m，1H，H-9′a)，4.36(m，1H，H-8′)，4.55(m，2H，H-3，H-9′b)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.00(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)5.98(s，1H，H-6)，6.00(s，1H，H-8)，6.86-7.65(m，9H，Ar-H)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS645[M-1]+。
化合物I-6(3，4，5-三甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.10，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.83(s，3H，OCH3)，3.90(s，6H，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，4.26(m，1H，H-9′a)，4.37(m，1H，H-8′)，4.52(m，2H，H-3，H-9′b)，4.98(d，J＝7.8Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.99(s，1H，H-6)，6.06(s，1H，H-8)，6.86-7.26(m，8H，Ar-H)，11.19(s，1H，5-OH)；ESI-MS645[M-1]+。
化合物I-7(胡椒酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.12，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.83(s，3H，OCH3)，4.24(m，1H，H-9′a)，4.33(m，1H，H-8′)，4.54(m，2H，H-3，H-9′b)，4.98(d，J＝7.2Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.98(s，1H，H-6)，6.05(s，3H，OCH2O，H-8)，6.84-7.67(m，9H，Ar-H)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS629[M-1]+。
化合物I-8(對氟苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.14，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.85(s，3H，OCH3)，4.29(m，1H，H-9′a)，4.40(m，1H，H-8′)，4.55(m，2H，H-3，H-9′b)， 4.97(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.02(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.01(s，1H，H-6)，6.07(s，1H，H-8)，6.87-7.87(m，10H，Ar-H)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS603[M-1]+。
化合物I-9(對腈基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.18，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ4.23(s，3H，OCH3)，4.35(m，1H，H-9′a)，4.52(m，2H，H-8′)，4.55(m，2H，H-3，H-9′b)，4.96(d，J＝6.8Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.02(s，1H，H-6)，6.11(s，1H，H-8)，6.94-8.12(m，10H，Ar-H)，11.17(s，1H，5-OH)；ESI-MS610[M-1]+。
化合物I-10(對甲基肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1)＝0.32，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ2.38(s，3H，CH3)，3.87(s，3H，OCH3)，4.12(m，1H，H-9′a)，4.29(m，1H，H-8′)，4.38(m，1H，H-9′b)，4.52(dd，J＝11.6，4Hz，1H，H-3)，4.93(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，4.98(d，J＝11.6Hz，1H，H-2)，5.97(s，1H，H-6)，6.04(s，1H，H-8)，6.40(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.87-7.07(m，6H，Ar-H)，7.20(d，J＝8.0Hz，2H，H-3，5)，7.43(d，J＝8.0Hz，2H，H-2，6)7.64(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS625[M-1]+。
化合物I-11(對氯肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.11，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.89(s，3H，OCH3)，4.14(m，1H，H-9′a)，4.30(m，1H，H-8′)，4.40(m，1H，H-9′b)，4.53(dd，J＝11.6，4.4Hz，1H，H-3)，4.93(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12Hz，1H，H-2)，5.96(d，J＝0.8Hz，1H，H-6)，5.96(d，J＝0.8Hz，1H，H-8)，6.42(d，J＝16Hz，1H，H-α)，6.87-7.20(m，6H，Ar-H)，7.38(d，J＝8.0Hz，2H，3，5)，7.46(d，J＝8.0Hz，2H，2，6)，7.63(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS645[M-1]+。
化合物I-12(對溴肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.13，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.89(s，3H，OCH3)，4.14(m，1H，H-9′a)，4.30(m，1H，H-8′)，4.40(m，1H，H-9′b)，4.53(dd，J＝12.0，4.8Hz，1H，H-3)，4.93(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.96(d，J＝0.8Hz，1H，H-6)，5.96(d，J＝0.8Hz，1H，H-8)，6.43(d，J＝16.0Hz，1H，H-α)，6.87-7.07(m，6H，Ar-H)，7.20(d，J＝8.0Hz，2H，3，5)，7.41(d，J＝8.0Hz，2H，2，6)，7.59(d，J＝16.0Hz，1H，H-β)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS689[M-1]+。
化合物I-13(對乙酰胺基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.13，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ2.01(s，3H，CH3)，3.73(s，3H，OCH3)，4.22(m，1H，H-9′a)，4.45(m，2H，H-3，8′)，4.59(m，1H，H-9′b)，5.03(d，J＝10.8Hz，1H，H-2)，5.05(d，J＝7.6Hz，1H，H-7′)，6.00(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，6.02(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，7.18(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，5)，6.85-7.32(m，6H，Ar-H)，7.97(d，J＝8.4Hz，2H，H-2，6)，11.53(s，1H，5-OH)；ESI-MS642[M-1]+。
化合物I-14(3，5-二硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.18，1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.87(s，3H，OCH3)，4.34(m，1H，H-9′a)，4.52(m，1H，H-8′)，4.56(m，2H，H-3，H-9′b)，4.97(d，J＝6.8Hz，1H，H-7′)，4.99(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.04(s，1H，H-6)，6.11(s，1H，H-8)，6.90-8.16(m，9H，Ar-H)，11.17(s，1H，5-OH)；ESI-MS675[M-1]+。
實施例15化合物I-15(對甲氧基苯甲酸[3-羥基-3-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)的制備根據(jù)實施例1的方法，用2-[2，3-二氫-3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-羥甲基-8-甲氧基-1，4-苯并二氧六環(huán)-6-]-2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4H-1-苯并吡喃-4-酮代替水飛薊賓可以得到化合物I-15Rf(氯仿∶甲醇＝50∶1)＝0.28；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.80(s，3H，OCH3)，3.84(s，3H，OCH3)，3.86(s，3H，OCH3)，4.22(m，1H，H-9′a)，4.33.(m，1H，H-8′)，4.50(m，1H，H-9′b)，4.51(m，1H，H-3)，4.98(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，5.02(d，J＝8.0Hz，1H，H-7′)，6.00(s，1H，H-6)，6.03(s，1H，H-8)，6.95(d，J＝8.8Hz，1H，H-3，5)，6.86-7.15(m，5H，Ar-H)，7.95(d，J＝8.8Hz，1H，H-2，6)11.24(s，1H，5-OH)；ESI-MS645[M-1]+。
實施例16對硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯的制備按照實施例15相同的方法，可以得到化合物I-16Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.25)＝0.15；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.87(s，3H，OCH3)，3.88(s，3H，OCH3)，4.35(m，1H，H-9′a)，4.50(m，1H，H-8′)，4.57(m，2H，H-3，H-9′b)，4.96(d，J＝6.8Hz，1H，H-7′)，5.01(d，J＝12.0Hz，1H，H-2)，6.01(s，1H，H-6)，6.13(s，1H，H-8)，7.59(d，J＝8.8Hz，2H，2，6)，6.93-8.16(m，5H，Ar-H)，8.33(d，J＝8.8Hz，2H，3，5)，11.20(s，1H，5-OH)；ESI-MS660[M-1]+。
實施例17化合物I-17(對氨基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)的制備 0.5克I-2溶解于10毫升乙酸乙酯中，加入50毫克10％鈀碳，用氫氣置換空氣后，于室溫攪拌5小時，過濾，濾液濃縮，經(jīng)柱層析分離得到淺黃色粉末0.3克，收率63％。
化合物I-17Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶甲酸＝20∶1∶1∶05∶0.25)＝0.25；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.73(s，3H，OCH3)，4.12(m，1H，H-9′a)，4.41(m，2H，H-3，8′)，4.56(m，1H，H-9′b)，5.02(d，J＝10.8Hz，1H，H-2)，5.04(d，J＝7.6Hz，1H，H-7′)，5.92(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.94(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.63(d，J＝8.4Hz，2H，H-3，5)，6.82-7.29(m，6H，Ar-H)，7.74(d，J＝8.4Hz H-2，6)，11.53(s，1H，5-OH)；ESI-MS600[M-1]+。
實施例18根據(jù)實施例17相同的方法可以用I-14作起始物制備化合物I-18(3-氨基-5-硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯)的制備 Rf(氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶甲酸＝20∶1∶1∶0.5∶0.25)＝0.17；1H NMR(400MHz，氘代氯仿)δ3.73(s，3H，OCH3)，4.25(m，1H，H-9′a)，4.50(m，2H，H-3，8′)，4.56(m，1H，H-9′b)，5.01(d，J＝10.8Hz，1H，H-2)，5.03(d，J＝7.6Hz，1H，H-7′)，5.92(d，J＝2.0Hz，1H，H-6)，5.94(d，J＝2.0Hz，1H，H-8)，6.82-8.25(m，9H，Ar-H)，11.60(s，1H，5-OH)；ESI-MS645[M-1]+。
式(I)化合物具有多種重要的生物活性，本發(fā)明通過試驗發(fā)現(xiàn)該類化合物具有抑制人體乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)以及降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)的活性，從而可以預期作為治療病毒性乙型肝炎及相關(guān)病毒性疾病的藥物。此外，本發(fā)明將該系列化合物對過氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細胞損傷體外模型進行了肝細胞損傷保護活性篩選。該類化合物被發(fā)現(xiàn)具有保護肝細胞和促進肝細胞修復的作用。其次，對大鼠急性四氯化碳肝損傷動物體內(nèi)肝損傷模型進行了保護肝損傷活性測試。發(fā)現(xiàn)該類化合物有體內(nèi)保護動物肝損傷的作用。本發(fā)明又對該類化合物抗氧自由基活性進行了測試，發(fā)現(xiàn)其具有體外清除超氧陰離子自由基、清除二苯基苦基苯肼自由基、抑制自由基誘導之脂過氧化物生成的活性。以上活性表明該類化合物可以預期用于制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病以及由氧自由基引起或與氧自由基有關(guān)的其他生理改變或疾病的藥物。該類化合物還表現(xiàn)出很強的對抗自由基引起的PC12細胞損傷作用，即對模擬腦神經(jīng)細胞的PC12細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在同一濃度下，其清除自由基保護細胞的能力比陽性對照槲皮素還高。說明其對保護腦神經(jīng)抗氧化、防治老年性癡呆癥有積極作用。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結(jié)合，制備得到具有抑制乙肝病毒表面抗原和乙肝病毒e抗原以及抑制乙肝病毒脫氧核糖核酸復制活性，從而可以用于預防以及治療乙型病毒性肝炎的藥物組合物或者保健品。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的治療乙型病毒性肝炎藥物如阿昔絡韋、拉米呋啶、干擾素、等聯(lián)合使用，制備得到具有治療乙型病毒性肝炎的藥物或者保健品。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與藥學上常用的輻料或載體結(jié)合，制備得到具有保護肝細胞急性和慢性損傷活性從而可以用于預防以及治療肝臟疾病的藥物組合物或者保健品。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物還可以與現(xiàn)已上市的肝臟保護及肝病治療藥物藥物如聯(lián)苯雙酯、水飛薊素、水飛薊賓葡甲胺、齊墩果酸、二氯乙酸二異丙胺、原卟啉鈉(protoporphyrin disodium)、馬洛替酯(malotilate)、熊去氧膽酸等聯(lián)合使用，制備得到具有保護肝臟活性的組合物，可用于治療急慢性病毒性肝炎、慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝及中毒性肝損傷疾病藥品或者保健品。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
本發(fā)明的式(I)化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可以與現(xiàn)已上市的抗自由基氧化劑藥物如超氧化物歧化酶(SOD)等聯(lián)合使用，制備得到具有防御自由基引起的損害活性的抗氧化藥物組合物或者保健品，用于治療上述疾病。上述各類藥物組合物或者保健品可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。
為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用藥理實施例的形式化合物對乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的抑制活性、對乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的抑制試驗、對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBVDNA)的抑制試驗、對過氧化氫致大鼠乳鼠原代肝細胞損傷體外模型的肝細胞損傷保護活性對大鼠急性四氯化碳肝損傷(動物體內(nèi)肝損傷模型)保護活性、對大鼠慢性四氯化碳肝損傷保護活性、體外清除超氧化自由基的活性的藥理實驗結(jié)果，說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。藥理實施例給出了代表性化合物的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說明，本發(fā)明的藥理實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
藥理實施例1化合物I-12對乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的抑制活性1、材料與方法1.1儀器與試劑PE7700自動熒光PCR儀，美國Perkin Elmer公司生產(chǎn)；HBV-DNA熒光定量檢測試劑盒由中山醫(yī)科大學達安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購自Gibco公司。
1.2體外細胞模型轉(zhuǎn)染乙肝病毒的2.2.15細胞株(HepG 2.2.15)由浙江大學中藥與天然藥物研究室培養(yǎng)提供，將HepG 2.2.15細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，380ug/mL G418)，置5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1.3藥物作用HepG2.2.15細胞用0.06％胰蛋白酶消化液消化，稀釋成8×104/mL懸液，每孔200uL，兩天后換含藥培養(yǎng)液，藥物濃度分別為100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，每個濃度設(shè)6個平行孔，每三天換含藥培養(yǎng)基一次，吸取換出的培養(yǎng)上清于-20℃凍存待檢。以同樣條件下不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照，以拉米呋啶作為陽性對照，測試時吸上清液用酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，得到結(jié)果如表所示。余下細胞用MTT法測定藥物細胞毒性。試驗另設(shè)培養(yǎng)液空白對照組四孔。
2、MTT法檢測樣品對細胞的毒性化合物A對細胞的細胞毒活性細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％的胎牛血清，800,000U/mL青霉素和1mg/mL的鏈霉素。細胞在37℃，含5％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞存活率的測定用改良MTT法，在孵育結(jié)束時每孔加入20μL MTT[溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑](5mg/mL，用磷酸緩沖液PBS配制)，在37℃條件下繼續(xù)孵育4小時，然后每孔加入100μL終止液(10％十二烷基硫酸鈉SDS，用1∶1的異丁醇和2M鹽酸配制)以裂解細胞和溶解甲臢(formazan)結(jié)晶。微孔反應板在黑暗潮濕的條件下放置過夜。所形成的甲臢用酶標儀在570nm波長下比色，細胞存活率由樣品相對于對照的比值計算。
3、ELISA法(標準HBsAg診斷試劑盒)檢測樣品對HBsAg的抑制作用標準試劑盒檢測方法加入藥物孵育5，7，14天后的細胞培養(yǎng)上清液，吸出少許，用ELISA法測定，在450nm檢測OD值。測定HBsAg，結(jié)果以P/N值表示。以同樣條件用不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照。將6個平行孔的P/N比取平均值后，計算抑制率。
抑制率＝(對照孔P/N值-實驗孔P/N值)÷(對照孔P/N值-2.1)4、陽性藥物對照拉米呋啶(3-TC)。
5、檢測結(jié)果藥理實施例1中測試化合物I-12對HBsAg抑制率的試驗結(jié)果見表二。
表二.化合物I-12對HepG2.2.15分泌的乙肝表面抗原的百分抑制率以及第12天對細胞生長的抑制率

試驗結(jié)果說明目前最具價值的判斷乙型肝炎病毒感染的標志有乙型表面抗原與抗體(HBsAg與抗-HBs)、乙型肝炎e抗原與抗體(HBeAg與抗-HBe)、乙型肝炎核心抗原與抗體(HbcAg與抗HBc)等。其中HBsAg是判斷HBV感染的重要標志，抑制HBsAg并使HBsAg轉(zhuǎn)陰反應是治療乙型肝炎中的直接目的之一。化合物I-12第四天、第八天和第十二天化合物A在不同濃度時對乙肝表面抗原HBsAg均顯示出一定的抑制活性，且比陽性對照藥品拉米呋啶對乙肝表面抗原的抑制活性強。
結(jié)論化合物I-12屬于高活性的乙肝表面抗原HBsAg抑制劑。該類水飛薊賓單酯類衍生物(化合物I-12為例)屬于強效的HBsAg抑制劑。
藥理實施例2.化合物I-12對乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的抑制試驗材料與方法按照藥理實施例1中描述的方法，我們用ELISA法(標準HBeAg診斷試劑盒)檢測了樣品對HBeAg的抑制作用。以化合物I-12為例說明。標準試劑盒檢測方法加入藥物孵育5，7，14天后的細胞培奍上清液，吸出少許，用ELISA法測定，在450nm檢測OD值。測定HBeAg，結(jié)果以P/N值表示。以同樣條件用不含樣品的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞作為對照。將6個平行孔的P/N比取平均值后，計算抑制率。陽性藥物對照拉米呋啶(3-TC)。
抑制率＝(對照孔P/N值-實驗孔P/N值)÷(對照孔P/N值-2.1)檢測結(jié)果藥理實施例2中測試對HBeAg抑制率的試驗結(jié)果見表三。
表三.化合物I-12對HepG2.2.15分泌的乙肝e抗原的百分抑制率以及第12天對細胞生長的抑制率

試驗結(jié)果說明乙型肝炎e抗原與抗體(HBeAg與抗-HBe)是判斷乙型肝炎病毒感染重要標志，抑制HBeAg并使HBeAg轉(zhuǎn)陰反應是治療乙型肝炎中的直接目的之一。第四天、第八天和第十二天化合物I-12在高濃度時對乙肝e抗原HBeAg均顯示出較強的抑制活性，且比陽性對照藥品拉米呋啶對乙肝e抗原的抑制活性強許多倍。
結(jié)論化合物B屬于有較高活性的乙肝e抗原HBeAg抑制劑。該類水飛薊賓單酯類衍生物(化合物I-12為例)屬于強效的HBeAg抑制劑。
藥理實施例3.化合物I-12對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制試驗1.儀器與試劑PE7700自動熒光PCR儀，美國Perkin Elmer公司生產(chǎn)；HBV-DNA熒光定量檢測試劑盒由中山醫(yī)科大學達安基因診斷中心提供，胎牛血清、DMEM、G418、胰蛋白酶均購自Gibco公司。
2.體外細胞模型HepG 2.2.15細胞株由由浙江大學中藥與天然藥物研究室培養(yǎng)提供，將HepG2.2.15細胞接種于DMEM培養(yǎng)液(含10％胎牛血清，380ug/mLG418)，置5％CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3.藥物作用HepG 2.2.15細胞用胰蛋白酶消化液消化，稀釋成8×104/mL懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔200uL，24小時后，換含藥培養(yǎng)液，I-12藥物濃度分別為0.5mg/mL，0.05mg/mL，0.005mg/mL，每個濃度設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，留取培養(yǎng)上清于-20℃凍存待檢。以同樣條件下不含藥物的培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞作為對照，以拉米呋啶作為陽性對照，用同樣的方法測定其對HBV的抑制作用。
4.HBV-DNA定量采用常規(guī)堿裂解法從培養(yǎng)上清中提取HBV-DNA。按試劑說明書操作，50uL反應體積中含30uL反應緩沖液，5uL MgCl2，5uL引物和探針，7uL樣品處理上清液和3uL Taq酶。各反應管放入PCR儀中，按下列條件擴增92℃2分鐘預變性，然后按93℃45秒-55℃120秒，共40個循環(huán)。反應結(jié)束后，由電腦自動分析計算出結(jié)果。
5.試驗結(jié)果化合物I-12對乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的抑制試驗結(jié)果如表四所示表四.化合物I-12對HepG2.2.15脫氧核糖核酸(HBV-DNA)的百分抑制率以及第12天對細胞生長的抑制率

試驗結(jié)果說明第四天、第八天和第十二天化合物I-12對HBV-DNA均顯示出一定的抑制活性，但是比陽性對照藥品拉米呋啶對HBV-DNA的抑制活性要弱，屬于有一定活性的HBV-DNA抑制劑。
藥理實施例4化合物I-1對大鼠急性四氯化碳肝損傷(動物體內(nèi)肝損傷模型)保護活性的試驗1、四氯化碳進入體內(nèi)后，在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)細胞色素P-450依賴性混合功能氧化酶的代謝，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基。這些自由基可與細胞內(nèi)和細胞膜的大分子共價結(jié)合，使酶功能喪失，細胞膜脂質(zhì)過氧化，胞漿Ca2+濃度升高，導致肝細胞損傷，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶滲入血液。
2、ICR鼠，全雄，48只。(購自浙江省藥品檢定所)。分為正常組、模型組、陽性組、試藥(L)組、試藥(M)組、試藥(H)組，每組8只。各組動物給藥情況如下(1)正常組生理鹽水(NS)；(2)模型組NS；(3)陽性組聯(lián)苯雙酯100mg/kg；(4)試藥I-1(L)組50mg/kg；(5)試藥I-1(M)組100mg/kg；(6)試藥I-1(H)組200mg/kg；各組藥物均用NS溶解。分組后灌胃給藥(10ml/kg)，每天給藥一次，連續(xù)7天。末次給藥后1小時，除正常組外，均參加造模。用橄欖油配成1％的CCl4溶液，用前反復振蕩混勻。腹腔注射1％的CCl4溶液(10ml/kg)致毒。注射毒物后禁食過夜。末次給藥24小時后，摘眼球取血，分離血清，測AST和ALT。取一小塊肝組織，立即放入福爾馬林溶液中固定，用于制作病理切片。
3、血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)的檢測和血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)的檢測結(jié)果見表五。
表五.化合物I-1對急性肝損傷小鼠血清AST/GOT和ALT/GPT的影響

血清AST和ALT檢測結(jié)果表明試藥I-1和陽性藥聯(lián)苯雙酯在試驗劑量下能明顯降低肝損傷小鼠血清AST/GOT和ALT/GPT水平；其中I-1(H)組能顯著降低肝損傷小鼠血清AST/GOT水平和ALT/GPT水平；說明該類水飛薊酯類化合物具有保護肝臟損傷的作用。
4、組織病理學檢測(一)、病理切片制作方法取材每只動物取同一葉肝臟部位大致相同的一小塊肝組織(含包膜)，大小0.5cm×0.5cm×0.2cm，縱切或橫切，按照標準病理學切片程序進行固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、清洗、水化、HE染色、分化、返藍、脫水與透明、封片，編號后進行觀察。1、肉眼觀察模型組小鼠體積和色澤無明顯改變。2、顯微鏡下觀察模型組小鼠肝小葉中央?yún)^(qū)細胞變性壞死，數(shù)個肝細胞壞死灶融合呈板狀。試藥組和陽性組小鼠肝細胞損傷均有明顯改善。結(jié)論病理組織學檢測表明，試藥和陽性藥能不同程度改善四氯化碳導致的小鼠肝細胞損傷。
試驗結(jié)果說明該類水飛薊酯類化合物具有保護肝臟損傷的作用，并能改善四氯化碳導致的小鼠肝細胞損傷。
氧壓是由機體細胞產(chǎn)生和清除自由基之間的失調(diào)所引起的，可誘發(fā)多種疾病。氧壓可引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如中風，帕金森氏病，阿爾茨海默病。另外它還跟其它疾病的病理途徑有關(guān)，如心臟病、自身免疫性疾病、腫瘤、病毒性疾病(如AIDS、肝炎)。因此尋找新的抗氧化劑成為治療由氧壓引起的各種疾病的有效途徑。本發(fā)明用體外清除陰離子超氧化自由基的活性試驗；體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性試驗；測定化合物對雙氧水H2O2所致PC12(大鼠腎上嗜鉻細胞瘤)細胞損傷的保護作用；化合物抑制自由基誘導之脂過氧化物生成等試驗說明本發(fā)明權(quán)利要求中化合物的抗氧化活性。下面分別用藥理實施例予以說明。
藥理實施例5化合物I-1體外清除超氧陰離子自由基的活性試驗化合物I-1清除超氧陰離子自由基能力的檢測乃使用吩嗪-N甲硫酸鹽-NADH(phenazine methosulfate-NADH)系統(tǒng)，用四唑氮藍(nitroblue tetrazolium)還原方法檢定。用3毫升含有78μM的NADH、50μM四唑氮藍和10μM吩嗪-N甲硫酸鹽在pH值為8.0的16mM Tris-HCl緩沖液中產(chǎn)生出超氧陰離子自由基，對不同濃度的化合物I-1檢測其活性。超氧陰離子自由基和四唑氮藍反應生成物的顏色用分光光度計在560nm波長下監(jiān)測，槲皮素被用作陽性對照藥物。試驗結(jié)果見表六。
表六

試驗結(jié)果表明，化合物I-1具有一定的超氧陰離子自由基清除作用，但是在同一濃度下，其清除能力沒有槲皮素高。結(jié)論該類水飛薊素單酯類化合物屬于具有一定清除超氧陰離子自由基的抗氧化物質(zhì)。
藥理實施例6化合物I-18體外清除二苯基苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)的活性試驗
DPPH的甲醇溶液在517nm有強吸收值，其被抗氧化物還原時，吸收值下降，吸光度越低，其抗氧化作用越強。在250μL反應體系中含有各種不同濃度的化合物I-1825μL，DPPH(0.4mg·mL-1)的甲醇溶液40μL及甲醇溶液185μL，37℃水浴反應30分鐘后，在517nm處測定吸光度。DPPH的甲醇液和槲皮素分別作為陰性、陽性對照，結(jié)果見表七。
表七

試驗結(jié)果表明，化合物I-18具有一定的DPPH自由基清除作用，但是在同一濃度下，其清除能力沒有槲皮素高。結(jié)論該類水飛薊素單酯類化合物屬于具有一定清除DPPH自由基的抗氧化物質(zhì)。
藥理實施例7化合物I-6對雙氧水H2O2所致PC12細胞損傷的保護作用活性試驗H2O2是一種主要的活性自由基的前體，它可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞的凋亡，PC12細胞(大鼠腎上嗜鉻細胞瘤)可模擬腦神經(jīng)細胞，因此常用它來作為研究藥物與神經(jīng)細胞之間關(guān)系的模型，用MTT測細胞的存活率，如果待測化合物有清除由H2O2引起的自由基，保護神經(jīng)細胞的作用，OD值高，細胞存活率就高，反之就低。對唐希燦所報道的方法(Xiaoqiu Xiao等，Neurosci Letter，1999，27573-76.)加以改進測定化合物的保護作用。PC12細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素。細胞以每孔6000個的密度加到96孔板中，在37℃，50％CO2潮濕空氣的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36小時。細胞存活率用倒置顯微鏡觀觀察和改良的MTT法。細胞經(jīng)36小時的孵育后，分別加新配的化合物I-6的二甲亞砜溶液以濃度梯度加入到各孔中。作用2小時后加入新配的H2O2(終濃度為500μmol/L)作用3小時，顯微鏡觀察記錄，棄去原培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液100μL，然后加入MTT10μL，3小時后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150μLDMSO溶解甲臜，于570nm處讀數(shù)。用槲皮素作陽性對照，結(jié)果見表八表八 化合物I-6及陽性對照槲皮素對雙氧水損傷PC12細胞保護率


試驗結(jié)果表明，化合物I-6具有很強的對抗自由基引起的PC12細胞損傷作用，即對模擬腦神經(jīng)細胞的PC12細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在同一濃度下，其清除自由基保護細胞的能力比陽性對照槲皮素還高。結(jié)論該類水飛薊素單酯類化合物屬于具有強效保護模擬腦神經(jīng)細胞的PC12細胞作用的抗氧化物質(zhì)。
測定化合物對H2O2所致PC12細胞損傷的保護作用可作為初步探討其保護中樞腦神經(jīng)細胞的作用機理。故該類化合物表現(xiàn)出對雙氧水損傷所致PC12細胞的保護作用，說明其對老年性癡呆證的治療有積極作用。
藥理實施例8化合物I-2抑制自由基誘導之脂過氧化物生成的活性試驗1.實驗原理脂質(zhì)過氧化是自由基作用于多不飽和脂肪酸的產(chǎn)物，含量與自由基的生成正相關(guān)，由于機體有抗氧化的酶系及非酶系的保護作用，使自由基不斷產(chǎn)生又不斷被清除。隨著年齡的增長，體內(nèi)的抗氧化劑不斷下降，清除自由基的能力逐漸減弱，脂質(zhì)過氧化作用則增強，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多。因此，測定樣品抗脂質(zhì)過氧化作用，是篩選抗氧化，抗衰老藥物的重要指標之一。
2化合物I-2抑制自由基誘導之脂過氧化物生成乃通過鼠肝微粒體檢測。(1)肝微粒體的制備實驗大鼠斷頭處死，迅速取出肝贓，用超速離心法制備肝微粒體。(2)樣品對鼠肝脂質(zhì)過氧化的抑制作用在含F(xiàn)eSO4(4μmol/L)與Vc(50μmol/L)的1mL緩沖液中加入200μg/mL微粒體中，以誘導產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，同時加入不同濃度的I-2樣品，37℃孵育30分鐘后加入1mL三氯醋酸(20％)中止反應加入15mL硫代巴比妥酸(0.76％)，100℃沸水浴20分鐘，離心去除蛋白沉淀，在532nm波長下測定上清吸光度。脂質(zhì)過氧以反應中生成的丙二醛表示，實驗以槲皮素作為陽性對照。試驗結(jié)果見表九。
表九.樣品對大鼠肝微粒體脂質(zhì)過氧化的抑制作用

試驗結(jié)果表明，化合物I-2具有很強的抑制自由基誘導之脂過氧化物生成能力，即對細胞有抗氧化損傷保護作用。而且在同一濃度下，其對細胞抗氧化損傷能力比陽性對照槲皮素還高。結(jié)論該類水飛薊素單酯類化合物屬于具有強效保護細胞抗氧化物質(zhì)。提示其具有保肝護肝以及預期用于制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病的作用。
藥理實施例9化合物I-18對SD新生大鼠原代細胞雙氧水損傷模型的保護作用試驗無菌取出SD大鼠新生乳鼠(5日齡內(nèi))肝臟，剪碎，用0.25％的胰蛋白酶消化，制成肝細胞懸液。將肝細胞懸液收集在錐形瓶中，用200目雙層尼龍過濾，再用清洗液清洗，離心3次，以培養(yǎng)液重懸，即可得到大部分為肝實質(zhì)細胞的懸液。
用1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10％小牛血清，105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素10mg/L胰島素)稀釋純化的肝細胞懸液，每毫升含1.0×106個肝細胞。將上述肝細胞懸液加入96孔(每孔0.1ml)培養(yǎng)板中，置5％CO2培養(yǎng)箱中，在37℃下培養(yǎng)12h后，吸棄上清，加入0.6mmol/L的H2O2。作用1h后，分別加入高、中、低3種不同濃度的I-18樣品試驗藥液，每一濃度至少設(shè)3個復孔，同時設(shè)溶劑和陽性對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，吸棄上清，收集肝細胞樣品，570nm波長下用酶標儀計算保護率和增生指數(shù)，結(jié)果見表十表十. SD新生大鼠原代肝細胞雙氧水損傷模型的保護作用

試驗結(jié)果表明化合物I-18具有較強的保護SD新生大鼠原代肝細胞免受雙氧水損傷模型的能力，即對SD新生大鼠原代肝細胞有抗氧化損傷保護作用。但在同一濃度下，其對細胞抗氧化損傷能力比陽性對照槲皮素略低。結(jié)論該類水飛薊素單酯類化合物屬于具有有效保護細胞抗氧化物質(zhì)。提示其具有保肝護肝以及預期用于制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病的作用。
權(quán)利要求
1.一種式(I)所示的水飛薊賓酯類衍生物及其可藥用鹽或其溶劑化物 式(I)其中n＝0、1；R1、R2、R3為氫、烷氧基、鹵素、硝基、腈基、氨基、酰胺基，R4，R6為氫、烷氧基等、R5為氫，烷基，R7為氫或烷氧基，其中烷基或者烷氧基的碳原子數(shù)是1-8個碳原子，可以是直鏈或支鏈烷基或烷氧基，式(I)中2，3位，7′，8′的立體構(gòu)型分別是或同時是R構(gòu)型或S構(gòu)型。
2.具有式(I)所示的水飛薊賓酯類化合物極其可藥用鹽或其溶劑化物，它們是化合物I-1對甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-2對硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-3苯甲酸3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-4間氯苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-53，4-二甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-63，4，5-三甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-7胡椒酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-8對氟苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-9對腈基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-10對甲基肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]甲基酯；化合物I-11對氯肉桂酸[3-(4-羥基3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-12對溴肉桂酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-13對乙酰氨基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-143，5-二硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-15對甲氧基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-16對硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-8-甲氧基-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-17對氨基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯；化合物I-183-氨基-5-硝基苯甲酸[3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-6-(2，3-二氫-3，5，7-三羥基-4-氧代-苯并吡喃-2-)-2，3-二氫-1，4-苯并二氧六環(huán)-2-]-甲基酯。
3.權(quán)利要求1中式(I)化合物的制備方法，包括將式I-a和式I-b經(jīng)過酯化得到式(I)化合物 R1，R2，R3，R7定義與式(I)相同，其中偶氮二甲酸二酯為二甲酯，二乙酯，丙酯，異丙酯或丁酯，溶劑為四氫呋喃，二甲亞砜，二甲基甲酰胺，反應溫度為室溫至回流，水飛薊賓∶苯甲酸∶偶氮二甲酸二酯∶三苯基磷＝1∶1～3∶1～3∶1～3，反應時間0.5～20小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～2所述之水飛薊賓單酯類化合物I用于制備抑制人體乙肝病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)以及降低乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)、治療病毒性乙型肝炎及相關(guān)病毒性疾病的藥物的用途；制備預防或治療急性慢性肝損傷類疾病、保肝護肝類藥物的用途；以及該類化合物用于制備防治由超氧化自由基引起或相關(guān)的其他生理改變或疾病保護腦神經(jīng)包括抗氧化、防治老年性癡呆癥以及炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤、心肌缺血、心肌肥厚、衰老、變態(tài)反應、動脈粥樣硬化等疾病藥物的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途所制備得到的保肝護肝藥、防治病毒性乙型肝炎、防治老年性癡呆藥物、治療心血管及腦血管病變藥物、抗衰老藥物、和/或抗腫瘤藥物或藥物組合物。
6.一種用于制備清除超氧化自由基、抑制乙型肝炎病毒、保護肝細胞損傷及急慢性肝損傷的藥物組合物，其含有作為活性成分的治療有效量的權(quán)利要求1～2所述之化合物I或它們的化合物或其可藥用鹽或溶劑化物或者它們的混合物和可藥用輔料。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其是護肝藥、防治病毒性乙型肝炎、防治老年性癡呆藥物、治療心血管及腦血管病變藥物、抗衰老藥物和/或抗腫瘤藥物藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其可以是片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、口服液或軟膏劑，還可以采用現(xiàn)代制藥界所公知的控釋或緩釋劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有防治病毒性乙型肝炎、抗自由基氧化、保肝護肝、防治老年性癡呆癥、抗衰老、抗腫瘤活性的水飛薊賓單酯類衍生物及其可藥用鹽或溶劑化物。本發(fā)明還涉及制備式(I)化合物的制備方法及其藥物組合物和醫(yī)藥用途。本發(fā)明的化合物具有抑制乙肝病毒的活性，從而可以預期作為治療病毒性乙型肝炎及相關(guān)病毒性疾病的藥物。本發(fā)明的化合物具有保護肝細胞的作用，可以預期作為防止肝臟損傷類藥物用途；本發(fā)明的化合物具有體外抗自由基的作用，因此可以預期成為治療由自由基引起的各種疾病之藥物。
文檔編號A61P39/00GK1990484SQ200510132509
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月26日
發(fā)明者趙昱, 龔景旭, 伍義行, 白驊 申請人:浙江海正天華新藥研發(fā)有限公司